CC BY
57
цитотоксичность и ГЕМОСОВМЕСТИМОСТЬ PLGA НАНОЧАСТИЦ, НАГРУЖЕННЫХ ДОКСОРУБИЦИНОМ
Ю.А. Малиновская1- 3 4, Е.И. Коваленко2, Т.С. Ковшова1- 3 4, Н.С. Осипова1, 4, О.О. Максименко1, 4, В.Ю. Балабаньян3, В.А. Разживина1, М.В. Гречихина2, А.А. Бойко2, С.Э. Гельперина1, 4
'ООО «Технология лекарств»; Россия, 141400 Химки, ул. Рабочая, 2а; 2ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН»; Россия, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Россия, 119991 Москва, Ленинские Горы, 1; 4Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева; Россия, 125047Москва, Миусская площадь, 9
Введение. Использование полимерных биодеградирумых наночастиц (НЧ) в качестве средств доставки лекарственных веществ является перспективным способом преодоления гистогематических барьеров. Так, НЧ из сополимера молочной и гликолевой кислот (РШЛ), модифицированные полоксамером 188, способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и доставлять лекарственные вещества, в частности доксорубицин, в интракраниальную опухоль при внутривенном введении. На этапе доклинических исследований было важно оценить возможное токсическое действие НЧ на компоненты крови. Цель исследования — оценка цитотоксичности и гемосовместимости РШЛ НЧ, нагруженных доксорубицином (Вох-РШЛ НЧ), изучение кинетики захвата наночастиц клетками глиобластомы человека.
Материалы и методы. Для изучения влияния НЧ на свертывающую систему крови определяли протромбиновое время до и после инкубации плазмы с НЧ. Уровень активации тромбоцитов определяли на проточном цитофлуориметре по уровню экспрессии Р-селектина. Гемолитическую активность НЧ определяли спектрофотометрически по концентрации высвободившегося гемоглобина. Цитотоксичность НЧ оценивали с помощью MTS-теста. Захват НЧ клетками изучали с помощью проточного цитофлуориметра.
Результаты. Вох-РШЛ НЧ не оказывали влияния на время коагуляции плазмы крови и активность тромбоцитов в диапазоне концентраций 0,1—100 мкг/мл: показатель протромбинового времени составил 12—15 с для всех тестируемых образцов и уровень экспрессии Р-селектина не превысил 15 %. НЧ не вызывали гемолиз после 3 ч инкубации с образцами крови. Цито-токсический эффект Вох-РШЛ НЧ на клетки глиобластомы Ш7МО был сравним с действием субстанции доксорубицина. Результаты проточной цитометрии показали, что НЧ активно захватываются клетками.
Заключение. Проведенное исследование подтвердило гемосовместимость Вох-РШЛ НЧ: НЧ не оказывали влияния на свертывающую систему крови и не вызывали гемолиз в исследуемом диапазоне концентраций. НЧ активно захватывались клетками глиобластомы и оказывали выраженный цитотоксический эффект.
Ключевые слова: РШЛ наночастицы, биосовместимость, гемосовместимость, цитотоксичность, интернализация
CYTOTOXICITY AND HEMOCOMPATIBILITY OF DOXORUBICIN-LOADED PLGA NANOPARTICLES
Yu.A. Malinovskaya13 4, E.I. Kovalenko2, T.S. Kovshova13 4, N.S. Osipova14, O . O . Maksimenko1'4, VYu. Balabanyan3, V A Razzhivina1, M. V Grechikhina2, A .A. Boiko2, S . E . Gelperina14
1Drug Technology LLC; 2a Rabochaya St., Khimki 141400, Russia; 2Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; 16/10Miklukho-Maklaya St., Moscow 117997, Russia; 3M. V. Lomonosov Moscow State University; 1 Leninskie Gory, Moscow 119991, Russia; 4D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia; 9 Miusskaya ploshchad', Moscow 125047, Russia
Introduction. The use of polymeric biodegradable nanoparticles (NP) as drug delivery systems is a promising approach to overcome histohematomatic barriers. Thus, poloxamer 188-coatedpoly (lactide-co-glycolide) (PLGA) NP are able to overcome blood-brain barrier and to deliver therapeutic agents, in particular doxorubicin, into intracranial tumour upon intravenous administration. It is important to evaluate NP interaction with blood components in preclinical studies.
The objective of the study was to investigate cytotoxicity andhemocompatibility of doxorubicin-loadedPLGA NP (Dox-PLGA NP), to essess NP uptake by glioblastoma cells.
Materials and methods The influence of NP on coagulation cascade was evaluated by prothrombin time measuring before and after plasma incubation with NP. To assess NP thrombogenicity the platelet activation level was determined by flow cytometry. The NP hemolytic activity (released hemoglobin concentration) was measured spectrophotometrically. NP cytotoxicity was determined by MTS assay. NP uptake by human glioblastoma cells was evaluated by flow cytometry.
Контакты: Юлия Александровна Малиновская j.malinowskaya@gmail.com
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-19-1-71-80
(ce)
72
Оригинальные статьи
Results. Dox-PLGA NP did not influence blood coagulation time and thrombocyte activity at concentrations up to 100 mcg/mL: PT values were 12—15 s for all tested samples, and P-selectin expression level did not exceed 15 %. All samples were not hemolytic after 3 h of incubation.
Cytotoxicity of doxorubicin releasedfrom PLGA NP on glioma U87MG cells was comparable to that of free doxorubicin. As shown by flow cytometry Dox-PLGA NP were efficiently internalized into the cells.
Conclusion. The study of hemocompatibility confirmed the safety of Dox-PLGA NP: NP did not influence blood coagulation system and did not induce hemolysis. NP were efficiently internalized into the human glioblastoma cells and produced considerable antitumor effect in vitro.
Key words: PLGA nanoparticles, biocompatibility, hemocompatibility, cytotoxicity, internalization
Введение
Важными задачами современной фармакологии являются разработка систем направленной доставки противоопухолевых лекарственных веществ (ЛВ) и снижение системной токсичности в терапии злокачественных новообразований. В настоящее время на рынке существует более 40 препаратов на основе коллоидных систем доставки, одобренных системой контроля качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), и сотни нанотехнологиче-ских препаратов находятся на стадии разработки. В состав противоопухолевых наносомальных препаратов (наночастиц (НЧ), липосом) вводят как цито-токсические ЛВ, так и малые интерфирирующие РНК (siPHK) и лизаты опухолевых клеток [1—4]. Одним из наиболее перспективных направлений в этой области является использование НЧ на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA) [5—17]. Благодаря способности разлагаться в живом организме без образования токсичных продуктов полилак-тиды широко применяются в хирургии, ортопедии и стоматологии, а также в качестве полимеров-носителей для инъекционных лекарственных форм длительного действия (депо-форм), представляющих собой микросферы размером 50—150 мкм с включенным в них ЛВ [5—7].
