Участие некоторых апоптотических механизмов в радахлорин-инициированном фотогемолизе Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

видно, что абсолютные величины лагЧ по АПК не зависят от концентрации эритроцитов. Ингибирующее действие фуллеренола также не изменялось при повышении количества эритроцитов в инкубационной смеси. Из получен-

ных результатов можно сделать вывод о том, что фуллере-нол в системе «сыворотка крови - эритроцит» проявляет свое защитное действие от активированного комплемента не на мембране эритроцитов, а в жидкой фазе.

© Коллектив авторов, 2012 г.

УДК 612.014:577.7

И. Л. Соловцова, Е. А. Воробьев, И. А. Курпас, М. А. Соловьева

УЧАСТИЕ НЕКОТОРЫХ АПОП-ТОТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В РАДАХЛОРИН-ИНИЦИИРО-ВАННОМ ФОТОГЕМОЛИЗЕ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени

академика И. П. Павлова

ВВЕДЕНИЕ

Фотодинамическое воздействие на эритроцит исходно связывают с генерацией синглетного кислорода, который в силу высокой химической активности участвует в цепных свободно-радикальных реакциях, окисляя аминокислоты в белках, вызывая перекисное окисление липи-дов и т. д. Установлено, что мембранные эффекты при фотодинамическом воздействии более выражены, чем цитозольные.

Несмотря на отсутствие у эритроцитов ядра и митохондрий, существует мнение, что при окислительном стрессе гибель клеток происходит с участием механизмов типичных для апоптоза, а именно - происходит сжатие клеток, «вспучивание» мембраны, нарушение фос-фатидилсериновой ассиметрии мембран. Апоптотичес-кое уменьшение обьема эритроцитов является следствием повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, последующей активацией Са2+- зависимых калиевых каналов, приводящей к выходу из клеток катионов калия и анионов хлора совместно с водой.

Целью данной работы являлось оценить роль апопто-тических механизмов в фотоиндуцированном гемолизе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовалась плазма крови здоровых доноров в возрасте 18-25 лет. Забор крови производился из локтевой вены в изотонический раствор цитрата натрия. Цитратную кровь центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об./мин, плазму отделяли декантацией.

Осажденные эритроциты выдерживали в реактиве Олс-вера при 4 оС в течение суток с целью их стабилизации.

Перед экспериментом эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором, готовили стандартную

взвесь, оптическая плотность (при 800 нм) которой после разведения в 8 раз равнялась 0,560±0,020. Эта величина находится в диапазоне линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов и соответствует 12,0±0,4 млн клеток/мл.

В работе использовался фотосенсибилизатор радах-лорин (РХ) производства фирмы ООО «РАДА-ФАРМА».

Регистрацию фотолизиса сенсибилизированных РХ эритроцитов проводили следующим образом. Стандартную взвесь эритроцитов, объемом 0,1 мл, доводили до объема 0,8 мл буферным раствором, содержащим РХ. Инкубационную смесь подвергали негемолизирующему облучению красным светодиодом с длиной волны 658 нм (мощность на выходе -12 мВт). Динамику лизиса эритроцитов регистрировали с помощью спектрофотометра при 800 нм с автоматической пятисекундной регистрацией светорассеяния в прямом потоке. Показателем скорости гемолиза являлась величина 1/Т50, где Т50 - время, необходимое для лизиса половины эритроцитов в инкубационной смеси. Для изучения влияния на фотогемолиз различных факторов в стандартную взвесь эритроцитов добавляли следующие препараты: избирательный хе-латор ионов кальция ЭГТА (Sigma) (10 мМ), 10 %-й раствор CaCl2, малоспецифический блокатор Ca2+- каналов L-типа Дилтиазем («Ланнахер», Австрия) в сублитической концентрации 0,625 мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Этап облучения взвеси эритроцитов в присутствии РХ, предшествующий гемолизу, как было подтверждено микроскопическими исследованиями, всегда приводил к изменению морфоформы клеток и превращению их в эхиноциты. Время, необходимое для этих изменений, зависило от дозы облучения и было индивидуально для эритроцитов разных доноров. Далее происходила агломерация клеток, вследствие чего оптическая плотность инкубационной смеси повышалась на0,05-0,08 единицы.

