CC BY
31
УДК 581.1
УЧАСТИЕ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ WD40-LIKE ДОМЕНЫ, В ОТВЕТЕ РАСТЕНИЙ НА ФИТОГОРМОНЫ И СТРЕСС
© 2008 г А.В. Демиденко1, Н.В. Кудрякова1, Г.Н. Черепнева1 , Р. Оэльмюллер2, О.Н. Кулаева1, В.В. Кузнецов1
1 Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, г. Москва, ул. Ботаническая, 5, artem.ipp@gmail.com
2 Институт общей ботаники при университете Фридриха Шиллера, Германия, Йена, Дорнбюргерштрассе,159;
1 K.A.Timiryazev institute of plant physiology Moscow, Botanicheskaya St., 5, artem.ipp@gmail.com
2 Institute of general botany at F.Shiller University Germany, Yena, Dornburger str., 159
С помощью анализа базы данных экспрессии генов Arabidopsis thaliana, были найдены два гена (At4g01870 и At1g21670) с неизвестной функцией, принадлежащие к семейству белков, содержащих WD40-like повторы, совокупность которых позволяет поддерживать третичную структуру, представляющую собой так называемый бета-пропеллерный домен, участвующий в белок-белковых взаимодействиях. Экспериментально подтверждено влияние абсцизовой кислоты (АБК) на экспрессию этих генов. Также показано изменение содержания МРНК генов At4g01870 и At1g21670 под влиянием абиотических стрессов. Совокупность полученных данных позволяет предположить вовлечение продуктов изучаемых генов в процессы ответа на гормональный сигнал АБК и их вовлечение в ответы на абиотические стрессы.
Ключевые слова: абсцизовая кислота, абиотический стресс, арабидопсис, биоинформатика.
Based on the analysis of Arabidopsis thaliana gene expression databases two genes - At4g01870 and At1g21670 - with unknown function were revealed, and an influence of both abscisic acid (ABA) and abiotic stress on the expression of these genes were demonstrated. Obtained information allows to suggest that these genes are involved in response to ABA and abiotic stress.
Keywords: abscisic acid, abiotic stress, arabidopsis.
Идентификация и понимание механизмов передачи сигнала в пределах сетей регуляции транскрипции и взаимодействия этих сетей между собой является одной из главных проблем в современной молекулярной биологии, поскольку транскрипционные механизмы вносят свой вклад в регуляцию практически всех клеточных процессов. Многие факторы могут служить источником регуляторного сигнала, передаваемого по этим сетям, и как следствие инициаторами изменения транскрипционных профилей в растительной клетке. Молекулы растительных гормонов (цитокининов, абсцизовой кислоты (АБК), гиббереллинов, этилена, ауксина и др.) являются одними из наиболее глобальных индукторов регуляторных сигналов.
АБК - один из растительных гормонов, который модулирует множество важнейших процессов роста и развития растений, вызывая торможение ростовых процессов, переход в состояние покоя семян, почек и клубней, ускорение старения, переход к цветению [1]; регулирует водный режимы растений, вызывая закрывание устьиц; вовлечен в ответы на различные типы стрессов, включая холодовой, солевой и засуху [2, 3]. Несмотря на значительный прогресс в понимании процессов биосинтеза АБК [4], механизмы рецепции и передачи АБК-сигнала сегодня исследованы недостаточно глубоко.
Поскольку один из ныне открытых рецепторов АБК (FCA), как было показано [5], регулирует процессы «созревания» рибонуклеиновой кислоты (РНК),
использование глобальных подходов, таких как анализ транскрипционных профилей дикого типа и растений с выключенными рецепторными компонентами восприятия АБК, может оказаться полезным для выявления процессов, вовлеченных в сигналинг этого гормона. Это возможно с применением таких публично доступных интернет-ресурсов, как TAIR Microarray Expression Search (http://www.arabidopsis.org), Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress-old/) и NASCArrays (http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/experimentbro wse.pl). Они предоставляют пользователю программный инструментарий для проведения поиска по базам данных, в которых сохраняются результаты экспериментов, проведенных с использованием технологий генных чипов. Как правило, в публикациях, посвященных этим экспериментам, анализируют экспрессию только некой целевой группы генов (порядка нескольких сотен), представляющую интерес для конкретной исследовательской группы, тогда как данные по экспрессии других генов, включенных в чип, исчисляемых тысячами, остаются за пределами интересов этой группы. Эти результаты накапливаются в базах данных и, образно говоря, «ждут своего часа»: если возникает проблема, для анализа которой удовлетворяют условия уже поставленного эксперимента, есть возможность с помощью программных средств, доступных он-лайн, получить
данные экспрессии интересующей группы генов в уже апробированных условиях.