Помимо биосовместимости, к полилактидам как к материалам, предназначенным для контакта с кровью, предъявляется еще и требование гемосовмести-мости, что подразумевает отсутствие отрицательного воздействия на кровь или ее компоненты. Гемосо-вместимый материал не должен провоцировать образование тромбов и тромбоэмболии, активировать свертывающую, фибринолитическую системы и систему комплемента, оказывать отрицательное действие на белковые и форменные элементы крови, нарушать электролитный баланс крови [18].
В то же время гемосовместимость наночастиц PLA/PLGA изучена недостаточно, данные часто противоречивы, что объясняется разнообразием свойств полилактидов и других ингредиентов, применяемых для получения НЧ [19, 20]. Так, в работах C. Forna-guera и соавт., S. Rahimian и соавт., N. Desai показано, что особенности взаимодействия НЧ с биологической
средой зависят от их физико-химических параметров, таких как гидрофобность, поверхностный заряд и размер [19, 21-23].
На этапе доклинических исследований важно оценить возможное токсическое действие НЧ на компоненты крови. Противоопухолевая активность НЧ, нагруженных цитостатическим ЛВ, зависит от способности НЧ захватываться клетками и высвобождать ЛВ в активной форме. Поэтому важно изучить цито-токсичность разрабатываемых НЧ в отношении опухолевых клеток и сравнить эффект со свободным ЛВ и плацебо-НЧ.
Необходимо отметить, что при переносе технологии получения наносомальной формы с лабораторного уровня на стадию клинических исследований часто лимитирующим фактором является отсутствие первичных систематических исследований по взаимодействию НЧ с биологическими компонентами, изучению биосовместимости и цитотоксичности НЧ.
Как показали проведенные ранее исследования, модификация поверхности НЧ PLGA полоксамером 188 позволяет им преодолевать гематоэнцефаличе-ский барьер и проникать в мозг.
Наноразмерная форма доксорубицина на основе модифицированных НЧ (Dox-PLGA НЧ) проявила высокую противоопухолевую активность в отношении экспериментальной интракраниальной опухоли и весьма перспективна для клинического использования [24, 25]. В связи с этим помимо влияния на свертывающую систему крови, выявления возможных тромбогенных свойств и оценки гемолитической активности важно оценить цитотоксические свойства Dox-PLGA НЧ и их захват потенциальными клетками-мишенями (клетки глиомы человека U87MG).
Цель исследования — оценка цитотоксичности и гемосовместимости PLGA НЧ, Dox-PLGA НЧ, изучение кинетики захвата НЧ клетками глиобластомы человека.
Материалы и методы
Получение Dox-PLGA НЧ. Для получения НЧ использовали PLGA марки Resomer® 502H с соотношением мономеров молочной и гликолевой кислот 50 : 50 (ММ 7—17 кДа, Evonik Röhm GmbH, Германия).
Оригинальные статьи 73
НЧ получали методом двойных эмульсий (в/м/в). в суспензии НЧ определяли спектрофотометрически Доксорубицин (25 мг, Teva, Sicor, Италия) растворяли в супернатантах, полученных после отделения НЧ в 0,001 н. соляной кислоте (4 мл) и смешивали с рас- ультрацентрифугированием (фильтры Microcon 30 kDa, твором PLGA (250 мг) в дихлорметане (6 мл). Смесь Millipore, США; центрифуга Eppendorf Centrifuge гомогенизировали с помощью диспергатора Ultra- 5415 R, Германия). Степень включения доксоруби-Turrax T1S Basic (IKA, Германия) при 23 600 об/мин цина в НЧ рассчитывали как отношение (%) свобод-в течение 3 мин. Полученную первичную эмульсию ного доксорубицина к его общему содержанию в об-(в/м) добавляли к 1 % раствору поливинилового разце. спирта (9—10 кДа, Sigma, Германия) в фосфатном буфере (PBS, pH 7,4) и гомогенизировали сначала Исследование кинетики высвобождения с помощью Ultra-Turrax T1S, а затем с помощью го- доксорубицина из наночастиц могенизатора высокого давления (Panda Plus 2000, Скорость высвобождения доксорубицина из НЧ Италия) при 1000 бар. Органический растворитель изучали в фосфатном буфере (PBS) при pH 7,4 и 4,5. удаляли под вакуумом; полученную суспензию лио- НЧ ресуспендировали в PBS и помещали в шей-фильно высушивали (Alpha 2—4 LSC, Martin Christ кер-инкубатор (200 об/мин, 37 °С). Пробы отбирали GmbH, Германия). В качестве криопротектора ис- через 0, 1, 2, 3, 4, 6 и 24 ч, НЧ отделяли центрифуги-пользовали маннит. Для получения PLGA-плацебо рованием (4S300 g, 30 мин). Концентрацию доксору-НЧ использовали аналогичную методику; при этом бицина в супернатантах определяли спектрофото-органическую фазу (раствор PLGA в дихлорметане) метрически (Ä. = 4S0 нм). Для каждого образца непосредственно добавляли к 1 % водному раствору проводили по 3 параллельных измерения. поливинилового спирта. Для модификации поверхности НЧ полоксамером 1SS (P1SS, BASF, Германия) Клеточные линии непосредственно перед экспериментами лиофили- В исследовании использовали культуры клеток зованные НЧ ресуспендировали в 1 % растворе по- глиобластомы человека (US7MG), гепатокарциномы локсамера и инкубировали в течение 30 мин. человека (HepG2) и иммортализованные клетки по-Получение флуоресцентно-меченных нч. Для ви- чечного эпителия свиньи (LLC-PK). Культуры клеток зуализации in vitro использовали PLGA НЧ, меченные получены из Американского банка клеточных культур флуоресцентными красителями Dil и Cy5.5 (PL- (ATCC, США). Клетки культивировали на ростовой GA-Cy5.5 и PLGA-DiI НЧ соответственно). Для по- среде (DMEM, Gibco) с добавлением смеси антибио-лучения PLGA-Cy5.5 НЧ использовали конъюгат тиков (100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрепто-PLGA c цианиновым флуоресцентным красителем мицина, Gibco, США), GlutaMAX (2 мМ, Gibco, Су5.5 (Cyanine5.5 