CC BY
16DOI: 10.24412/1999-6780-2022-3-43-47 УДК 616-006:582.288:57.085.23
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ГРИБОВ РОДА FUSARIUM LINK. В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO
^ухаммадиев Рин.С. (н.с.)*, Ъирюля В.В. (в.н.с.), ^Мухаммадиев Риш.С. (н.с.), 2Тимербулатова Л.М. (аспирант), ^Скворцов Е.В. (в.н.с., зав. сектором)
'Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности; 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Представлены данные по исследованию цитотокси-ческих свойств экстрактов микроскопических грибов рода Fusarium в отношении клеточных линий рака молочной железы (MCF-7), рака простаты (PC-3), рака шейки матки (Hela), почек эмбриона (HEK-293) и фибробластов кожи человека (HSF). Методами МТТ-теста и окрашивания трипановым синим с применением культур клеток изучена прямая цитотоксическая активность экстрактов из мицелия микромицетов F. oxysporum, F. culmorum, F. redo-lens, F. sporotrichioides, F. graminearum, F. solani, F. monili-forme F. equiseti. Установлено, что экстракты мицелия микромицетов обладают различной степенью цитоток-сической активности на культуры клеток. Наиболее высокой цитотоксической активностью в отношении исследуемых культур клеток обладал экстракт штамма F. sporotrichioides (1С50 4,7-6,5 мкг/мл). Данная концентрация экстракта была в 1,1-1,5 раза ниже величины IC50 экстракта, который оказывал действие на нормальные клетки. Полученные результаты позволили выявить штамм гриба F. sporotrichioides, который способен стать биопродуцентом для выделения биологически активных веществ с цитотоксическим действием для их дальнейшего изучения в качестве средств лекарственного назначения.
Ключевые слова: микромицеты, Fusarium, экстракт, культура клеток, цитотоксическая активность
Контактное лицо: Мухаммадиев Ринат Салаватович, e-mail: [email protected]
CYTOTOXIC ACTIVITY OF EXTRACTS FROM FUSARIUM LINK. FUNGI AGAINST HUMAN CELLS LINES IN VITRO
^uhammadiev Rin.S. (scientific researcher), ^iryulya V.V. (leading scientific researcher), ^uhammadiev Rish.S. (scientific researcher), 2Timerbulatova L.M. (postgraduate student), ^kvortsov E.V. (leading scientific researcher, head of the sector)
'Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety; 2Kazan Federal University, Kazan, Russia
Data on the study of the cytotoxic properties of extracts of fungi of the genus Fusarium against human breast cancer (MCF-7), prostate cancer (PC-3), cervical cancer (Hela), embryonic kidney (HEK-293) and skin fibroblast (HSF) cell lines are presented. Based on the MTT assay and the trypan blue staining cytotoxic effect of extracts of fungi F. sporotrichioides, F. redolens, F. solani, F. equiseti, F. oxysporum, F. culmorum, F. moniliforme, F. graminearum was determined. All extracts showed varying degree of cytotoxic effect against human cells lines. Isolate of F. sporotrichioides showed strong cytotoxic activity (IC50 4,7-6,5 fig/ml). This extract concentration was 1.11.5 times lower than IC50 of the extract, which had an effect on normal cells. The obtained results made it possible to detect a strain of the fungus F. sporotrichioides, capable of becoming a bioproducer for the isolation of biologically active substances with a cytotoxic effect for the purpose of theirfurther study as a medical agent.
Key word: micromycetes, Fusarium, extract, cell culture, cytotoxic activity
ВВЕДЕНИЕ
Среди большого количества исследуемых биологических объектов в последнее время микромицеты вызывают немалый интерес исследователей. В первую очередь это связано с тем, что большинство микромицетов способно к синтезу различных биологически активных веществ [1]. Описаны свойства более чем тысячи метаболитов микроскопических грибов, таких как аминокислоты, фитогормоны, витамины, гидролитические ферменты, антибиотики и токсины, широко применяющиеся в различных отраслях промышленности [1, 2]. Показаны противовирусные, антибактериальные, противогрибковые, антиоксидантные, иммуномодулирующие, противо-
малярийные и многие другие свойства экстрактов микромицетов [1, 3-5]. Микроскопические грибы обладают значительным видовым потенциалом и способностью к активному росту и размножению [1]. Их потенциал огромен, постоянно обнаруживаются новые вещества с уникальными биологическими и терапевтическими свойствами.