В данной работе мы воспользовались описанным выше подходом для выявления и анализа двух АБК-зависимых генов из семейства, кодирующего белки, содержащие WD-like повторы. Они были найдены в базе экспрессии генов арабидопсиса TAIR Microarray Expression Search (http://www.arabidopsis.org) путем поиска по следующим параметрам: увеличение экспрессии при обработке АБК и при стрессах, повышающих ее внутриклеточное содержание, - солевом, осмотическом и температурном. Белки, содержащие WD-like повторы, заинтересовали нас не только тем, что два представителя этого семейства обнаружили АБК-зависимость, но и особыми свойствами WD-like повторов, позволяющими этим белкам образовывать третичную структуру так называемого бета-пропеллерного домена - белковой платформы, которая в других исследованных белках этого семейства осуществляет функцию аффинного взаимодействия с другими белковыми компонентами клетки и может служить инициатором сборки сложных белковых комплексов, осуществляющих различные функции -структурные, регуляторные, сигнальные. Нам показалось это хорошей предпосылкой для исследования двух найденных WD-like содержащих белков араби-допсиса на предмет их вовлечения в АБК-сигналинг.
Цель работы - изучение новых генов Arabidopsis thaliana, кодирующих белки, содержащие консервативные WD40-like повторы, уровень синтеза МРНК которых зависит от изменения концентрации АБК как экзогенной - при воздействии гормона извне, так и эндогенной - при воздействии абиотических стрессов, влияющих на синтез АБК клеткой. МРНК - класс клеточных РНК, служащих для переноса информации от ядерной ДНК к аппарату синтеза белка.
Экспериментальная часть
Выращивание растений. Поверхность семян арабидопсиса стерилизовали в 1%-й перекиси водорода, промывали стерильной дистиллированной водой, высаживали на среду Мурашиге-Скуга. Семена проклевывались на 2-3-й день. Спустя 7 дней растения пересаживали в предварительно стерилизованную почву, выращивали еще в течение 7 дней. Все операции с растениями проводили в камерах искусственного климата при температуре 24 °С при 16-часовом освещении (100 В/м2). Отделенный 1-й лист полученных 2-недельных проростков использовали в опытах по воздействию различных внешних стимулов.
Обработка листьев гормонами. Отделенные листья (1 -й лист) арабидопсиса выкладывали в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой, истощали по эндогенным гормонам в течение 24 ч. Затем переносили листья на чашки Петри с фильтровальной бумагой, пропитанной раствором растительного гормона: АБК в концентрации 10-6 М либо бензиламинопу-рине (БАП) в той же концентрации.
Биоинформационный поиск. Поиск АБК регулируемых генов арабидопсиса, удовлетворяющих заданным нами параметрам, проводили с помощью доступного онлайн программного инструментария TAIR Microarray Expression Search (http://www.arabidopsis.org).
Для нахождения в исследуемых белках консервативных доменов проводили поиск по базе CDD (Conservative Domain Database, http://www.ncbi.nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi).
Поиск гомологий между последовательностями из арабидопсиса и других растений проводили с помощью доступного он-лайн программного инструментария (protein BLAST) на сайтах NSBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и TIGR (http://www.tigr.org/).
Выделение РНК и Northern-блоттинг. Для выделения РНК и Northern-блоттинг применили метод, использованный ранее в [6].
Оценку интенсивности сигналов, полученных в Northern-блоттинге, проводили в программе 1D-Scan. Данные представляли в виде диаграммы, построенной по полученным программой условным цифровым значениям интенсивности.
Результаты и их обсуждение
С помощью TAIR Microarray Expression Search (http://www.arabidopsis.org) были выявлены два гена с неизвестной функцией (At4g01870 и At1g21670), кодирующие белки, содержащие консервативные WD40-like повторы в количестве, достаточном для поддержания конформации специфической третичной структуры так называемого бетта-пропеллерного домена.
Нами был проведен анализ in silico последовательностей генов A. thaliana. Поиск по базе консервативных доменов CDD (Conservative Domain Database, http : //www. ncbi. nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrp sb.cgi) показал сходство N-концевой части продуктов генов At4g01870 и At1g21670 из A.thaliana с последовательностью белка TolB E. coli (рис. 1а) достаточное, чтобы предположить сохранение в растительном белке кон-формационных особенностей бактериального белка, а также частичное сходство их С-концевой части с ди-пептидилпептидазой IV типа (DPP IV), однако сохранение функции пептидазы требует дополнительной экспериментальной проверки. На рис. 1б приведена третичная структура бета-пропеллерного домена TolB, где с помощью более темного цвета указаны участки гомологии с белковой последовательностью, кодируемой At4g01870.