amine, Lumiprobe, Германия). Со- США) и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки отношение краситель : полимер = 1 : 600 (в/в). Кра- (Biowest, США) в стандартных условиях при темпе-ситель конъюгировали с концевыми карбоксильными ратуре 37 °C во влажной атмосфере с 5 % CO2. группами PLGA, активированными 1-этил-3-(3-ди- метиламинопропил)карбодиимидом (Sigma, США). Оценка цитотоксического действия наночастиц Для получения PLGA-DiI НЧ липофильный флуо- Цитотоксическое действие Dox-PLGA НЧ оце-ресцентный краситель Dil (Sigma Life Science, США) нивали на клеточных линиях US7MG, HepG2 и LLC-вводили в состав органической фазы на стадии полу- PK с помощью колориметрического MTS-теста. Для чения первичной эмульсии. Соотношение краситель : сравнения использовали ненагруженные НЧ (PLGA-полимер = 1 : 750 (в/в). Свободный Dil отделяли плацебо НЧ) и свободный доксорубицин. MTS-тест от НЧ с помощью гельфильтрационной хроматогра- выполняли согласно стандартному протоколу с мо-фии на колонке с Sephadex G-25. дификациями (Protocol TB245, Promega). В работе использовали CellTiter 96 AQ One Solution Reagent ^-ueous с Определение физико-химических параметров (PROMEGA, США). Клетки высаживали в 96-лу-наночастиц ночные культуральные планшеты (по 4 тыс. клеток Размеры НЧ (средний гидродинамический ради- в 100 мкл ростовой среды (DMEM c добавлением ус), индекс полидисперсности (PDI) и Ç-потенциалы 10 % телячьей эмбриональной сыворотки). В части определяли с помощью Zetasizer Nano ZS (Malvern лунок ростовую среду заменяли на питательную среду Instruments, Malvern, UK). Общее содержание доксо- с образцами Dox-PLGA, PLGA-плацебо НЧ и доксорубицина и флуоресцентных красителей Су5.5 и DiI рубицин в диапазоне концентраций 1—500 мкг/мл определяли спектрофотометрически после растворе- НЧ, что соответствует 0,004—67 мкг/мл в пересчете ния НЧ в диметилсульфоксиде при длинах волн 4S0, на доксорубицин. Через 24 ч культивирования опре-650 и 555 нм соответственно. Концентрацию свобод- деляли количество жизнеспособных клеток с по-ного доксорубицина и флуоресцентных красителей мощью MTS-теста.
1'2020 том 19 I vol. 19 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BÍOTHERAPY
74 Оригинальные статьи
Определение гемосовместимости жительный контроль). После инкубации неповреж-Образцы крови получали минимум от 3 доноров, денные эритроциты отделяли центрифугированием. не принимавших в течение 2 нед лекарственных Супернатанты переносили в 96-луночные планшеты. средств, способных повлиять на результаты экспери- Для индукции образования гемихромов в эксперимента. Для исследования протромбинового времени ментальные образцы добавляли додецилсульфат на-(ПВ) и реакции активации тромбоцитов кровь отби- трия. Количество гемоглобина в образце определяли, рали в пробирки с цитратом натрия, для тестирования оценивая оптическую плотность раствора при 540 нм. гемолитической активности — в пробирки с литий-ге- Процент гемолиза рассчитывали как отношение оп-парином. тической плотности образца к оптической плотности Для определения ПВ использовали бедную тром- контроля. боцитами плазму крови, полученную центрифугированием крови при 3000 об/мин (1500 g). Исследуемую Изучение интернализации наночастиц методом плазму инкубировали в течение 30 мин с НЧ (PLGA- проточной цитометрии плацебо и Dox-PLGA) в концентрациях 1, 10, 100 мкг/мл. Клетки U87MG высаживали в 48-луночные куль-Для того чтобы исключить влияние времени инкуба- туральные планшеты. Dox-PLGA НЧ, меченные Dil ции на величину ПВ, использовали 2 контроля: ПВ или Су5.5, ресуспендировали в 1 % растворе полок-определяли для плазмы крови непосредственно после самера, инкубировали в течение 30 мин, затем перецентрифугирования и через 30 мин (время инкубации носили в культуральную среду (DMEM), содержащую плазмы крови с НЧ). 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, и вносили Для определения активации тромбоцитов исполь- в лунки культурального планшета в концентрации зовали плазму, обогащенную тромбоцитами (Plate- 40 мкг/мл. Клетки инкубировали с НЧ в течение 5, 15, let-reach plasma, PRP). Кровь в пробирке с этиленди- 30, 60, 120, 240 и 300 мин. После инкубации среду аминтетрауксусной кислотой центрифугировали удаляли. Клетки промывали PBS для удаления НЧ, (1000 об/мин, 10 мин), затем отбирали белый ободок связанных с мембраной клетки, затем снимали с под-на границе форменных элементов и плазмы. Плазму ложки с помощью раствора трипсина и этилендиа-(PRP) разбавляли в 20 раз PBS и инкубировали минтетрауксусной кислоты 0,25 %, центрифугировали в СО2-инкубаторе в течение 1 ч с Dox-PLGA и PLGA- (1000 об/мин, 5 мин) и ресуспендировали в питатель-плацебо НЧ в концентрациях 0,1; 1,0; 10; 100 мкг/мл. ной среде до конечной концентрации 5 х 105 клеВ качестве положительного контроля плазму инку- ток/мл. Флуоресценцию клеток анализировали с по-бировали с индуктором агрегации тромбоцитов аде- мощью проточной цитофлуориметрии на клеточном нозиндифосфатом (10 мкг/мл, 1 : 125); в качестве сортере MoFlo XDP (Beckman Coulter, США). Обра-отрицательного контроля использовали PRP. Образ- ботку данных проводили с помощью программного цы фиксировали 1 % параформальдегидом и инку- обеспечения Summit V5.2.0.7477. Эффективность бировали с моноклональными антителами CD34, интернализации оценивали как процент клеток, конъюгированными с FITC (Сорбент, Россия), и ан- интернализовавших НЧ. Для возбуждения флуорес-тителами к P-селектину (CD62P), конъюгированными ценции Dil применяли лазер с длиной волны 561 нм; с PE (BioLegend, США), в течение 15 мин при