CC BY
27
УДК 57.085.23
УЧАСТИЕ ГЛУТАТИОНА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В РЕАЛИЗАЦИИ АПОПТОЗА КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ИНДУЦИРОВАННОМ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
Евгения Викторовна ШАХРИСТОВА1, Елена Алексеевна СТЕПОВАЯ1, Наталья Владимировна РЯЗАНЦЕВА2,3, Ольга Леонидовна НОСАРЕВА1, Роман Игоревич ЧИЛЬЧИГАШЕВ1, Вячеслав Викторович НОВИЦКИЙ1
1 Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
2 Сибирский федеральный университет 660041, г. Красноярск, просп. Свободный, 79
3 Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1
Цель исследования - установление роли глутатиона и окислительной модификации белков в реализации апоп-тоза клеток эпителия молочной железы при индуцированном окислительном стрессе. Материал и методы. Объектом исследования выбрана культура клеток эпителия молочной железы человека (HBL-100). Окислительный стресс в клетках индуцировали 0,3 мМ пероксида водорода. Протектор SH-групп белков, 1,4-дитиоэритритол, использовали для модуляции редокс-статуса клеточной линии HBL-100 в условиях активации свободноради-кального окисления. Оценивали содержание внутриклеточных активных форм кислорода, карбонильных производных белков, восстановленного, окисленного глутатиона и интенсивность апоптотической гибели клеток в условиях развития окислительного стресса и культивирования клеток линии HBL-100 в присутствии 1,4-дитио-эритритола. Результаты и их обсуждение. Установлено, что 1,4-дитиоэритритол оказывает протекторное влияние на клеточные белки, препятствуя их необратимому карбонилированию посредством восстановления ре-докс-потенциала глутатиона, и снижает апоптотическую гибель при развитии окислительного стресса в клетках эпителия молочной железы.
Ключевые слова: окислительный стресс, редокс-статус клеток, карбонильные производные белков, клетки эпителия молочной железы, апоптоз.
В основе патогенеза многих заболеваний (сердечно-сосудистые, нейродегенеративные, воспалительные, онкологические и др.), а также процессов адаптации и старения лежит активация свободнорадикального окисления [5]. Развитие окислительного стресса в различных типах клеток обусловлено резкой интенсификацией процессов свободнорадикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной
защиты, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК) [5, 6, 12]. Последние вызывают окислительную модификацию белковых и липидных молекул, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран [2, 15]. АФК способны регулировать различные клеточные функции, а изменения редокс-стату-са клеток при окислительном стрессе оказывают влияние на активность факторов транскрипции и
Шахристова Е.В. - к.м.н., руководитель научно-образовательного центра молекулярной медицины, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики, e-mail: [email protected]
Степовая Е.А. - д.м.н., проф. кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики, e-mail: [email protected]
Рязанцева Н.В. - д.м.н., проф. кафедры биофизики, проф. кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии
Носарева О.Л. - к.м.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической
лабораторной диагностики, e-mail: [email protected]
Чильчигашев Р.И. - студент 5-го курса медико-биологического факультета
Новицкий В.В. - д.м.н., проф., академик РАН, зав. кафедрой патофизиологии
экспрессию ряда генов как при адаптивной реакции клеток в экстремальных условиях, так и при развитии патологических процессов [3, 5, 7, 10]. Моделирование развития свободнорадикальных процессов в эпителиальных клетках молочной железы может быть использовано для установления роли редокс-белков и системы глутатиона в регуляции пролиферации и апоптоза клеток при развитии патологических процессов.
Цель исследования - установить роль глута-тиона и окислительной модификации белков в реализации апоптоза клеток эпителия молочной железы при индуцированном окислительном стрессе с использованием протектора SH-групп 1,4-дитиоэритритола (DTE).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования проводили в культуре клеток эпителия молочной железы человека (HBL-100), полученной из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии Российской академии наук (г. Санкт-Петербург). Клетки линии HBL-100 культивировали адгезионным методом в полной питательной среде, содержащей 90 % RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («Invitrogen», США), 0,3 мг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия) и 100 мкг/мл гентамицина («INS», США). Жизнеспособность клеток оценивали микроскопическим методом с трипановым синим («Serva», США). Окислительный стресс в клетках эпителия молочной железы индуцировали добавлением пе-роксида водорода (Н2О2) в конечной концентрации 0,3 мМ [8]. Для оценки участия глутатиона и окислительной модификации белков в реализации программированной гибели изменяли ре-докс-статус клеток линии HBL-100 посредством инкубации в течение 18 ч при 37 °C и 5 % CO2 в присутствии 1,4-дитиоэритритола («Sigma Aldrich», США), протектора SH-групп протеинов и пептидов в конечной концентрации 5 мМ [11].
