CC BY
53
12. Pölitz J.C., Hogan E.M., Pederson T. MicroR-NAs with a nucleolar location // RNA. - 2009. - № 15. -P. 1705-1715.
13. Tian X.S., Zhou F., Yang R. Effects of intracere-broventricular injection of delta-opioid receptor agonist TAN-67 or antagonist naltrindole on acute cerebral isch-
emia in rat // Sheng Li Xue Bao. - 2008. - Vol. 60, №> 4. -P. 475-484.
14. Wei R., Zhang R., Xie Y., Shen L., Chen F. Hydrogen suppresses hypoxia/reoxygenation-induced cell death in hippocampal neurons through reducing oxidative stress // Cell Physiol. Biochem. - 2015. - Vol. 36, №> 2. - P. 585-598.
Координаты для связи с авторами: Симанкова Анна Александровна - преподаватель кафедры нормальной и патологической физиологии ДВГМУ, тел. +7-962-229-12-26, e-mail: annasimmankova@mail.ru; Лебедько Ольга Антоновна - д-р мед. наук, зав. КДЛ НИИ ОМиД РАМН, e-mail: leoaf@mail.ru; Сазонова Елена Николаевна -д-р мед. наук, вед. науч. сотр. ЦНИЛ ДВГМУ, зав. кафедрой нормальной и патологической физиологии ДВГМУ, тел. +7-924-206-34-63, e-mail: sazen@mail.ru.
□□□
УДК 612.014.4:576.355: 599.323.4-092.9
Е.Н. Сазонова1,2, Д.В. Яковенко1, О.А. Лебедько1,2, И.М. Мальцева3, С.С. Тимошин1
цитопротективны1й эффект дигидрокверцетина
в первичной культуре пульмональных фибробластов белых крыс в условиях оксидативного стресса
'Дальневосточный государственный медицинский университет, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел. 8-(4212)-76-13-96, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru;
2Институт охраны материнства и детства Хабаровского филиала Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН, 680022, ул. Воронежская 49, корп. 1, тел./факс: 8-(4212)-35-63-35, 35-65-91, e-mail: iomid@yandex.ru; 3ООО «Медико-эстетический центр «Биарриц», 680000, ул. Дзержинского, 71, тел. 8-(4212)-32-38-61, г. Хабаровск
Резюме
Целью исследования было изучение характера влияния дигидрокверцетина (ДГК) на первичную культуру пульмональных фибробластов. 6-часовое воздействие ДГК (160 мкМ) на фибробласты индуцировало угнетение продукции клетками супероксид-радикала, уменьшение размеров ядер фибробластов и суммарной площади зон ядрышкового организатора на фоне стабильной пролиферативной активности культуры. 2-часовой оксидатив-ный стресс (ОС), индуцированный воздействием раствора перекиси водорода (60мкМ), приводил к полной блокаде ДНК-синтетической активности фибробластов, при этом имело место достоверное уменьшение площади ядер фибробластов и суммарной площади зон ядрышкового организатора. На фоне ДГК имело место существенное снижение повреждающего действия ОС: интенсивность продукции супероксид радикала в культуре клеток стала достоверно ниже, была зарегистрирована ДНК-синтетическая активность фибробластов.
Ключевые слова: оксидативный стресс, фибробласты, дигидрокверцетин.
Е-N. Sazonova12, D.V. Yakovenko1, О.А. Lebed ko12, ГМ. Maltseva3,
S.S. Timoshin1
CYTOPROTECTIVE EFFECT OF DIHYDROQUARCETINE IN THE INITIAL CULTURE OF PULMONARY FIBROBLASTS OF ALBINO RATS EXPOSEWD TO OXIDATIVE STRESS
'Far Eastern State Medical University;
2Research Institute of maternity and infancy protection;
3Medical-esthetic Center «Bioritz», Khabarovsk
Summary
The goal of the research was to study the character of dehydroquarcetine (DHQ) effect on the initial culture of pulmonary fibroblasts. 6-hour exposure of DHQ (160 mkM) on fibroblasts induced suppression of products by superoxide radicals, diminish sizes of fibroblasts nucleoli and a total square of nucleoli zone organizer at the background of stable proliferation of culture activity. 2-hour exposure of oxidative stress ^S), induced by hydrogen peroxide solution (60mkM), resulted in a complete blockade of fibroblasts DNA-synthetic activity, at the same time there occurred a reliable decrease of fibroblasts' nucleoli square and a total summarized zone square of nucleoli organizer. At the background of DHQ there was evidence of dramatic diminishing of a harmful effect of OS: intensity of superoxide radical production in the cell culture became reliably low. Fibroblasts DNA-synthetic activity was registered.