ком- эмисионные светофильтры: 580/23 нм (FL12-Dil) натной температуре. Образцы анализировали на про- и 625/26 нм (FL13-Dil). Для возбуждения флуорес-точном цитофлуориметре MoFlo XDP (Beckman ценции Су5.5 использовали лазер 488 нм, эмиссионные Coulter, США). CD34 использовали для выделения светофильтры: 670/30 нм (FL4-PE-Cy5) и 725/40 нм популяции тромбоцитов, а CD62P (P-selectin) — (FL5-PE-Cy5). для идентификации активированных тромбоцитов. Уровень активации тромбоцитов определяли как до- Статистическая обработка данных лю CD62P-положительных тромбоцитов (%). Статистическую обработку результатов проводи-Для оценки гемолитической активности НЧ ис- ли с использованием t-критерия Стьюдента (Microsoft пользовали фотометрический тест, основанный на де- Excel 2010) и программы GraphPad Prism 6. Исполь-текции окисленных форм гемоглобина. Цельную зуемый статистический уровень значимости -p <0,05. кровь разбавляли в 25 раз PBS и центрифугировали при 800 g (15 мин); супернатант отбирали и исполь- Результаты и обсуждение зовали для определения свободного гемоглобина Все полученные НЧ имели диаметр <200 нм, уз-плазмы. Образцы крови инкубировали с PLGA-плаце- кое распределение по размерам (PDI <0,2) и отрица-бо и Dox-PLGA НЧ в концентрации 1, 10, 100 мкг/мл тельный ^-потенциал поверхности (табл. 1). Для вив течение 3 ч при 37 °C. Для определения общего зуализации НЧ в экспериментах in vitro PLGA гемоглобина (tHb) в отдельный образец крови добав- предварительно конъюгировали с индоцианиновым ляли 1 % Triton X-100, вызывающий гемолиз (поло- флуоресцентным красителем Су5.5. Образование
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 12020 том 19 | vol. 19
Таблица 1. Физико-химические характеристики наночастиц (среднее значение ± SD; n = 3) Tabl. 1. Physicochemicalparameters of nanoparticles (mean value ± SD; n = 3)
Образец наночастиц
Nanoparticles sample
Концентрация активного вещества/ флуоресцентного красителя, мкг/мл
Concentration of active substance/fluorescen dye, ^g/ml
Dox-PLGA
Dox: 70,5
Средний размер, нм
Mean size, nm
120 ± 1
Индекс полидисперсности
Polydispersity index
0,104 ± 0,011
¡^-потенциал, мВ ^-potential, mV
11,6 ± 0,8
Dox-PLGA-Cy5.5 Dox: 67 Cy5: ~1,5 114 ± 1 0,196 ± 0,008 -14,9 ±0,2
PLGA-DiI Dil: 1,56 143 ± 2 0,138 ± 0,011 -30,8 ± 1,3
конъюгата подтверждали методом гельпроникающей хроматографии. Максимумы поглощения и флуоресценции Су5.5 лежат в дальней красной области, поэтому введение этой флуоресцентной метки позволило дифференцировать меченые НЧ (Су5.5^, Д = 690/712 нм) и доксорубицин (Хх/Xem = 480/570 нм).
Исследование кинетики высвобождения доксорубицина из наночастиц
Влияние pH среды на скорость высвобождения доксорубицина из НЧ изучали в фосфатном буфере при 2 значениях рН: 4,5 и 7,4. Данные значения pH были выбраны для моделирования профиля высвобождения доксорубицина из НЧ в экстрацеллюляр-ном матриксе со значением рН, близким к 7,4, и ор-ганеллах клетки, внутри которых поддерживается кислая реакция среды (поздние эндосомы и лизосо-мы, рН 4,0—5,5) [26—28]. На рис. 1 видно, что кинетика высвобождения доксорубицина из НЧ имеет двухфазный профиль. Высокая скорость высвобождения доксорубицина в I фазе эксперимента (так называемый burst release) характерна для полимерных наносомальных форм и обусловлена диффузией ЛВ с поверхности НЧ [5]. В течение первых 2 ч высвобождается примерно 30 % доксорубицина. В дальнейшем наблюдается медленное контролируемое высвобождение: так, в течение 24 ч высвобождается 60—70 % доксорубицина. В кислой среде скорость его высвобождения выше: при pH 7,4 за 6 ч высвобождается около 40 % доксорубицина, в то время как при pH 4,5 высвобождается 70 % доксорубицина. Высокая скорость высвобождения доксорубицина при кислых значениях pH коррелирует с данными, полученными другими авторами [29].
Оценка цитотоксического действия наночастиц
Цитотоксический эффект PLGA-плацебо НЧ оценивали на клеточных линиях HepG2, LLC-PK и U87MG. Культуры клеток LLC-PK и HepG2 часто используют как in vitro модели для оценки нефро-токсического и гепатотоксического действия лекар-
Время, ч / Time, hours
Рис. 1. Кинетика высвобождения доксорубицина из PLGA наночастиц, нагруженных доксорубицином, в PBS при pH 4,5 и 7,4 (25-крат -ное разведение; среднее значение ± SD; n = 3; p = 0,95) Fig. 1. Kinetics of doxorubicin release from Dox-PLGA nanoparticles (release medium PBS pH4.5 and 7.4; 25-fold dilution; mean value ± SD; n = 3;p = 0.95)
ственных средств [30, 31]. Цитотоксический эффект Dox-P LGA НЧ в отношении опухолевых клеток оценивали на культурах клеток U87MG и HepG2. U87M G — хорошо изученная и часто используемая клеточная линия глиобластомы человека IV степени злокачественности. Показано, что данные клетки характеризуются средней чувствительностью к док-сорубицину по сравнению с другими клеточными линиями глиобластомы [32, 33]. Результаты MTS-теста после 24 ч инкубации подтвердили отсутствие цитотоксического действия PLGA-плацебо НЧ в исследуемом диапазоне концентраций (рис. 2). При инкубации клеток U87MG и HepG2 как с субстанцией, так и с наносомальной формой доксорубицина наблюдалось достоверное снижение жизнеспособности клеток во всем дипазоне концентраций (рис. 3, 4). При этом цитотоксический эффект доксорубицина, высвободившегося из НЧ, был сравним с действием субстанции доксорубицина.
Определение гемосовместимости
Оценка влияния НЧ на свертывающую систему крови. Характер и особенность взаимодействия НЧ
76 Оригинальные статьи
HepG2
□ LLC-PC □ U87MG
120
-о
•S 120
О 100
80
60
40
20
200
400
500
•d 60
о О
40 20 0
XX
-t.