В настоящее время особое внимание исследователи уделяют способности микромицетов к биосинтезу биологически активных соединений, обладающих цитотоксической активностью в отношении различных опухолевых клеток [4, 5]. В литературных источниках о противоопухолевых свойствах веществ микромицетов показано выраженное токсическое действие экстрактов и отдельных полученных их соединений в отношении культур раковых клеток [2, 4, 5]. Ряд веществ микромицетов, полученных в чистом виде, проходят клинические испытания как противоопухолевые средства [3]. Однако клинические исследования некоторых препаратов были остановлены из-за их высокой токсичности или отсутствия эффективности. В связи с этим актуальным становится поиск новых веществ грибкового происхождения, которые могут найти применение в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.
Цель исследования: оценить способность различных видов грибов рода Fusarium к синтезу веществ с цитотоксической активностью в их мицели-ях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являлись микроскопические грибы рода Fusarium, находящиеся в музеях культур микроорганизмов лаборатории пробиотиче-ских препаратов и ферментов отдела биотехнологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ ФЦТРБ-ВНИВИ) и кафедры биохимии, биотехнологии и фармакологии Казанского (Приволжского) федерального университета (ФГАОУ ВО КФУ). Клеточные линии были предоставлены из коллекции клеточных культур Научно-образовательного центра фармацевтики К(П)ФУ. Мицелий изучаемых микро-мицетов получали культивированием штаммов на жидкой картофельно-глюкозной питательной среде, содержащей (г/л) картофель - 200,0, глюкозу - 20,0, с перемешиванием, при температуре 28 °С. Отбор проб мицелия микромицетов проводили на 8-ые сутки выращивания изолятов.
Грибной материал предварительно фильтровали через стерильную нейлоновую ткань, затем тщательно промывали стерильной дистиллированной водой и 20 мМ Tris-HCl буфером (рН 7,2). Гомогенизацию биомассы мицелия осуществляли механическим измельчением его в 20 мМ Tris-HCl буфере (рН 7,2) в соотношении 1:1. Для более полного из-
влечения веществ однородную массу оставляли при перемешивании в течение 6-7 часов при температуре 4 °С, осадок отделяли центрифугированием (3000 g, 4 °С, 15 минут). Супернатант анализировали на наличие белка методом спектрофотометрии и веществ, обладающих цитотоксической активностью.
Культивирование линий клеток, оценку цито-токсичности экстрактов штаммов микромицетов методами МТТ-теста и окрашивания трипановым синим проводили, как описано ранее [6, 7].
Влияние экстрактов микромицетов на клетки устанавливали через 72 часа совместной инкубации. Концентрация общего белка экстрактов в реакционных смесях составляла 2,4-10000 мкг/мл при использовании МТТ-теста и 10000 мкг/мл - метода окрашивания трипановым синим.
Цитотоксическое действие экстрактов на клеточные линии в условиях in vitro выражали через 1С50, наименьшая концентрация общего белка экстракта (мкг/мл), которая вызывает 50% ингибирова-ние роста клеток. Контролем являлись клетки, инкубированные без добавления исследуемого экстракта.
Изучение морфологии культур клеток осуществляли после совместной инкубации тест-культуры и экстракта с использованием оптического микроскопа Zeiss Axio Vert.Al («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия).
Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики, используя программное обеспечение Microsoft Office Excel 2013. Статистическую достоверность разницы между группами определяли по t-критерию Стьюдента для независимых переменных. Достоверными считали различия показателей в сравниваемых группах при 95 % доверительной вероятности (p < 0,05). Значения 1С50 определяли на основе дозозависимых кривых с применением программы OriginТМ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки цитотоксической активности экстрактов из микромицетов использовали 5 клеточных линий: PC-3 (аденокарцинома простаты человека), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), Hela (аденокарцинома шейки матки), HSF (фиб-робласты кожи человека), HEK-293 (почки эмбриона человека).
В таблице 1 представлены данные определения цитотоксической активности экстрактов из мицелия различных штаммов грибов рода Fusarium, полученные методом окрашивания трипановым синим, на культуры клеток. Тест предполагал выявление наличия или отсутствия культур-специфичного влияния экстрактов микромицетов.
