CC BY
20
PHARMA
ЦИТОПРОТЕКТИВНЫИ И АНТИОКСИДАНТНЫЙ ЭФФЕКТЫ ПРЕПАРАТА «МЕКСИДОЛ-ВЕТ»
НА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И СОБАКИ
(ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)
на правах рекламы
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА :
мексидол-Вет®, тест-система, антиоксидантный, культура клеток
К.В. ЛИСИЦКАЯ,
к.б.н., ветеринарный врач, онколог-морфолог ветеринарной клиники «Биоконтроль», научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований инби, ФиЦ биотехнологии ран, член ESVONC (Европейское сообщество ветеринарных онкологов)
В биологических тест-системах на основе культивируемых клеток линии НТ-29 (аденокар-цинома кишечника человека) и MDCK1 (почка собаки) проведено определение биологических эффектов препарата «Мексидол-Вет» - потенциальных пролиферативных, цитотоксических и антиоксидан-тных в отношении инициатора свободно-радикальных реакций. Показано, что препарат «Мексидол-Вет» оказывает достоверно значимое in vitro про-лиферативное действие при низких концентрациях (0,01-0,5 мМ). Отмечено, что пролиферативные концентрации 0,05-0,5 мМ препарата «Мексидол-Вет» также оказывают достоверное in vitro антиоксидан-тное действие в культивируемых клетках человека и собаки линий НТ-29 и MDCK1.
Введение
Оценка биологических эффектов от различных препаратов, в том числе, лекарственных средств, играет ключевую роль при их разработке и изучении. Для изучения разнообразных биологических эффектов препаратов используют как in vivo эксперименты на лабораторных животных, так и in vitro модельные тест-системы [3].
В последние десятилетия in vitro тест-модели на основе культур клеток находят все более широкое применение в связи с этическими проблемами, возникающими при проведении экспериментов на животных, что особенно характерно для стран США и ЕС. В связи с этим роль исследований на культивируемых клетках в оценке биологически активных препаратов с каждым годом неуклонно возрастает. Модельные системы на основе культивируемых клеток используются для оценки биодоступности, антиок-сидантных, иммуномодулирующих, химиопрофилак-тических, про- и пребиотических и других свойств различных биологически активных веществ [3].
Многочисленные in vitro и in vivo исследования показывают, что препарат «Мексидол» является ингибитором свободнорадикальных процессов, пере-кисного окисления липидов и обладает выраженным
Внешний вид культурального 96-луночного планшета с клетками линии тюСК1. Краевые лунки заполнены культуральной средой DMEM. В центральных лунках - культивируемые клетки в культуральной среде.
антигипоксантным, антиоксидантным, мембранос-табилизирующим и анксиолитическим действиями. Механизм антиоксидантного действия «Мексидола» включает повышение активности эндогенных анти-оксидантных систем, например, фермента суперок-сиддисмутазы, который катализирует дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода. Кроме того, антигипоксическое действие «Мексидола» обусловлено не только его собственными антиокси-дантными свойствами, но и входящим в его состав сукцинатом, который в условиях гипоксии, поступая во внутриклеточное пространство, способен окисляться дыхательной цепью. Однако к настоящему моменту отсутствуют in vitro исследования на культивируемых клетках человека и других млекопитающих, доказывающие антиоксидантное действие препарата «Мексидол-Вет» непосредственно на уровне клеток.
Целью исследования было протестировать биологические эффекты препарата «Мексидол-Вет» in vitro на культивируемых клетках человека и собаки и определить его потенциальное цитотоксическое, про-лиферативное, а также антиоксидантное действия.
Материалы и методы
Для создания биотест-систем использовали две линии культивируемых клеток - аденокарциномы кишечника человека линии НТ-29 и почки собаки линии MDCK1. Образцы линий были закуплены в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Культивирование клеток MDCK1 проводили в среде DМЕМ с добавками 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), стрептомицина и L-глутамина («ПанЭко», Россия). Клетки линии НТ-29 культивировали в среде
Игла МЕМ («ПанЭко», Россия) с 10% ЭТС, добавками L-глутамина и стрептомицина.