XX
■ Dox-PLGA □ Доксорубицин /Dox
0,004 0,021 0,1
0,54 1,34 2,68
й
67
100
80
4? >
о
У oi О CJ
liS 60 .a
40
20
■ Dox-PLGA
№
□ Доксорубицин / Dox
1+1
хх
хх
0,1
1
10
40
80
Концентрация, мкг / мл/Concentration, цд/ml
Рис. 2. Анализ жизнеспособности клеток U87MG, HepG2 и LLC-PC после 24 ч инкубации с PLGA-плацебо наночастиц (MTS-тест; среднее значение ± SD; n = 3)
Fig. 2. Viability of U87MG, и LLC-PC cells after 24 h of incubation with PLGA-Placebo NPs (MTS ass;; mean ± SD; n = 3)
16200 14000 2800
Концентрация, мкг / мл/Concentration, цд/ml
Рис. 3. А°нализ жизнеспособности клеток U87MG после 24 ч инкубации с PLGA наночастиц, нагруженных доксорубицином, и свободным доксорубицином. Концентрация в пересчете на доксорубицин (среднее значение ± SD; n = 4); *p <0,05; **p <0,01
Fig. 3. Cdl viability assay (MTS-assay) for U87MG cells after 24 h of in-cubationvith different concentrations of Dox-PLGA NPs and doxorubicin in soluti00 (mean ± SD; n = 4); *p <0.0X; **p <0.01. Concentrations are indicatedcorresponding to free doxorubicin
с компонентами крови определяется их состхвом и физико-химическими параметрами (размером, зарядом, формой, поверхностной модификацией) [26, 34—37]. В настоящем исследовании тромбогенные свойства НЧ оценивали по их влиянию на уровень активации тромбоцитов и время свертывания крови после ее инкубации с НЧ.
Определение ПВ. Для оценки возможного влияния наносомальной формы доксорубицина на время коагуляции плазмы крови человека использовали стандартный тест определения ПВ.
Как видно из табл. 2, НЧ в исследуемом диапазоне концентраций не оказывают влияния на время коагуляции плазмы. Показатель ПВ находится в пределах стандартных значений и статистически не отличается от значения для контрольных образцов. В норме показатель ПВ составляет 11—15 с (100 % активность всех факторов протромбинового комплек-
Концентрация, мкг / мл/Concentration, цд/ml
Рис. 4. Анализ жизнеспособности клеток HepG2 после 24 ч инкубации с PLGA наночастиц, нагруженных доксорубицином, и свободным доксорубицином (среднее значение ± SD; n = 3); *p <0,05; **p <0,01. Конщнтрация в пересчете на доксорубицин
Fig. 4. Cell viability assay (MTS-assay) for HepG2 cells after 24 h of incubation with Dox-PLGA NPs and doxorubicin in solution (mean ± SD; n = 3); *p <0.05; **p <0.01. Concentrations are indicated corresponding to free doxon/dcm
са), при этом физиологически значимый показатель имеет увеличение ПВ в 2 раза по сравнению с контрольной плазмой [26]. Полученные данные совпадают с большинством исследований, подтверждающих безопасность PLGA НЧ [6, 19, 35, 38].
Таблица 2. Время коагуляции плазмы крови (протромбиновое время) после инкубации с наночастицами. Контроли 1 и 2 — время коагуляции плазмы крови сразу и через 30 мин после забора (среднее значение ± SD; n = 3)
Table 2. Prothrombin time after plasma incubation with nanoparticles. Contro0s 1 and 2 — PT of blood samples immediately and 30 min after withdrawal, respectively (mean value ± SD; n = 3)
Образец Концентрация наночастиц, мкг/мл Протромбиновое время, с
N30 opartides concentration, ^g/ml
Контроль 1 14 85 Control 1
Контроль 2 14 95 Control 2
PLGA-пла-цебо PLGA-Placebo 1 14,15
10 14,55
100 14,90
PLGA-доксо- рубицин PLGA-Dox 1 14,65
10 14,20
100 15,20
Определение активации тромбоцитов. Определение активации тромбоцитов после контакта плазмы крови с НЧ является еще одним параметром оценки
0
Оригинальные статьи 77
гемосовместимости НЧ [35]. Тромбоциты представляют собой клеточные компоненты коагуляционной системы, их активация является важнейшим фактором в запуске и регуляции гемостаза [39, 40].
В табл. 3 показана доля (%) активированных тромбоцитов для PLGA-плацебо НЧ и Dox-PLGA НЧ. Добавление индуктора активации тромбоцитов (аде-нозиндифосфат) значительно увеличило экспрессию P-селектина — основного компонента, обеспечивающего агрегацию [41, 42], и, соответственно, активацию тромбоцитов (положительный контроль). Количество клеток, экспрессирующих P-селектин в отсутствие активации, составило не более 10 %, в то время как в положительном контроле данный показатель составлял 65—70 %, что подтверждает избирательную экспрессию Р-селектина только активированными тромбоцитами. Dox-PLGA НЧ в диапазоне концентраций 1—10 мкг/мл не оказывали значитель-
Таблица 3. Уровень активации тромбоцитов (уровень экспрессии P-селектина) после инкубации плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (PRP) с PLGA наночастиц, обогащенных доксорубицином, и PLGA-плацебо наночастиц. В качестве отрицательного контроля использовали PRP; в качестве положительного контроля использовали PRP + аденозиндифосфат (среднее значение ± SD; n = 3) Table 3. Level of platelet activation (P-selectin expression) after platelet-rich plasma incubation with Dox-PLGA and PLGA-Placebo nanoparticles. Platelet-rich plasma was used as negative control; Platelet-rich plasma + ADP was used as positive control (mean value ± SD; n = 3)
Образец Sample концентрация на-ночастиц, мкг/мл Nanoparticles concentration, ^g/ml Уровень экспрессии Р-селектина, % expression, %
Отрицательный контроль (PRP) Negative control (PRP) - S,90
Положительный контроль (PRP + ADP) Positive control (PRP + ADP) - 65^3
0,1 11,32
PLGA-плацебо 1 4,23
PLGA-Placebo 10 S,24
100 12,75
0,1 S,S0
Доксоруби-цин-PLGA Dox-PLGA 1 5,60
10 11,91
100 14^1
ного влияния на уровень экспрессии P-селектина относительно отрицательного контроля (PRP). При концентрации НЧ 100 мкг/мл наблюдалась незначительная активация тромбоцитов (~7 % относительно контроля). Интересно, что такая же тенденция отмечалась и для пустых PLGA-плацебо НЧ. Полученные результаты коррелируют с данными других авторов, изучавших биосовместимость полилактидных наночастиц [19, 39, 41].