Таблица 1
Цитотоксическая активность экстрактов грибов рода Fusarium к тест-культурам
ЭкстракГЫ"^^^ PC-3 MCF-7 Hela HSF HEK-293
F. sporotrichioides + + + + +
F. sporotrichioides 1 + + + + +
F. sporotrichioides 2 + + + - +
F. sporotrichioides 3 - + + - +
F. redolens + + + + +
F. redolens 1 + + + + +
F. redolens 2 + + + + +
F. redolens 3 + + + + +
F. redolens 4 + + + + +
F. solani + + + + +
F. solani 1 + + + + +
F. solani 2 + + + + +
F. solani 3 + + + + +
F. solani 4 + + + + +
F. solani 5 - - - - -
F. solani 6 + + + + +
F. equiseti + + + + +
F. equiseti 1 + + + + +
F. equiseti 2 + + + + +
F. oxysporum + + + + +
F. oxysporum 1 - - - - -
F. oxysporum 2 + + + + +
F. culmorum - + - - -
F. culmorum 1 + + + + +
F. moniliforme - - - - -
F. graminearum + + + + +
Примечание: + - экстракт обладает токсичностью; обладает токсичностью.
экстракт не
Проведение скрининга экстрактов грибов рода Fusarium на цитотоксическую активность методом окрашивания трипановым синим показало, что большинство штаммов были способны синтезировать вещества, обладающие цитотоксическим действием. Из 26 микроскопических грибов экстракты 2 штаммов не обладали токсическим эффектом на все изучаемые клеточные линии. Экстракты F. spo-rotrichioides 2, F. sporotrichioides 3, F. culmorum и F. moniliforme обладали избирательной токсичностью.
При оценке значений полуингибирующих концентраций экстрактов грибов методом МТТ-теста выявили, что наибольшей активностью обладал экстракт гриба F. sporotrichioides, для которого значения 1С50 в отношении изучаемых культур клеток соответствовали концентрациям 4,8-6,1 мкг/мл (табл. 2).
Таблица 2
Показатели Ю50 экстрактов наиболее активных штаммов грибов рода Fusarium к тест-культурам
Экстракта^ IC50, мкг/мл PC-3 MCF-7 Hela HSF HEK-293
F. sporotrichioides 5,8±0,27* 4,7±0,25* 6,5±0,29 7,1±0,31 6,4±0,28
F. sporotrichioides 1 577,1±22,8 542,4±24,2 590,3±27,4 602,6±25,5 568,0±28,9
F. redolens 4 132,4±5,8 135,7±6,1 128,2±6,2 140,7±5,4 137,2±5,3
F. solani 161,9±6,8 153,9±7,4 185,2±9,1 181,3±8,6 174,7±8,5
F. solani 1 203,8±9,8 208,4±8,6 195,1±7,7 205,6±9,1 189,9±7,2
F. solani 6 65,1 ±2,3 58,4±2,3 59,2±2,7 63,0±2,6 58,7±2,1
F. equiseti 2 200,6±8,7 221,3±9,2 219,4±8,8 197,6±8,1 189,1±7,9
F. oxysporum 2 365,7±15,3 382,5±16,9 354,7±14,6 396,4±14,2 372,9±16,7
F. culmorum 1 643,2±29,9 591,2±26,0 583,4±24,9 634,5±22,7 637,8±28,2
Примечание: * - отличия статистические значимые по сравнению со значением показателя Ю50 экстрактов в отношении линии нормальных клеток HSF и НЕК-293 (р<0,05).
При этом наибольшую чувствительность к экстракту F. sporotrichioides проявляла клеточная культура МСЕ-7 (рак молочной железы), для которой значение 1С50 соответствовало концентрации 4,7±0,25 мкг/мл. Данная концентрация экстракта была в 1,51,4 раза ниже величины 1С50 экстракта, который оказывал действие на нормальные клетки. Величина 1С50 для нормальных клеток НЕК-293 и НБЕ составила 6,4±0,28 и 7,1 ±0,31 мкг/мл соответственно. На ниже представленных микрофотографиях отчетливо наблюдается действие экстракта F. sporotrichioides на линию культур клеток рака молочной железы МСЕ-7 и нормальных клеток почек эмбриона (НЕК-293) человека (Рис. 1, 2).