Я 1 125 250 375 500 625 652
Рис. 1. Расположение консервативных доменов в последовательности гена At4g01870: а - домены, распознанные в составе последовательности базой CDD (Conservative Do-
main Database; б - бета-пропеллерная структура бактериального TolB: темным цветом отмечены области гомологии с белковыми последовательностями At4g01870 и At1g21670
Надо упомянуть, что TolB является важным структурно-функциональным доменом бактериальной Tol-Pal системы, функция которой - защита клетки от проникновения пептидных токсинов (колицинов) и поддержание водно-солевого обмена клетки бактерии [7]. TolB относится к белкам, богатым WD40-like повторами, представляющими собой участки белковой последовательности порядка 40 аминокислот с высоким содержанием триптофана, пролина и аспартата, которые отвечают за определенную структурную организацию белка. Показано, что при наличии в белковой последовательности таких повторов в количестве более трех с высокой вероятностью молекула белка может иметь конформацию так называемого бета-пропеллерного домена. Данная структурная единица может выполнять функцию так называемой «белковой платформы», на базе которой может происходить сборка разнообразных белковых комплексов. В работах по исследованию функций белков, содержащих WD40-like повторы, показано, что созданные на их базе комплексы участвуют в таких жизненно важных функциях клетки, как перенос различных сигналов (бета-субъединица гетеротримерной ГТФ-азы), синтез белка (в качестве кофактора белкового синтеза), сборка транскрипционного аппарата, деградация «отработанных» белков клетки (белок Copl) и многих других процессах [8].
Для выяснения консервативности последовательностей белковых продуктов двух изучаемых генов Arabidopsis thaliana был проведен поиск гомологий в геномах других растений с помощью программного инструментария (программа Blast), доступного на web-ресурсе проекта «The Gene Index Project» (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/), где расположены полностью и частично сиквенированные геномы 34 видов растений. Гомологичные последовательности были найдены в 22 геномах, среди которых оказались геномы риса, кукурузы, винограда, тополя, салата, картофеля, сосны и др. В остальных геномах гомологии не обнаружились, судя по всему, из-за незавершенности их сиквенса. Поскольку найденные гомологичные последовательности были представлены в основном в виде транслированных геномных фрагментов, для удобства сравнения были отобраны последовательности из l2 видов растений, имеющие достаточно протяженную область (порядка 90-95
аминокислот) для проведения анализа. Сравнение проводилось с использованием алгоритма AlignX. Результаты (рис. 2) показали достаточно высокую степень консервативности последовательностей: 34,4 % идентичных аминокислот и 89,6 % сходства при учете «позитивных» замен. При анализе полных последовательностей с помощью InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/index.html) (данные не приведены) в составе интересующих нас последовательностей из арабидопсиса, риса, винограда и других обнаружено шесть стабильных WD40-like повторов. Возвращаясь для сравнения к структуре TolB, можно видеть, что пропеллерная структура этого белка также состоит из 6 сегментов.
Стоит отметить, что при поиске консервативных доменов у двух изучаемых белковых последовательностей обнаружена гомология их C-концевой области с дипептидилпептидазой IV серинового типа (рис. 1а), причем наличие аминокислот, входящих в консенсус ее активного сайта (расположенных в порядке: серин, аспарагиновая кислота, гистидин), наблюдается у всех проанализированных растительных последовательностей. Таким образом, не исключено наличие пептидаз-ной функции у исследуемой группы белков.
Для подтверждения регуляции экспрессии исследуемых генов (At4g01870 и At1g21670) в ответ на гормональный сигнал АБК изучено с помощью North-ern-блоттинга изменение содержания МРНК в молодых листьях розетки арабидопсиса в ответ на обработку АБК в концентрации 10-6 М, а так же в ответ на обработку гормоном-антагонистом цитокинином. Результаты данного опыта отчетливо показали (рис. 3), что экспрессия исследуемых генов арабидопсиса At4g01870 и At1g21670 (для последнего данные не приведены) регулируется этими гормонами, причем АБК стимулирует, а цитокинин подавляет накопление МРНК этих генов.