Оценка гемолиза. Тест определения гемолиза — это один из наиболее часто применяемых тестов для определения биосовместимости внутривенно введенных материалов с компонентами крови, характеризующийся наибольшей корреляцией с результатами экспериментов in vivo [40]. Параметром, определяющим гемолитическую активность НЧ, является их способность взаимодействовать с мембраной эритроцитов, изменять ее проницаемость и вызывать гемолиз. Повреждение мембраны эритроцитов может спровоцировать тяжелые физиологические последствия, такие как гемолитическая анемия, кроме того, высвободившийся гемоглобин является токсическим соединением для крови [43].
Из данных, представленных в табл. 4, видно, что пустые PLGA-плацебо НЧ не оказывали гемолитического воздействия после инкубации с образцами крови в течение 3 ч во всем диапазоне концентраций. Незначительное цитотоксическое воздействие Dox-PLGA НЧ на эритроциты было отмечено лишь для максимальной исследованной концентрации 100 мкг/мл, превышающей прогнозируемые концентрации при клиническом применении препарата. Полученные данные подтверждают результаты C. Fornaguera и со-авт., показавших гемосовместимость PLGA НЧ различного состава [19].
Таблица 4. Процент гемолиза после инкубации крови с PLGA наночастиц, обогащенных доксорубицином, и PLGA-плацебо наночастиц в различных концентрациях
Table 4. Percentage of hemolysis after incubation of blood samples with Dox-PLGA NP and PLGA-placebo NP in different concentration
Образец
Примечание. PRP — плазма, обогащенная тромбоцитами. Note. PRP — platelet-reach plasma.
PLGA-плацебо PLGA-Placebo
Доксоруби-цин-PLGA Dox-PLGA
концентрация нч, мкг/мл Гемолиз, %
Nanoparticles concentration, Hemolysis, %
^g/ml
1 0,17
10 0,41
100 0,9S
1 0,55
10 1,25
100 6,9S
78
Оригинальные статьи
Изучение интернализации наночастиц
Было выявлено, что Dox-PLGA-Cy5.5 и PLGA-DiI НЧ активно захватываются клетками глиобластомы U87MG, при этом PLGA-Cy5.5 НЧ, нагруженные доксорубицином (Dox-PLGA-Cy5.5), более эффективно интернализуются клетками по сравнению с PLGA НЧ, меченными Dil. Так, через 1 ч инкубации было обнаружено 50 % PLGA-DiI-положительных клеток, тогда как при инкубации клеток с Dox-PLGA-Cy5.5 НЧ в той же концентрации количество Су5.5-по-ложительных клеток достигало 90 %. То есть PLGA-DiI НЧ с большим отрицательным зарядом (—30,8 мВ) менее эффективно захватываются клетками, чем более нейтральные Dox-PLGA-Cy5.5 НЧ (-14,9 мВ), в которых доксорубицин частично компенсирует отрицательный заряд полимера. Действительно, согласно данным литературы положительно заряженные частицы более эффективно связываются с отрицательно заряженной клеточной мембраной [27, 44, 45]. В свою очередь, интенсивность флуоресценции и концентрация Су5.5^П-положительных клеток увеличивалась со временем (рис. 5).
Заключение
В настоящей работе продемонстрировано отсутствие цитотоксического действия PLGA-плацебо НЧ на клеточные линии LLC-PK и HEPG2. При инкубации клеток глиобластомы человека U87MG и ге-патоцеллюлярной карциномы HepG2 как с субстанцией, так и с наносомальной формой доксорубицина, наблюдалось достоверное снижение жизнеспособности клеток; при этом цитотоксический эффект
Dox-PLGA-Cy5.5 О PLGA-Dil
120
х К100
Ф §
£ S3
£ о.
s ==
g Q
g 1
80
60
£ 40
C
о
20
g 5 15 30 60 120 180 240 300
>§ Время инкубации, мин / Incubation time, min
Рис. 5. Относительное содержание Cy5.5и DiI-положительнъа клеток U87MG (%) в зависимости от времени их инкубации с наночастица-ми; концентрация наноччастиц — 40 мкг/мл (среднее значение ± SD; n = 3)
Fig. 5. Percentage of Cy5.5 and DiI-positive U87MG (%) cells depending on cell incubation time with NP; NP concentration 40 mcg/ml (mean ± SD; n = 3)
доксорубицина, высвободившегося из НЧ, был сравним с действием субстанции доксорубицина. Результаты проточной цитометрии показали, что наносомальная форма доксорубицина активно захватывается клетками глиобластомы человека.
Исследования гемосовместимости подтвердили безопасность применения Dox-PLGA НЧ: НЧ не оказывали влияния на свертывающую систему крови (не изменяли время свертывания плазмы крови, не индуцировали активацию тромбоцитов) и не оказывали цитотоксического воздействия на эритроциты.
0
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Щербаков А.И. и др. Разработка модели противоопухолевой липосомаль-ной вакцины. Иммунология 2014;35(6):317—21. [Afanasieva D.A., Baryshnikova M.A., Shcherbakov A.I.
et al. The development of anticancer liposomal vaccine model. Immunolo-giya = Immunology 2014;35(6):317-21 (In Russ.)].
2. Weissig V., Pettinger T.K., Murdock N. Nanopharmaceuticals (part 1): products on the market.
Int J Nanomedicine 2014;9:4357-73. DOI: 10.2147/IJN.S46900.
3. Pathak Y., Thassu D. Drug delivery nanoparticles formulation and characterization. Boca Raton, USA, CRC Press, 2009, 416 р.
4. Wang A.Z., Langer R., Farokhzad O.C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs.
Annu Rev Med 2012;63(1):185-98. DOI: 10.1146/annurev-med-040210-162544.
5. Makadia H.K., Siegel S.J. Poly lactic-co-glycolic acid(PLGA) as biodegradable controlled drug delivery carrier. Polymers (Basel) 2011;3(3):1377-97.
DOI: 10.3390/polym3031377.
6. Lu J.M., Wang X., Marin-Muller C.
et al. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert Rev Mol Diagn 2009;9(4):325-41. DOI: 10.1586/erm.09.15.
7. Mundargi R.C., Babu V.R., Rangas-wamy V. et al. Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(D, L-lactide-co-gly-colide) and its derivatives. J Control Release 2008;125(3):193-209.