Рис. 2. Действие экстракта F. sporotrichioides на линию клеток почек эмбриона НЕК-293: а) НЕК-293 (контроль); б) НЕК-293 + экстракт (4,9 мкг/мл); в) НЕК-293 + экстракт (19,5 мкг/мл). Ув. xi ООО
Ранее полученные нами данные и результаты проведенных исследований зарубежных авторов указывают на то, что экстракт F. sporotrichioides содержит вещества трихотеценовой природы, большинство из которых обладает способностью подавлять пролиферацию различных типов клеток рака и вызывать их апоптоз [6-8].
Остальные экстракты микромицетов имели более низкую степень цитотоксической активности по сравнению с экстрактом F. sporotrichioides. Среди них следует отметить экстракт F. moniliforme, не обладающий активностью в отношении всех изучаемых клеточных линии (ГС50 > 1500 мкг/мл). Продукты синтеза данного вида гриба широко применяют в сельском хозяйстве [9, 10].
Полученные результаты согласуются с данными ряда зарубежных исследователей, где установлено, что экстракты грибов рода Fusarium проявляют ци-тотоксический эффект в отношении различных линий клеток [11, 12]. Так, в работе Tenguria R.K. с соавторами по изучению противоопухолевого действия экстракта микромицетов Fusarium oxysporum на культурах клеток MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), A549 (аденокарцинома легкого человека) методом МТТ-теста показано, что зна-
чения ГС50 изучаемого экстракта составляют 31,555,3 мкг/мл [11].
В соответствии с данными Национального института онкологии США (National Cancer Institute, NCI) и Национального института здравоохранения США (National Institutes of Health, NIH) сырой экстракт считается активным, если значение IC50 соответствует <30 мкг/мл после совместного культивирования экстракта с исследуемой клеточной линией в течение 48-72 часов [13]. Данному критерию удовлетворяет экстракт одного изолята микроскопического гриба, а именно штамма F. sporotrichioides, в отношении всех исследуемых клеточных линий (ГС50 4,7-6,5 мкг/мл). Поэтому дальнейший интерес представляет получение индивидуальных веществ цито-токсического действия из экстракта F. sporotrichioides, сравнительное изучение полученных соединений цитотоксического эффекта на паре клеточных линий разных типов (опухолевого и нормального) одного генеза, а также их механизма действия.
ВЫВОДЫ
Поиск различных видов грибов рода Fusarium к биосинтезу соединений с противоопухолевым свойством методами МТТ-теста и окрашивания трипано-вым синим показал, что большинство микромицетов способны к синтезу веществ такого рода. Из 8 изученных видов грибов рода Fusarium можно выделить один штамм, а именно F. sporotrichioides, способный синтезировать в своих мицелиях вещества с высокой степенью цитотоксической активности в отношении линии клеток рака простаты (PC-3), молочной железы (MCF-7), шейки матки (Hela), нормальных клеток почек эмбриона (HEK-293) и фибробластов кожи человека (HSF). Методами МТТ-теста и окрашивания трипановым синим была выявлена менее выраженная цитотоксическая активность экстракта по отношению к нормальным клеткам человека HSF, HEK-293 по сравнению к раковым клеткам PC-3, MCF-7, Hela, что подтверждено результатами, полученными с использованием метода световой микроскопии.