Это подтверждается данными, полученными с помощью использования технологии генных чипов. Мы проанализировали данные по экспрессии генов ара-бидопсиса, находящиеся в публичном доступе на web-ресурсе TAIR Microarray Expression Search (http://www.arabidopsis.org). Наши экспериментальные данные строго соответствуют данным экспериментов с генными микрочипами Affimetrix25k, в которых в качестве исследуемых образцов фигурировала
Рис. 2. Сравнение транслированных последовательностей из геномов различных растений. Цветовая маркировка: светло-серый - абсолютная консервативность (помечено звездочками); серый - высокая степень консервативности; темно-серый - низкая степень консервативности (либо замена высоко-консервативной аминокислоты без существенного изменения §0кальных характеристик последовательности)
10 часов
24 часа
ABA ВАР НЮ ABA ВАР НгО ABA ВАР
ÉB ЯМ1 Ш *** иЛг- * «MR» '
I 40
1600 1400 1200 Е 1000
□ контроль ■ опыт
1 10 24
Время обработки, ч
Рис. 3. Результаты воздействия АБК и цитокинина на накопление мРНК гена At4g01870: а - Northern-блоттинг; б - Оценка интенсивности сигналов, полученных в Northern-блоттинге, проведенная в программе 1 D-Scan
тотальная МРНК, выделенная из листьев арабидопсиса, подверженных обработке микромолярными концентрациями АБК. При обработке АБК количество МРНК двух исследуемых генов возрастало в течение 3 ч эксперимента более чем в 2 раза, тогда как при обработке цитокинином содержание матриц At4g01870 и At1g21670 уменьшалось (данные не приводятся), хотя и в меньшей степени, чем в наших опытах. Однако это может быть следствием некоторых отличий в постановке опыта: в наших экспериментах использованы листья 14-дневных растений, тогда как в экспериментах с генными микрочипами -целые 7-дневные растения. Несмотря на это, можно заметить, что основные тенденции сохраняются. Кроме того, было проанализировано изменение содержания матриц генов At4g01870 и At1g21670 в условиях различных абиотических стрессов, таких как низкие положительные температуры, засоление, высокий осмос, при которых заметно увеличивается концентрация АБК в растительных клетках. В качестве примера приведена диаграмма, демонстрирующая увеличение содержания РНК матрицы гена At1g21670 в корнях 7-дневных проростков араби-допсиса в ответ на их обработку низкими температурами (4°С). В течение 24 ч количество МРНК данного гена повышается в сотни раз (рис. 4). Похожая картина вырисовывается и в случае с геном At4g01870. Подобные реакции генов были обнаружены и при солевом, и при осмотическом стрессе (данные не приведены). Эти эффекты указывают на вовлечение продуктов этих двух генов, а возможно, и их гомологов в других растениях в процессы ответа на абиотические стрессы и изменения концентрации АБК (как экзо-, так и эндогенной).
24 Время, ч
Рис. 4. Влияние обработки низкими положительными температурами (4 °С) на уровень МРНК гена At1g21670 в корнях 7-дневных проростков Arabidopsis thaliana
Таким образом, поиск in silico новых АБК-регулируемых генов A. thaliana привел к выявлению двух генных последовательностей (At4g01870 и At1g21670), кодирующих белки, богатые WD40-like повторами. Путем дальнейшего сравнительного анализа показана высокая консервативность белковых последовательностей, а также наличие в их составе доменов, гомологичных бактериальному бета-пропеллерному белку TolB и дипептидилпептидазе IV сери-нового типа, что предполагает сохранение специфической третичной структуры у исследуемых белков, позволяющей осуществлять белок-белковое взаимодействие, и, возможно, пептидазной активности. Однако последнее требует подтверждения с помощью биохимических методов. Регуляция экспрессии исследуемых генов арабидопсиса посредством АБК и абиотических стрессов подтверждена с помощью Northern-блота, а также путем анализа данных, полученных с помощью технологии генных чипов. Это позволяет нам предположить, что исследуемые гены скорее всего вовлечены в ответы на АБК и стрессы, связанные с изменением концентрации этого гормона. В заключение можно сказать, что в процессе работы обнаружено множество гомологов исследуемых генов в других видах растений и обозначено направление для дальнейшего исследования данной группы генов и их продуктов.
Литература
1. Putterill J., Laurie R., Macknight R. // Bioessays. 2004. Vol. 26. P. 363-373.
2. Finkelstein R.R., Gampala S.S.L., Rock C.R. // Plant Cell (Suppl). 2002. Vol. 14. Р. 15-45.
3. Finkelstein R.R. // Plant Cell. 2006. Vol. 18. Р. 786-791.
4. Xiong L., Zhu J.K. // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. Р. 2936.
5. Razem F. et al. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. Р. 99229929.
6. Kusnetsov V.V. et al. // Mol Gen Genet. 1998. Vol. 259(1). Р. 21-28.
7. Lazzaroni J.C. et al. // FEMS Microbiol Lett. 1999. Vol. 177(2). Р. 191-197.
8. Van Nocker S., Ludwig P. // BMC Genomics. 2003. Vol. 4(1). Р. 50.
Поступила в редакцию
30 октября 2007 г.