Клетки культивировали в гумифицированной атмосфере (5% CO2 при 37°С) в СО2-инкубаторе («Sanyo», Япония) в стерильных условиях культурального бокса. Выращивали клетки в пластиковых культуральных матрасах («Costar», США) с площадью поверхности 150 см2 до достижения монослоя. Проводили пересев клеток каждые 3-4 суток, смену среды - каждые 2 суток. После достижения клетками монослоя проводили пересев клеток с использованием диссоциирующего раствора трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия). Все манипуляции, требующие стерильных условий, проводились в ламинарном шкафу второго класса защиты («Jouan», Франция).
Для определения in vitro цитотоксических и про-лиферативных свойств препарата «Мексидол-Вет» после наращивания необходимой биомассы клетки снимали с поверхности пластиковых культуральных матрасов раствором трипсина-ЭДТА, клеточную суспензию переносили в стерильные конические центрифужные пробирки объемом 50 см3 и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин («Elmi СМ-6», Латвия). Затем удаляли супернатант, к осадку добавляли 5 мл культуральной среды, осторожно смешивали и определяли цитоз клеточной суспензии в гемацитометре. Осуществляли пассаж клеточной суспензии с цитозом 106 клеток/мл на 96-лу-ночные планшеты («Nunc», Дания). Краевые лунки планшета заполняли бесклеточной культуральной средой для создания одинаковых условий влажности во всех опытных лунках планшета. Внешний вид планшета после внесения клеточной суспензии показан на рис. 1.
По истечении 12-24 ч инкубирования в термостате, необходимых для прикрепления клеток к поверхности культурального пластика, из лунок план-
НТ-29
100
3
контроль 0,01
0,1 0,5 1 5
Концентрация препарата, мМ
Рис. 2. Биологические эффекты препарата «Мексидол-Вет» in vitro на культивируемых клетках НТ-29 (18 ч инкубации). Звездочкой (*) указаны значения в лунках, достоверно отличающиеся от контроля.
0
MDCK1
-D о
m Q,
I x
О §
л о К
100 -
контроль 0,01 0,1 0,5 1 5 10
Концентрация препарата, мМ
Рис. 3. Биологические эффекты препарата «Мексидол-Вет» in vitro на культивируемых клетках MDCK1 (18 ч инкубации). Звездочкой (*) указаны значения в лунках, достоверно отличающиеся от контроля.
шета удаляли культуральную среду и вносили 100 мкл препарата «Мексидол-Вет» в концентрациях 0,01-10 мМ. Для разведения препарата использовали стерильный солевой раствор Хэнкса («ПанЭ-ко», Россия). Контролем выступали клетки, которые культивировали в солевом растворе без добавления препарата. Все концентрации препарата и контроль дублировались каждая в шести повторностях. Планшеты инкубировали в термостате в течение 18 ч. Оценивали визуально жизнеспособность клеток на инвертированном микроскопе.
Определение количества жизнеспособных клеток в лунках выполняли с помощью наборов WST-1 («MiUipore», США) по прописям фирмы-изготовителя. С этой целью в лунки вносили 10 мкл стокового раствора WST-1 и инкубировали в течение 4 ч. Определяли оптическую плотность раствора в лунках планшета при длине волны 450 нм и длине волны сравнения 610 нм на планшетном спектрофотометре. Для каждой изучаемой концентрации препарата «Мексидол-Вет» определяли среднее значение оптической плотности и стандартные отклонения. Далее пересчитывали количество жизнеспособных клеток в процентах по отношению к лункам контроля. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программы Microsoft Office Excel 2007.
Для анализа антиоксидантных эффектов из 2% стерильного раствора препарата «Мексидол-Вет» готовили растворы с концентрациями 0,005-0,5 мМ, разбавляя исходный раствор стерильным солевым раствором.
Для определения интенсивности свободноради-кального окисления (СРО) в культуре использовали
флуорохром 2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диа-цетата (DCFH-DA, «Sigma», США). Готовили стоковый раствор DCFH-DA с концентрацией 5 мМ в этиловом спирте. Непосредственно перед введением в лунки планшета из стокового раствора готовили рабочий раствор с концентрацией 10 мкМ на солевом растворе Хэнкса. Индукцию СРО в лунках осуществляли, добавляя в лунки 100 мкл 1 мМ раствор азоинициа-тор свободнорадикальных реакций AAPH (ААПГ, или - 2,2' азобис (2-метилпропионамидин) дигидрохло-рид). С этой целью непосредственно перед внесением в культуру готовили 100 мМ раствор ААРН, из которого получали 1 мМ раствор на солевом растворе Хэнкса.