DOI: 10.1016/j.jconrel.2007.09.013.
8. Shive M.S., Anderson J.M. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv Drug Deliv Rev 1997;28(1):5-24. DOI: 10.1016/S0169-409X(97)00048-3.
9. Szymonowicz M., Rybak Z., Witkiewicz W. et al. In vitro hemo-compatibility studies of (poly-(L-lactide) and poly(L-lactide-co-glycolide)
as materials for bioresorbable stents manufacture. Acta Bioeng Biomech 2014;16(4):131-9. DOI: 10.5277/ABB-00055-2014-03. 10. Landes C.A., Ballon A., Roth C.
Maxillary and mandibular osteosyntheses with PLGA and P(L/DL)LA implants: a 5-year inpatient biocompatibility and degradation experience. Plast Reconstr Surg 2006;117(7):2347-60. DOI: 10.1097/01. prs.0000218787.49887.73.
11. Mau L.P., Cheng C.W., Hsieh P.Y., Jones A.A. Biological complication
in guided bone regeneration with a poly-lactic acid membrane: a case report. Implant Dent 2012;21(3):171-4. DOI: 10.1097/ID.0b013e31824eece1.
12. Майбородин И.В., Кузнецова И.В., Береговой Е.А и др. Отсутствие полной резорбции полилактидного материала в организме. Новости хирургии 2014;22(1):26-32. [Maiborodin I.V., Kuznetsova I.V., Beregovoy E.A. et al. Absence of complete resorption of poly-lactide material in the organism. Novosti khirurgii = Surgery News 2014;22(1):26-32. (In Russ.)].
13. Gentile P., Chiono V., Carmagnola I., Hatton P.V. An overview of poly(lac-tic-co-glycolic)acid(PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. Int J Mol Sci 2014;15(3):3640-59.
DOI: 10.3390/ijms15033640.
14. Pérez-Herrero E., Fernandez-Medarde A. Advanced targeted therapies in cancer: drug nanocarriers, the future
of chemotherapy. Eur J Pharm Biopharm 2015;93:52-79.
DOI: 16.1016/j.ejpb.2015.03.018.
15. Tariq M., Alam M.A., Singh A.T. et al. Biodegradable polymeric nanoparticles for oral delivery of epirubicin: in vitro, ex vivo, and in vivo investigations. Colloids Surf B Biointerfaces 2015;128:448-56.
DOI: 10.1016/j.colsurfb.2015.02.043.
16. Derakhshandeh K., Soheili M., Dadashzadeh S., Saghiri R. Preparation and in vitro characterization of 9-nitrocamptothecin-loaded long circulating nanoparticles for delivery
in cancer patients. Int J Nanomedicine
2010;5:463-71.
DOI: 10.2147/IJN.S11586.
17. Derakhshandeh K., Hosseinalizadeh A., Nikmohammadi M. The effects
of PLGA microparticles on intestinal absorption of p-glycoprotein substrate using the everted rat intestinal sac model. Arch Pharm Res 2011;34(11):1989-97. DOI: 10.1007/s12272-011-1120-1.
18. Sobot D., Mura S., Couvreur P. Nanoparticles: Blood Components interaction. Encyclopedia of polymeric nanomaterials, 2015, 1352 p.
DOI: 10.1007/978-3-642-29648-2_227.
19. Fornaguera C., Caldero G., Mitjans M. et al. Interactions of PLGA nanoparticles with blood components: protein adsorption, coagulation, activation
of the complement system and hemolysis studies. Nanoscale 2015;7(14):6045-58. DOI: 10.1039/c5nr00733j.
20. Kim D., El-Shall H., Dennis D., Morey T. Interaction of PLGA nanopar-ticles with human blood constituents.
Colloids Surf B Biointerfaces 2005;40(2):83-91.
DOI: 10.1016/j.colsurfb.2004.05.007.
21. Fornaguera C., Solans C. Methods
for the in vitro characterization of nano-medicines - biological component interaction. J Pers Med 2017;7(1):2. DOI: 10.3390/jpm7010002.
22. Rahimian S., Fransen M.F., Kleino-vink J.W. et al. Particulate systems based on poly(lactic-co-glycolic)acid(pLGA) for immunotherapy of cancer. Curr Pharm Des 2015;21(29):4201-16. DOI: 10.2174/1381612821666150901100247.
23. Desai N. Challenges in development of nanoparticle-based therapeutics. AAPS J 2012;14(2):282-95.
DOI: 10.1208/s12248-012-9339-4.
24. Gelperina S., Maksimenko O., Khalan-sky A. et al. Drug delivery to the brain using surfactant-coated poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: influence of the formulation parameters. Eur J Pharm Biopharm 2010;74(2):157-63.
DOI: 10.1016/j.ejpb.2009.09.003.
25. Wohlfart S., Khalansky A.S., Gelperina S. et al. Efficient chemotherapy of rat glioblastoma using doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles with different stabilizers. PloS one 2011;6(5):e19121. DOI: 10.1371/journal.pone.0019121.
26. Rejman J., Oberle V., Zuhorn I.S., Hoekstra D. Size-dependent internaliza-tion of particles via the pathways
of clathrin-and caveolae-mediated endo-cytosis. Biochem J 2004;377(1):159-69. DOI: 10.1042/BJ20031253.
27. Hillaireau H., Couvreur P. Nanocarriers' entry into the cell: relevance
to drug delivery. Cell Mol Life Sci
2009;66(17):2873-96.
DOI: 10.1007/s00018-009-0053-z.
28. Fehrenbacher N., Jäättelä M. Lysosomes as targets for cancer therapy.
Cancer Res 2005;65(8):2993-5. DOI: 10.1158/0008-5472. CAN-05-0476.
29. Ilinskaya A.N., Dobrovolskaia M.A. Nanoparticles and the blood coagulation system. Part II: safety concerns. Nano-medicine 2013;8(6):969-81.
DOI: 10.2217/nnm.13.49.
30. Gunness P., Aleksa K., Kosuge K. et al. Comparison of the novel HK-2 human renal proximal tubular cell line
with the standard LLC-PK1 cell line in studying drug-induced nephrotoxicity. Can J Physiol Pharmacol 2010;88(4):448-55. DOI: 10.1139/y10-023.
31. Ramirez T., Strigun A., Verlohner A. et al. Prediction of liver toxicity and mode of action using metabolomics in vitro in HepG2 cells. Arch Toxicol 2018;92(2):893-906.
DOI: 10.1007/s00204-017-2079-6.
