CC BY
182Фізика живого, Т. Ї9, No 2, 20ЇЇ. С.5Ї-53.
© ГарманчукЛ. В., Сенчило Н.В., Нікуліна В.В., Деніс Є. О., Непийвода Х.Д., Ніколаєнко Т.В., Остапченко Л.І.
УДК 277.3
ЦИТОТОКСИЧНИЙ ВПЛИВ НА ПУХЛИННІ КЛІТИНИ IN VITRO АГЕНТІВ З ПРОТИПУХЛИННИМ ТА АНТИМЕТАСТАТИЧНИМ ЕФЕКТОМ
Гарманчук Л. В., Сенчило Н.В., Нікуліна В.В., Деніс Є.О., Непийвода Х.Д., Ніколаєнко Т.В., Остапченко Л.І.
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка,
Київ Україна
Надійшла до редакції 28.08.2011
В рамках дослідження проводився in vitro скринінг перспективних протипухлинних агентів, окремо та в комбінованому застосуванні. Для похідних малеміду та дигідропіролу було показано цитотоксичний/цитостатичний вплив на клітинну лінію колоректальної аденокарциноми COLO-205. Біметалічний комплекс з етилендіаміном у комбінації з тейхоєвою кислотою виявились виражено цитотоксичними для культури клітин MCF-7. Було відмічено, що агенти, яким властивий цитотоксичний та антиметастатичний ефект на індукованих моделях пухлин in vivo, подібним чином діють на пухлинні клітини in vitro.
Ключові слова: MCF-7 та COLO-205 клітини, цитотоксичний/цитостатичний скрині.
ВСТУП
Відбір перспективних лікарських засобів серед агентів синтетичного та природного походження спонукає до пошуку та створення тест-систем для ефективного скринінгу та вивчення механізму впливу на біологічні об’єкти, і в першу чергу - на організм людини [1, 2]. Моніторинг речовин на культурах клітин має свої переваги, оскільки дані тест-системи можуть бути відносно легко стандартизовані, що дозволить швидко отримати попередні результати, бути економічно доцільними та не суперечать біоетичним вимогам. На початкових етапах відбору фармакологічних агентів дослідження на культурах клітин є уже практично незамінними, оскільки різноманіття перспективних біологічно активних агентів настільки широке, що визначення первинних механізмів їх впливу на лабораторних тваринах не є раціональним. Використання в якості модельних систем культур клітин, отриманих із різних тканин організму та адаптованих до штучних умов функціонування поза організмом, спрощує процедуру визначення клітинних та молекулярних мішеней впливу різних чинників мікро- та макрооточення. Тому, мета даної роботи полягала у використанні культивованих пухлинних клітин для проведення скринінгу агентів з протипухлинним та антиметастатичним ефектом на моделях індукованого канцерогенезу in vivo.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Клітинні лінії та моделі. COLO-20З-колоректальна аденокарцинома людини [3] МС^-7-аденокарцинома
молочної залози людини [4], люб’язно надані доктором І.Гутом (Лондонський університет).
Агенти: похідне малеміду - 1-(4-СІ-бензил)-3-СІ-4-(СР3-феніламіно)-Ш-пірол-2,5-діон (надалі МІ1), похідне дигідропіролу - 1,4-заміщений 5-аміно-1,2-дигідропірол-3-он (надалі Д1) [5, 6] та комплекси металів з органічними лігандами:
[Си(еп)2][Са2(СИзСОО)б] (РО244), ([^(еп^пС^^о) (РО39), ([Си(еп)2гп(СИзСОО)4]) (РО80),
([Cu(en)2CdBr4]•dmso) (РО252), де еп - етилендіамін, ^80 - диметилсульфоксид, dmf - диметилформамід [7]. Також було використано для дослідження компонент бактеріальної стінки грам позитивних мікроорганізмів тейхоєву кислоту (ТК), очищену із Бґ. аигеш [8]. Цитотоксичність похідних малеміду та дигідропіролу, комплексів металів з органічними лігандами, а також ТК визначали на лініях клітин з використанням МТТ-колориметричного тесту та рутинним підрахунком співвідношення живих та мертвих клітин, за забарвленням останніх трипановим синім.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
В порівняльному цитотоксичному/цитостатич-ному скринінгу МІ1 та Д1 на лінії клітин колоректального раку людини СОЬО-205 було показано, що більшу ефективність проявляє МІ1 (рис.1). Як свідчать наведені дані як для МІ1 так і для Д1 у діапазоні концентрацій від 3,91*10-5 до 1,25мМ, властивий достовірний цитотоксичний/ цитостатич-ний ефект. У зразках клітин, що інкубувались з агентами спостерігалось зменшення кількості клітин на 10-50 % (рис 1), порівняно з відповідним контролем.