Для определения in vitro антиоксидантной активности в лунки стерильных черных 96-луночных планшет с высокими адгезивными свойствами поверхности («Brande», США) проводили пассаж 100 мкл клеточной суспензии с цитозом 106 клеток/мл. Краевые лунки планшета заполняли бесклеточной культуральной средой для создания одинаковых условий влажности во всех опытных лунках планшета. Планшет инкубировали в термостате в течение 1224 ч для осаждения клеток и прикрепления клеток к поверхности культурального пластика.
Далее проводили аспирацию содержимого лунок и вносили в лунки 100 мкл раствора препарата «Мексидол-Вет» в концентрациях 0,05-0,5 мМ. В качестве контрольных лунок выступали клетки, инкубированные в присутствии 100 мкл солевого раствора без добавления препарата. Планшет инкубировали в термостате в течение 2 ч, далее аспи-
2
л
о р
О
CL
и
120,0 i
100,0 -
80,0 -
60,0 -
40,0 -
20,0 -
50 мин 60 мин 90 мин
контроль 0,05
0,1 0,2 0,5
Концентрация препарата, мм
Рис. 4. Антиоксидантное действие препарата «Мексидол-Вет» in vitro на культивируемых клетках НТ-29 (2 ч прединкубации).
0
0
20
помни о жизни I memento vivere
рировали содержимое лунок и добавляли 100 мкл рабочего раствора флуорохрома DCFH-DA (30 мин), после чего аспирировали раствор и индуцировали перекисное окисление, внося в лунки 100 мкл рабочего раствора азоинициатора ААРН. Определяли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 528 нм на спектрофотометре-флуориметре «Synergy 2» фирмы BioTek (США) сразу после добавления AAPH («0»), через 30, 60 и 90 минут.
Все исследуемые разбавления препарата «Мекси-дол-Вет» и контроль добавляли в шести повторнос-тях. Рассчитывали среднее значение флуоресценции в лунках опыта и контроля и стандартное отклонение, далее пересчитывали значения флуоресценции в процентах по отношению к значению контроля после 90 мин инкубации, которое считали 100% (солевой раствор).
Результаты и обсуждение
Результаты, полученные при изучении потенциальных цитотоксических и пролиферативных свойств препарата «Мексидол-Вет» в различных концентрациях in vitro на культивируемых клетках аденокарциномы кишечника человека линии НТ-29. представлены на рис. 2. Как видно из представленных данных, препарат «Мексидол-Вет» обладал достоверно значимым пролиферативным действием на клетки линии НТ-29 при самой низкой исследованной концентрации 0,01 мМ. В то же время, при 0,1 мМ препарат не обладал выраженными биологическими эффектами, а повышенные концентрации (0,5-5 мМ) уже вызывали цитотоксический эффект.
Сходные результаты были получены при тестировании биологических эффектов препарата «Мек-сидол-Вет» на культивируемых клетках почки собаки линии MDCK1. Как видно из представленных на рис. 3 данных, препарат оказывал пролифера-тивное действие при самых низких концентрациях (0,01-0,5 мМ), при этом для концентраций 0,1 и 0,5 мМ это действие было достоверно значимым. В то же время, повышение концентрации выше физиологических (5 и 10 мМ) уже оказывало цитотокси-ческий эффект.
Концентрации препарата «Мексидол-Вет», не оказывающие цитотоксических эффектов, были выбраны для дальнейших исследований антиоксидантных свойств. В качестве инициатора радикальных и окислительно-восстановительных процессов в культивируемых клетках использовалось водорастворимое азосоединение ААРН, которое при термическом распаде в присутствии кислорода продуцируют перок-
2
л
о р
О
CL
и
120,0-|
100,0 -
80,0 -
60,0 -
40,0 -
20,0 -
30 мин
■ 60 мин
■ 90 мин
86,0 88,0 832
контроль 0,05
0,1 0,2 0,4
Концентрация препарата, мм
Рис. 5. Антиоксидантное действие препарата «Мексидол-Вет» in vitro на культивируемых клетках MDCK1 (2 ч прединкубации).