Установлено, что экстракты микроскопических грибов рода Fusarium способны стать источником новых противоопухолевых соединений с целью их дальнейшего изучения и потенциального применения как средств медицинского назначения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Далинова А.А., Салимова Д.Р., Берестецкий А.О. Грибы рода Alternaría как продуценты биологически активных соединений и биогербицидов. Прикладная биохимия и микробиология. 2020; 56 (3): 223-241. [Dolinova A.A., Salimova D.R., Berestetsky A.O. Fungi of the genus Alternaría as producers of biologically active compounds and biogerbicides. Applied biochemistry and microbiology. 2020; 56 (3): 223-241. (In Russ)]. doi: 10.31857/S0555109920030022
2. Серба Е.М., Мочалина П.Ю., Римарева Л.В. и др. Исследование ионного состава биомассы Aspergillus oryzae -продуцента гидролитических ферментов. Микология и фитопатология. 2019; 53 (2): 95-100. [Serba E.M., Mocha-lina P.Yu., Rimareva L.V., et al. Investigation of the ionic composition of biomass of Aspergillus oryzae - producer of hydrolytic enzymes. Mycology and phytopathology. 2019; 53 (2): 95-100. (In Russ)]. doi: 10.1134/S0026364819020090
3. Kornienko A., Evidente A., Vurro M. Towards a cancer drug of fungal origin. Med. Res. Rev. 2015; 35 (5): 937-967. doi: 10.1002/med.21348
4. Bladt T.T., Frisvad J.C., Knudsen P.B., Larsen T.O. Anticancer and antifungal compounds from Aspergillus, Penicillium and other filamentous fungi. Molecules. 2013; 18 (9): 11338-11376. doi: 10.3390/molecules180911338
5. Leylaie S., Zafari D. Antiproliferative and antimicrobial activities of secondary metabolites and phylogenetic study of endophytic Trichoderma species from Vinca plants. Frontiers in Microbiology. 2018; 9: 1484-1500. doi: 10.3389/fmicb.2018.01484
6. Мухаммадиев Рин.С., Мухаммадиев Риш.С., Бирюля В.В. и др. Оценка цитотоксичности трихотецена Fusarium sp. на линию рака молочной железы in vitro. Сибирский онкологический журнал. 2019; 18 (6): 90-95. [Mukham-madiev Rin.S., Mukhammadiev Rish.S., Biryulya V.V., et al.. Evaluation of cytotoxicity of trichothecene Fusarium sp. on the in vitro breast cancer line. Siberian Journal of Oncology. 2019; 18 (6): 90-95 (In Russ)]. doi.org/10.21294/1814-4861-2019-18-6-90-95
7. Мухаммадиев Р.С., Мухаммадиев Р.С., Бирюля В.В. и др. Изучение избирательной чувствительности культур клеток in vitro к действию Т-2 токсина. Ветеринарный врач. 2018; 5: 24-27. [Mukhammadiev R.S., Mukhamadiev R.S., Biryulya V.V., et al. Study of the selective sensitivity of cell cultures in vitro to the action of T-2 toxin. Veterinarian. 2018; 5: 24-27. (In Russ)].
8. Yuan Dong, Guixian Meng, Jian Guo, et al. Preparation of T-2 toxin containing pH-sensitive liposome and its antitumor activity. Molecular Medicine Report. 2020; 22 (5): 4423-4431. doi.org/10.3892/mmr.2020.11531
9. Чуксеев А.А., Якименко И.М., Благородова Е.Н., Барчукова А.Я. Использование регуляторов роста на культуре картофеля. Сб. Вестник научно-технического творчества молодежи Кубанского ГАУ. К., 2017; IV: 265- 269. [Chukseev A.A., Yakimenko I.M., Nobelova E.N., Barsukova A.Ya. The use of growth regulators on potato culture. Sb. Bulletin of Scientific and Technical creativity of the youth of the Kuban State University. K., 2017; IV: 265- 269. (In Russ)].
10. de Oliveira J., Rodrigues C., Vandenberghe L.P., et al. Gibberellic acid production by different fermentation systems using citric pulp as substrate/support. BioMed Research International. 2017; (3): 1-8. doi:10.1155/2017/5191046
11. Tenguria R.K., Firodiya A.D. Cytotoxic activities of endophytic fungi isolated from central region of Madhya Pradesh. Journal of Innovations in Pharmaceuticals and Biological Sciences. 2016; 3: 29-38.
12. Abbas H.K., Yoshizawa T., Shier W.T. Cytotoxicity and phytotoxicity of trichothecene mycotoxins produced by Fusarium spp. Toxicon. 2013; 74: 68-75. doi: 10.1016/j.toxicon
13. Mitrovic T., Stamenkovic S., Cvetkovic V. Antioxidant, antimicrobial and antiproliferative activities of five lichen species. Int. J. Mol. Sci. 2011; 12 (8): 5428-48. doi: 10.3390/ijms12085428
Поступила в редакцию журнала 08.09.2022 Рецензент: И.А. Рябинин