Интенсивность окислительной модификации протеинов оценивали по содержанию карбонильных производных белков методом, основанным на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали спектрофотометриче-ски [1]. При длине волны 274 нм регистрировали образование альдегидфенилгидразонов, при 363 нм - кетондинитрофенилгидразонов.
Оценку содержания АФК проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном лазерном цитометре «FaCSCanto II» («Becton
Dickinson», США), клетки предварительно инкубировали с 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетатом в конечной концентрации 5 мкМ («Sigma Aldrich», США) [13]. В основе метода лежит способность 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетата (не флуоресцирующего) проникать в цитоплазму клеток в виде ацетилового эфира, деэстерифицироваться под действием эстераз, что исключает возможность его транспорта из клеток, и приобретать способность флуоресцировать после взаимодействия с пероксидом водорода и его метаболитами.
Концентрацию общего, восстановленного (GSH), окисленного (GSSG) глутатиона и величину отношения восстановленной формы три-пептида к окисленной (GSH/GSSG) определяли методом, предложенным M.E. Anderson, в модификации I. Rahman и соавторов [14]. Принцип метода основан на способности GSH взаимодействовать с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой с образованием тионитрофенольного аниона, имеющего характерный максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается специфически глутатионредуктазой, и восстановленная форма трипептида вновь взаимодействует с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой. Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения GSSG пробы предварительно инкубировали с блокатором SH-групп - 2-ви-нилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает в пробе восстановленный глутатион, и поэтому в данном случае скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию GSSG.
Содержание белка в клетках определяли по взаимодействию красителя Кумасси голубого G-250 с остатками аминокислот лизина и аргинина белковых молекул [9].
Определение количества аннексин- и пропи-дий йодид-положительных клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидия йодида (PI) («eBioscience», Австрия) по протоколу фирмы-производителя. Метод основан на специфическом связывании FITC-меченного аннексина V с фосфатидилсерином и способности пропидия йодида интеркалировать с молекулой ДНК. Количество FITC /PI - и FITC+/PI+-меченных клеток выражали в процентах от общего числа клеток.
Проверка на соответствие выборок нормальному закону распределения проводилась критерием Шапиро-Уилка. В связи с отсутствием согласия данных с нормальным распределением на уровне значимости p < 0,01 и р < 0,05 вы-
числяли средневыборочные характеристики: медиана (Ме), первый и третий квартили Достоверность различий выборок оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Краскала-Уоллиса для малых групп. Различия считались достоверными при достигнутом уровне значимостир < 0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глутатиону принадлежит ведущая роль в защите клеток от свободнорадикального окисления благодаря наличию свободных 8Н-групп и способности выступать коэнзимом для ряда ферментов антиоксидантной защиты, а также участвовать в регуляции функциональной активности редокс-чувствительных белков посредством их глута-тионилирования [4, 6]. Индукция окислительного стресса пероксидом водорода (Н2О2) в клетках эпителия молочной железы линии НБЬ-100 приводила к снижению концентрации восстановленного глутатиона и увеличению содер-
жания окисленной формы трипептида (GSSG) по сравнению с клетками, не подвергавшимися воздействию прооксиданта (табл. 1). Снижение редокс-статуса клеток эпителия молочной железы способствовало увеличению (в 2,9 раза; р < 0,01) внутриклеточной продукции АФК по сравнению с клетками линии НБЬ-100 без воздействия (табл. 2). Наработка АФК, способных повреждать макромолекулы, и сокращение пула GSH приводили к увеличению окислительной модификации протеинов клеток эпителия молочной железы, культивируемых с Н2О2 (повышению концентрации карбонильных производных белков, определяемой при длинах волн 274 нм (в 4,4 раза; р < 0,01) и 363 нм (в 4,1 раза; р < 0,01) по сравнению с уровнем окислительной модификации протеинов в культуре без воздействия, см. табл. 2). Модификация первичной структуры полипептидной цепи с образованием карбонильных производных белков сопровождается нарушением конформации белковой молекулы и потерей функциональных свойств. Смещение окисли-
Таблица 1
Содержание форм глутатиона в клетках эпителия молочной железы линии HBL-100 при действии DTE в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, Ме (Q-Q)
Клетки Общий глутатион, нмоль/мг белка GSH, нмоль/мг белка GSSG, нмоль/мг белка GSH/GSSG, уе.