Подобные превращения эритроцитов, по литературным данным, происходят под действием кальциевых ионо-форов, при помещении клеток в гипертоническую среду, после двухсуточного глюкозного голодания. Однако во всех перечисленных случаях это требовало гораздо большего времени, чем под воздействием светового луча в присутствии фотосенсибилизатора. Очевидно, сказывалась огромная реакционная способность образующихся активных форм кислорода и высокая скорость свобод-норадикальных процессов. Особенно чувствительна к по-

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • №2 • 2012

|||

Рис. 1. Влияние Са2+ на относительные значения 1/Т50 РХ-ини-циированного фотогемолиза (658 нм, 1,2 Дж/см2, 6,25 мкг/мл

РХ). Концентрация Са2+ в инкубационной среде превышает физиологическую: 1 - 2 раза; 2 - 5 раз; 3 - 10 раз; 4 - 50 раз;

5 - 100 раз

ражению свободными радикалами Са2+-АТФ-аза, при этом происходит окисление БИ-групп, входящих в активной центр фермента и изменение конформации белка при контакте с мембранными липидами, подвергшимися пе-рекисному окислению. Поврежденная АТФ-аза не только перестает откачивать ионы кальция, но и превращается в канал для Са2+, позволяя ему входить в цитоплазму. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+, последующая активация Са2+-зависимых калиевых каналов, выход К+, С1- и воды приводит к апоптотическому уменьшению объема клетки, превращению их в эхиноциты, что делает лизис клетки неизбежным.

По нашим данным добавление в инкубационную среду ЭГТА (10 мМ), не оказывало существенного влияния на скорость индуцированного гемолиза. Однако предварительной инкубации эритроцитарной взвеси с раствором ЭГТА в течение 30 минут уже было достаточно для существенного замедления процесса (на 40-60 %). Это указывает на важность примембранной концентрации Са2+ в изменении деформационных характеристик мембраны и последующего гемолиза.

Рис. 2. Влияние дилтиазема на относительные значения 1/Т50

РХ-инициированного фотогемолиза (658 нм, 1,2 Дж/см2, 6,25 мкг/мл РХ) в зависимости от времени предварительной инкубации эритроцитов с препаратом. Время инкубации: 1 - 0 мин; 2 - 60 мин; 3 - 90 мин; 4 - 120 мин

Ионы кальция при концентрациях в 100, 50, 10, 5 и 2 раза превышающих физиологическую норму ускоряли гемолиз на87, 85, 27, 16и 3 % соответственно (рис. 1). Предварительная инкубация (0,5-1,5 часа) эритроцитов в среде с концентрацией Са2+, в 10 и 5 раз превышающей физиологическую, также приводила к ускорению гемолиза, но степень ускорения была достоверно ниже, чем без инкубации. Степень ускорения фотогемолиза зависела от концентрации Са2+, но не зависела от времени инкубации. Ингибитор кальциевых каналов дилтиазем оказывал инги-бирующее действие на фотогемолиз, но лишь после инкубации с ним в течение часа (рис. 2).

ВЫВОДЫ

Факторы, вовлеченные в механизмы эриптоза, а именно - Са2+ и кальциевые каналы, оказывают существенное влияние на фотоиндуцированный лизис эритроцитов. Ингибирование гемолиза под действием ЭГТА и ингибитора кальциевых каналов, а также его ускорение при повышении концентрации Са2+ свидетельствуют о потенцировании эриптозом процесса фотогемолиза.

© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 611.018.54:546.131

В. П. Фаенкова, И. Л. Соловцова, Е. А. Воробьев, А. Д. Денисенко, Л. В. Галебская

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА РАДАХЛОРИНА ПЛАЗМОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Препарат радахлорин (ООО «РАДАФАРМА») является мощным фотосенсибилизатором и находит все большее применение в фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и других патологических состояний человека. Преобладающим компонентом препарата является растительный тетрапиррол хлорин е.

Для проведения процедуры ФДТ препарат вводят в кровь, после чего он разносится по всему организму и поглощается различными тканями. От взаимодействий фотосенсибилизатора с компонентами крови зависит его распределение в организме и, следовательно, эффективность ФДТ. Целью настоящей работы явилось выявление транспортных форм препарата среди белков плазмы крови человека.