Гарманчук Л. В., Сенчило Н.В., Нікуліна В.В., Деніс Є.О., Непийвода Х.Д., Ніколаєнко Т.В., Остапченко Л.І.
Концентрація мМ
Рис.1. Криві виживаності (% від контролю) пухлинних клітин С0Ь0-205 під впливом похідного малеміду (МІ1) та дигідропіролу (Д1).
Виражений цитотоксичний/цитостатичний вплив досліджуваних речовин на культуру клітин людської колоректальної аденокарциноми відповідає результатам досліджень з використанням ДМГ-індукованої моделі колоректального раку у щурів [б].
В наступній серії експериментів було досліджено цитотоксичний/ цитостатичний вплив низки комплексів металів з органічними лігандами по відношенню до клітин МСF-7. Для даних сполук, раніше нами на перещеплюваній моделі карциноми легень Льюїс було зафіксовано протипухлинний та антиметастатичний ефект, який був найбільш виражений для сполуки РО244 [У]. Так, було
виявлено, що в 50% тварин відсутні пухлини; в б3% тварин - метастази, порівняно з контролем. У тварин з експериментальної групи, у яких було виявлено пухлини, гальмування їх росту визначено за співвідношенням об’ємів пухлин цієї групи відносно контрольної, згідно формули (Vk-Ve)/Vk x100%. Цей показник становив б4,У%, і достовірно (p<0,001) відрізнявся від контролю. Що стосується метастазування, то відсоток тварин з метастатичним ураженням в експериментальній групі становив лише 37,5% відносно контрольної групи тварин. Окрім того, у тварин експериментальної групи, в якій виявлено метастази, їх об’єм становив 5,75±0,57 мм3 проти 12,42 ± 1,72 мм3 в контролі, що було в 2 рази меншим (p<0,001). В результаті проведеного скринінгу в системі in vitro на клітинній лінії MCF-7 за кривими виживаності клітин порівняно з контролем (рис.2) було виявлено, що показник ІС50 для сполуки РО244 становив 1,1±0,004х10-5М, в той час як ІС50 для сполук PO39 ([Cu(en)2ZnCl4]dmso), PO172 ([Cu(en)2ZnCl4]dmf), P080 ([Cu(en)2Zn(CH3COO)4]), PO252 ([Cu(en)2CdBr4]dmso), були на порядок вищими і становили 3,25-9,Ух10-4 М.
Крім того на моделі експериментального канцерогенезу було визначено, що застосування РО244 з ТК може бути ефективною схемою
Концентрація сполук (мМ)
Рис.2. Криві виживаності (% від контролю) пухлинних клітин МСР-7 під впливом біметалічних сполук [Си(еп)2гпС14]аш80 (Р039), [Си(еп)2][Са2(СИ3С00)6]
(PO244),
[Cu(en)2Zn(CH3COO)4]
(PO80),
[Cu(en)2CdBr4]dmso (PO252).
протипухлинної терапії, що підтверджено відсутністю пухлин у 67,5% тварин даної групи в порівнянні з контролем (ріст пухлин без терапії) та групами тварин з введенням ТК та РО244, поокремо [9]. У останніх 32,5% тварин параметри росту первинної пухлини відрізнялись від контрольної зниженими темпами та розмірами пухлини. Для визначення механізмів сумісного впливу ТК та РО244 було проведено їх цитотоксичний скринінг на лінії клітин МСБ-7 (рис.3).
Концентрація тейхоєвої кислоти (мг/мл)
0.0005 0.001 0.005 0.01 0 05
і----------1-----------ґ----------1----------<-■
14O
12O-
1OO-
ч:
m
SO
6O-
4O-
2O
O
-"\А
і
5O %
'Є
-в- РО244 ТК
РО244ТК
1
0,01 0,1
Концентрація PO244 (мМ)
Рис.3. Криві виживаності (% від контролю) пухлинних клітин MCF-7 під впливом біметалічного комплексу [Cu(en)2][Cd2(CH3COO)6] (PO244) та тейхоєвої
кислоти (ТК), окремо та комбіновано.
Однак, підсилення цитотоксичного ефекту РО244 за умов додавання ТК по відношенню до пухлинних клітин in vitro не виявлено. Так, при додаванні TK до клітин MCF-7 в декількох дискретних концентраціях стимулює проліферацію клітин, а за даними підрахунку фракції живих та мертвих клітин, посилює їх виживаність (3% мертвих клітин проти 8% в контролі) та знижує апоптичний індекс майже вдвічі. За сумісного застосування РО244 та ТК
ЦИТОТОКСИЧНИЙ ВПЛИВ НА ПУХЛИННІ КЛІТИНИ IN VITRO АГЕНТІВ З ПРОТИПУХЛИННИМ ТА АНТИМЕТАСТАТИЧНИМ ЕФЕКТОМ
цитотоксичний/цитостатичний ефект обумовлено РО244. За попередніми даними, протипухлинний ефект даних сполук в комбінованому застосуванні in vivo обумовлений опосередкованою дією ТК імунокомпетентними клітинами.