Клетки линии HBL-100 5,84 (5,39-5,91) 5,39 (4,92-5,42) 0,49 (0,45-0,49) 11,50 (11,06-11,71)
Клетки линии HBL-100 + Н2О2 5,11* (4,36-5,16) 4,46* (3,77-4,50) 0,65* (0,59-0,66) 6,73* (6,38-6,80)
Клетки линии HBL-100 + Н2О2 + DTE 5,29 (5,10-5,37) 4,86# (4,79-5,07) 0,57 (0,56-0,59) 7,92# (7,52-8,01)
Клетки Количество аннексин ^-клеток, % Активные формы кислорода, у. е. Карбонильные производные белков, у.е./мг белка
X = 274 нм X = 363 нм
Клетки линии HBL-100 15,10 (14,80-16,90) 0,53 (0,51-0,53) 1,15 (0,78-1,48) 1,85 (1,48-1,97)
Клетки линии HBL-100 + Н2О2 32,70* (30,80-32,78) 1,52* (1,49-1,56) 5,05* (4,14-5,47) 7,50* (6,70-8,40)
Клетки линии HBL-100 + Н2О2 + DTE 24,60# (23,60-25,90) 1,02# (0,92-1,03) 3,42# (3,38-3,43) 5,77# (5,66-5,85)
Примечание. Здесь и в табл. 2 обозначены статистически значимые (р < 0,01) отличия от величин соответствующих показателей нативных клеток HBL-100 (*) и культивируемых в присутствии Н2О2 (#).
Таблица 2
Содержание аннексин V-положительных клеток, АФК и карбонильных производных белков в клетках эпителия молочной железы линии HBL-100 при действии DTE в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, Ме (Q-QJ
тельно-восстановительного баланса в сторону окислительных процессов и повреждение макромолекул в клетке могут приводить к запуску программированной клеточной гибели. В клетках эпителия молочной железы, культивированных с Н2О2, нами обнаружено увеличение числа апопто-тически измененных клеток (в 2,2 раза; р < 0,01) по сравнению с интактной культурой (см. табл. 2).
Культивирование клеток линии HBL-100 в условиях окислительного стресса в присутствии DTE приводило к снижению (в 1,5 раза; р < 0,01) внутриклеточной продукции АФК (см. табл. 2) и увеличению редокс-потенциала глутатиона, что выражалось в повышении концентрации GSH по сравнению с клетками, инкубированными только с Н2О2 (см. табл. 1). Нами установлено, что при активации свободнорадикального окисления в клетках эпителия молочной железы DTE способен снижать содержание карбонильных производных белков, определяемое при длинах волн 274 и 363 нм (соответственно в 1,5 раза, р < 0,01, и в 1,3 раза, р < 0,01), по сравнению с уровнем окислительной модификации протеинов в культуре в присутствии Н2О2 (см. табл. 2). Таким образом, DTE, защищающий SH-группы белков и пептидов от повреждающего воздействия АФК, оказывает непосредственное протекторное влияние на процессы окислительной модификации протеинов, а также опосредованное через восстановление редокс-статуса клетки и, возможно, активациию процессов глутатионилирования белков.
Оценка количества апоптотически измененных клеток линии HBL-100 при индуцированном окислительном стрессе в условиях их культивирования с DTE показала значимое снижение количества аннексин-положительных клеток (в 1,3 раза; р < 0,01) по сравнению с культурой, содержащейся в присутствии Н2О2 (см. табл. 2). Увеличение концентрации GSH подавляет программированную клеточную гибель, так как восстановленная форма глутатиона регулирует редокс-гомеостаз клетки и функциональную активность многих протеинов, в частности транскрипционных факторов, способствующих выживанию клеток [3, 6, 10].
В результате проведенного исследования установлено, что редокс-статус клетки и окислительная модификация белков играют важную роль в реализации программированной гибели при индуцированном окислительном стрессе, что необходимо учитывать при разработке новых терапевтических подходов для лечения заболеваний, сопровождающихся развитием свободнора-дикального окисления, в частности онкологических, воспалительных сердечно-сосудистых.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского гуманитарного научного фонда в рамках научного проекта № 15-36-01289.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты организма. СПб., 2000. 104 с.
2. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб., 2006. 400 с.
3. Кондакова И.В., Какурина Г.В., Смирнова Л.П., Борунов Е.В. Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами // Сиб. онкол. журн. 2005. (1). 58-61.
4. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона. I. Синтез, транспорт, глутатионтранс-феразы, глутатионпероксидазы // Биомед. химия. 2009. 55. (3). 255-277.
5. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск, 2008. 284 с.
6. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-ре-гуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. 72. (2). 158-174.
7. Степовая Е.А., Петина Г.В., Жаворонок Т.В. и др. Роль тиолдисульфидной системы в механизмах изменений функциональных свойств нейтро-филов при окислительном стрессе // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2010. (8). 161-165.
8. Шахристова Е.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Носарева О.Л. Индукция пероксидом водорода окислительного стресса in vitro в эпителиальных клетках молочной железы для изучения апоптоза опухолевых клеток линии MCF-7 // Сиб. науч. мед. журн. 2015. 35. (2). 5-10.
9. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. 7. (1, 2). 248-254.
10. Brigelius-Flohe R., Flohe L. Basic principles and emerging concepts in the redox control of transcription factors // Antioxid. Redox Signal. 2011. 15. (8). 2335-2381.
11. Brunelli L., Crow J.P., Beckman J.S. The comparative toxicity of nitric oxide and peroxynitrite to Escherichia coli // Arch. Biochem. Biophys. 1995. 316. (1). 327-333.
12. Halliwell B. Biochemistry of oxidative stress // Biochem. Soc. Trans. 2007. (5). 1147-1150.
13. Halliwell B., Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? // Br. J. Pharmacol. 2004. (142). 231-255.
14. Rahman I., Kode A., Biswas S.K. Assay for quantitative determination of glutathione and glu-
tathione disulfide levels using enzymatic recycling method // Nat. Protoc. 2006. 1. (6). 3159-3165.
15. Wong C.M., Bansal G., Marcocci L., Suzuki Y.J. Proposed role of primary protein carbonylation in cell signaling // Redox Rep. 2012. 17 (2). 90-94.
THE ROLE OF GLUTATHIONE AND PROTEIN OXIDATIVE MODIFICATION IN APOPTOSIS OF BREAST EPITHELIAL CELLS UNDER INDUCED OXIDATIVE STRESS
Evgenija Viktorovna SHAKHRISTOVA1, Elena Alekseevna STEPOVAYA1, Natal'ja Vladimirovna RYAZANTSEVA2-3, Ol'ga Leonidovna NOSAREVA1, Roman Igorevich CHIL'CHIGASHEV1, Vyacheslav Viktorovich NOVITSKY1
1 Siberian State Medical University 634050, Tomk, Moscowski Trakt, 2
2 Siberian Federal University 660041, Krasnoyarsk, Svobodnyj av., 79
3 Krasnoyarsk State Medical University n. a. Professor V.F. Voino-Yasenetsky 660022, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 1
The research objective. The aim of the study was to establish the role of glutathione and proteins oxidative modifications in the breast cells apoptosis realization during cultivation with hydrogen peroxide. Material and methods. The cell culture of human breast epithelium (HBL-100) has been chosen as the objects of the research. Oxidative stress in cells was induced by hydrogen peroxide 0.3 mMole. A protector of protein SH groups, 1.4-dithioerythritol, was used to modulate redox status of HBL-100 cells under the conditions of free radical oxidation activation. The concentration of intracellular reactive oxygen species, protein carbonyl derivatives, reduced and oxidized glutathione as well as the intensity of apoptotic cell death were evaluated under the conditions of oxidative stress and HBL-100 cell culturing in the presence of 1.4-dithioerythritol. Results and discussion. It was found that 1,4-dithioerythritol has protective effect on cell proteins, preventing their irreversible carbonylation by restoring glutathione redox potential. Moreover, it reduces apoptosis of breast epithelial cells under oxidative stress.
Key words: oxidative stress, cell redox status, carbonyl derivatives of proteins, breast epithelial cell, apoptosis.
Shakhristova E.V. - candidate of medical sciences, head of the laboratory of molecular medicine, assistant professor of the chair for biochemistry and molecular biology with the course of clinical laboratory diagnostics, e-mail: [email protected]
Stepovaya E.A. - doctor of medical sciences, professor of the chair for biochemistry and molecular biology with the course of clinical laboratory diagnostics, e-mail: [email protected]
Ryazantseva N.V. - doctor of medical sciences, professor of the chair for biophysics, professor of the chair
for biological chemistry with courses of medical, pharmaceutical and toxicological chemistry
Nosareva О.L. - candidate of medical sciences, assistant professor of the chair for biochemistry and molecular
biology with the course of clinical laboratory diagnostics, e-mail: [email protected]
Chil'chigashev R.I. - student of the 5 th course of medical biological faculty
Novitsky V.V. - doctor of medical sciences, professor, academician of RAS, head of the chair for pathophysiology