32. Wolff J.E., Trilling T., Mölenkamp G. et al. Chemosensitivity of glioma cells in vitro: a meta analysis. J Cancer Res Clin Oncol 1999;125(8-9):481-6. DOI: 10.1007/s004320050305.
33. Clark M.J., Homer N., O'Connor B.D. et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet 2010;6(1):e1000832.
DOI: 10.1371/journal.pgen.1000832.
34. Chittasupho C., Xie S.X., Baoum A. et al. ICAM-1 targeting of doxorubi-cin-loaded PLGA nanoparticles to lung epithelial cells. Eur J Pharm 2009;37(2):141-50.
DOI: 10.1016/j.ejps.2009.02.008.
35. Lundqvist M., Stigler J., Elia G. et al. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105(38):14265-70.
DOI: 10.1073/pnas.0805135105.
36. Aggarwal P., Hall J.B., McLeland C.B. et al. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Adv Drug Deliv Rev 2009;61(6):428-37.
DOI: 10.1016/j.addr.2009.03.009.
37. Oslakovic C., Cedervall T., Linse S., Dahlbäck B. Polystyrene nanoparticles affecting blood coagulation. Nanomedicine 2012;8(6):981-6. DOI: 10.1016/j.nano.2011.12.001.
38. Neun B.W., Dobrovolskaia M.A. Method for in vitro analysis of nanoparticle thrombogenic properties. Methods Mol Biol 2011;697:225-35.
DOI: 10.1007/978-1-60327-198-1_24.
39. Li X., Radomski A., Corrigan O.I. et al. Platelet compatibility of PLGA, chitosan and PLGA-chitosan nanoparticles. Nanomedicine (Lond) 2009;4(7): 735-46. DOI: 10.2217/nnm.09.65.
40. Jackson S.P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood 2007;109(12):5087-95.
DOI: 10.1182/blood-2006-12-027698.
41. Cenni E., Granchi D., Avnet S. et al. Biocompatibility of poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles conjugated with alendronate. Biomaterials 2008;29(10):1400-11. DOI: 10.1016/ j.biomaterials.2007.12.022.
42. Merten M., Thiagarajan P. P-selectin expression on platelets determines size and stability of platelet aggregates. Circulation 2000;102(16):1931-6. DOI: 10.1161/01.CIR.102.16.1931.
43. Bosi S., Feruglio L., da Ros T. et al. Hemolytic effects of water-soluble fullerene derivatives. J Med Chem 2004;47(27):6711-5.
DOI: 10.1021/jm0497489.
44. Bannunah A.M., Vlasaliu D., Lord J., Stolnik S. Mechanisms of nanoparticle internalization and transport across an intestinal epithelial cell model: effect of size and surface charge. Mol Pharm
2014;11(12):4363-73. DOI: 10.1021/mp500439c.
doxorubicin and its in vitro evaluation as potent drug delivery vehicle. Drug Deliv Transl Res 2013; 3(4):299-308.
DOI: 10.1007/s13346-012-0124-9.
45. Kumar R., Kulkarni A., Nabulsi J. et al. Facile synthesis of PEGylated PLGA nanoparticles encapsulating
Вклад авторов
Ю.А. Малиновская: получение данных для анализа, анализ полученных данных, написание текста рукописи;
Е.И. Коваленко: разработка дизайна исследования по изучению гемосовместимости, анализ полученных данных;
Т.С. Ковшова: физико-химический анализ наночастиц, изучение профиля высвобождения лекарственного вещества;
Н.С. Осипова: получение наночастиц с доксорубицином, разработка синтеза флуоресцентно-меченных наночастиц;
О.О. Максименко: разработка метода получения наночастиц-плацебо и наночастиц, нагруженных доксорубицином, оптимизация
параметров наночастиц;
В.Ю. Балабаньян: анализ полученных данных;
B.А. Разживина: руководство доклиническими исследованиями наносомального доксорубицина, разработка и утверждение дизайна исследования;
М.В. Гречихина: разработка методики определения цитотоксичности наночастиц;
А.А. Бойко: разработка методики оценки влияния наночастиц на свертывающую систему крови, активацию тромбоцитов и оценку токсического действия наночастиц на эритроциты;
C.Э. Гельперина: общее руководство проектом, анализ полученных данных. Authors' contributions
Yu.A. Malinovskaya: data collection and analysis, writing the manuscript;
E.I. Kovalenko: designing the study of hemocompatibility, data analysis;
T.S. Kovshova: physicochemical analysis of nanoparticles, studying a profile of drug release;
N.S. Osipova: obtaining nanoparticles with doxorubicin, developing synthesis of fluorescently-labeled nanoparticles;
O.O. Maksimenko: developing a method to obtain placebo nanoparticles and doxorubicin loaded nanoparticles, optimizing nanoparticle parameters V.Yu. Balabanyan: data analysis;
V.A. Razzhivina: head of preclinical studies of nanosomal form of doxorubicin, developing and approving the study design; M.V. Grechikhina: developing a method to determine nanoparticles cytotoxicity;
A.A. Boyko: developing a method to assess nanoparticles effect on blood coagulation system, platelet activation, and assessment of nanoparticles toxic effect on red blood cells;
S.E. Gelperina: head of the project, data analysis.
ORCID авторов/ORCID of authors
Ю.А. Малиновская/Yu.A. Malinovskaya: https://orcid.org/0000-0002-9771-3992
Е.И. Коваленко/E.I. Kovalenko: https://orcid.org/0000-0001-8119-8247
Т.С. Ковшова/T.S. Kovshova: https://orcid.org/0000-0002-0398-4645
Н.С. Осипова/N.S. Osipova: https://orcid.org/0000-0002-2814-9064
О.О. Максименко/O.O. Maksimenko: https://orcid.org/0000-0002-1230-4680
B.Ю. Балабаньян/v.Yu. Balabanyan: https://orcid.org/0000-0002-5744-7060
C.Э. Гельперина/S.E. Gelperina: https://orcid.org/0000-0003-1113-6715 А.А. Бойко/А.А. Boiko: https://orcid.org/0000-0002-8996-2905
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено при поддержке Федеральной целевой программы «Фарма 2020» (Госконтракт № 13411.1008799.13.144).
Financing. This study was supported by the Federal target program "Pharma 2020" (Contract No 13411.1008799.13.144).
Статья поступила: 17.08.2019. Принята к публикации: 19.12.2019. Article submitted: 17.08.2019. Accepted for publication: 19.12.2019.