ВИСНОВКИ
Отже, в результаті дослідження механізмів протипухлинного та антиметастатичного впливу низки синтетичних сполук в окремому та комбінованому застосуванні на пухлинних клітинах in vitro було виявлено, що сполуки з найбільшою ефективністю протипухлинного впливу in vivo характеризуються найвищими показниками цитотоксичного/цитостатичного впливу in vitro.
Література
1. Alley M.C., Scudiero D.A., Monks P.A., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay // Cancer Research - 1988. - Vol. 48 - Р.589-601.
2. Ackland M.L., van de Waarsenburg S., Jones R. Synergistic antiproliferative action of the flavonols quercetin and kaempferol in cultured human cancer cell lines // In Vivo. - 2005. - Vol.19, №1. - P. 69-76.
3. Semple T.U., et al. Tumor and lymphoid cell lines from a patient with carcinoma of the colon for a cytotoxicity model. Cancer Res. - 1978- 38: 1345-1355.
4. Soule H.D., et al. A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst.- 1973.51: 1409-16.
5. Pat. 22204 (UA). Compound of 1,4-disubstituted 5-amino-1,2-dihydropyrrole-3-one having anticancer activity: G.G. Dubinina, Yu. M. Volovenko - 21.02.2006. Appl. U200601855. 25.04.2007.
6. Lynchak O., Ostrovska G., Rybalchenko V. (2009) Effects of new malemide derivate on the 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis in rats. Gut “GASTRO 2009 UEGW/WCOG, London”. 58: A334.
7. Кокозей В.М., Гарманчук Л.В., Нестерова О.В. та ін. Застосування ацетатного комплексу міді та кадмію з етилендиаміном як протипухлинного та антиметастатичного засобу// Патент на корисну модель №36261 від 27.10.2008
8. Сенчило Н.В. Тейхоєва кислота стафілокока та її імунобіологічні властивості//Автореферат дисертації.-Київ.2004, 22 С.
9. Senchylo N.V., Yavorska N.V., Garmanchuk L.V et al.
Teichoic acid from Staphylococcus aureus increases antitumour and antimetastatic effects of the Heterometallik Cu/Cd complex // 5th International Symposium on
Cell/Tissue Injury and cytoprotection/organoprotection/ Фізіологічний журнал.-2009, т.55,№1.-с.101.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ/ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПРИРОДНЫХ И
СИНТЕТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ НА КУЛЬТИВИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ
Гарманчук Л. В., Сенчило Н.В., Никулина В.В., Денис Е.О., Непийвода Х.Д., Николаенко Т.В., Остапченко Л.И.
В рамках данного исследования проводился in vitro скрининг перспективных противоопухолевых веществ. Тестировались агенты искусственного и натурального происхождения, а так же их комбинации. Среди синтетических агентов для производных малемида и дигидропиролла была продемонстрирована цитотоксическая/цитостатическая активность на клеточной лини колоректальной аденокарциномы COLO-205. Биметалические комплексы с этилендиамином в комбинации с тейхоевой кислотой оказывают цитотоксическое/цитостатическое влияние на культуру MCF-7. Следует отметить, что агенты, для которых характерен цитотоксический и антиметастатический эффект на индуцированных моделях опухолей, сходным образом действуют на опухолевые клетки в культуре.
Ключевые слова: MCF-7 та COLO-205 клетки, цитотоксический/цитостатический скрининг..
DETERMINATION OF CYTOTOXIC/CYTOSTATIC EFFECT NATURAL AND SYNTHETIC AGENTS FOR CULTURED CELLS
Garmanchuk L.V., Senchylo N.V., Nikulina V.V., Denis E.O., Nepiyvoda K.D., Nikolaenko T.V., Ostapchenko L.I.
This research reports on in vitro screening of promising anticancer agents. Natural and synthetic agents were tested. Among synthetic agents, malemid and dehydropirol derivates were investigated, which have shown cytotoxic effect on COLO 205 cell line, bimetallic complexes with etilendiamin in combination with theichoic acid were cytotoxic for MCF-7. Agents have demonstrated cytotoxic and antimetastatic effects in both animal induced cancerogenesis model system and in vitro test system.
Key words: MCF-7 and COLO-205 cells, cytotoxic/cytostatic screening.