сильные радикалы [1]. Выбор данного инициатора связан с его относительной стабильностью в культу-ральной среде и, соответственно, пригодностью для использования в культуральных экспериментах.
Методики регистрации интенсивности СРО непосредственно в клетках многочисленны, и включают методы оценки эффектов от действия оксиданта на уровне оксидативного повреждения структур клетки. Для непосредственной оценки активности СРО в культивируемых клетках использовали дихлороди-гидрофлуоресцеин диацетат, который проникает в клетки и аккумулируется в цитозоле, где под действием эстераз клетки деацетилируется в дихлоро-флуоресцеин (ДХФ). Свободные радикалы (перок-сильный радикал, радикал NO2, карбонат-радикал, гидроксил-радикал) конвертируют нефлуоресцентное соединение в флуорохром с пиком флуоресценции около 525 нм при длине волны возбуждающего света 498 нм. Данный метод получил широкое распространение в связи с относительной простотой, достаточно высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов [1-3].
Результаты, полученные при тестировании антиок-сидантного действия препарата «Мексидол-Вет» in vitro на культивируемых клетках НТ-29, представлены на рис. 4. Как видно из представленных на рис. 4. данных, препарат «Мексидол-Вет» в концентрациях 0,1-0,5 мМ обладал достоверно значимым антиок-сидантным действием, выражающимся в снижении интенсивности СРО после 90 мин инкубации клеток. При этом антиоксидантное действие характеризовалось дозозависимым характером, и самый выра-
0
женный эффект ингибирования СРО был отмечен для концентрации 0,5 мМ, который составил 86,4% ± 3,80% в сравнении с контрольными значениями 100% ± 2,28% (в пересчете на интенсивность флуоресценции контрольных лунок).
Достоверное in vitro антиоксидантное действие препарата «Мексидол-Вет» было выявлено в культуре клеток почки собаки линии MDCK1. Как видно из представленных на рис. 5 данных, препарат в концентрациях 0,05-0,4 мМ обладал достоверно значимым антиоксидантным действием, выражающимся в снижении интенсивности флуоресценции после 90 мин инкубации клеток в дозозависимом характере. Наиболее выраженный эффект ингибирования СРО был отмечен для концентрации 0,5 мМ, который составил 83,2% ± 5,28% в сравнении с контрольными значениями 100% ± 4,92% (в пересчете на интенсивность флуоресценции контрольных лунок).
Заключение
Таким образом, проведенный анализ пролифе-ративного и цитотоксического эффектов препарата «Мексидол-Вет» в двух биологических тест-системах на основе культивируемых клеток НТ-29 (аде-нокарцинома кишечника человека) и MDCK1 (почка собаки) показал, что препарат «Мексидол-Вет» оказывает достоверно значимое in vitro пролифератив-
ное действие при низких концентрациях (0,01-0,5 мМ). Выявлено, что пролиферативные концентрации 0,05-0,5 мМ препарата «Мексидол-Вет» также оказывают достоверное in vitro антиоксидантное действие в культивируемых клетках НТ-29 и MDCK1. Результаты тестирования препарата характеризуются воспроизводимостью в двух культуральных тест-системах на основе клеток человека и собаки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Yokozawa T., Cho E.J., Hara Y., Kitani K. Antioxidative activity of green tea treated with radical initiator 2, 2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride. J Agric Food Chem. 2000; 48 (10): 5068-507.
2. Samaranayaka A.G., Kitts D.D., Li-Chan E.C. Antioxidative and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory potential of a Pacific Hake (Merluccius productus)
fish protein hydrolysate subjected to simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell permeation. J Agric Food Chem. 2010; 58 (3): 1535-1542.
3. Лисицкая К.В., Николаев И.В., Торкова А.А., Попов В.О., Королёва О.В. / Анализ функциональных свойств биологически активных веществ на моделях эукари-отических клеток (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2012; 48 (6): 1-18.