Key words: oxidative stress, fibroblasts, dehydroquarcetine.
Дигидрокверцетин - это растительный антиокси-дант, полифенольный биофлавоноид [2]. В литературе описано антипролиферативное и цитотоксическое воздействие биологически активных веществ класса биофлавоноидов на культуры опухолевых клеток [5]. Вместе с тем, характер влияния биофлавоноида квер-цетина и его аналогов на нормальные клетки может существенно отличаться от влияния на опухолевые клетки [7].
Целью исследования было изучение характера влияния дигидрокверцетина (ДГК) на первичную культуру пульмональных фибробластов на интактном фоне и в условиях оксидативного стресса.
Материалы и методы
Объектом исследования служила первичная культура пульмональных фибробластов новорожденной белой крысы линии Wistar. Биоптат правого легкого подвергали механической дезагрегации с последующей обработкой коллагеназой панкреаса краба (Био-лот, Россия) - 500 ед./мл при 37 оС в течение 15 мин. После двукратной отмывки раствором Хенкса (Биолот, Россия), полученный материал высевали в культураль-ные флаконы. Культивирование проводили в среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10 % феталь-ной бычьей сыворотки (Sigma, США) в газовой среде с 5 % содержанием СО2. Для исследования использовали клетки 5 пассажа.
Инкубацию пульмональных фибробластов с ДГК (Sigma Aldrich, США) проводили в течение 6 часов при концентрации вещества в культуральной среде 160 мкМ (50 мг/л). Оксидативный стресс моделировали добавлением в 15 мл инкубационной среды 0,001мл 3 % Н2О2 (60 мкМ) с экспозицией в течение 2 часов [3]. Формировали следующие серии: 1 - «контроль»; 2 -«ДГК» (воздействие ДГК в течение 6 часов); 3 - «ок-сидативный стресс» (добавление в культуральную среду Н2О2 с экспозицией в течение 2 часов); 4 - «ДГК + оксидативный стресс» (воздействие ДГК в течение 6 часов с обработкой культуры в заключительные 2 часа инкубации перекисью водорода).
Для оценки процессов генерации супероксид-анион радикалов пульмональными фибробластами использовали метод люцигенин-зависимой хеми-люминесценции (ХМЛ) [1]. Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER», сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы «Finlab». Фибробла-сты снимали с подложки с помощью раствора трип-сина-Версена (Биолот, Россия) и трехкратно отмывали раствором Хенкса. Подсчет клеток в суспензии фи-бробластов проводили в камере Горяева. Для хеми-люминесцентого анализа использовали 1*106 клеток. Люцигенин ( ^,^'-dimethyl-9,9'-biacridinium dinitrate; Sigma-Aldrich) добавляли в конечной концентрации 5 мкМ. Определяли светосумму люцигенин-зависимого свечения (Sluc) за 5 минут, которую выражали в относительных единицах.
ДНК-синтетическую активность пульмональных фибробластов исследовали методом авторадиографии с 3Н-тимидином. В течение 1 часа клеточные монослои инкубировали при 37 оС в растворе Хенкса с добавлением 3Н-тимидина в концентрации 1 мкКюри/мл. После инкубации монослои тщательно промывали в
растворе Хенкса и фиксировали в 96 % этаноле. Предметные стекла с монослоем фибробластов покрывали ядерной фотоэмульсией ШЪМ (Великобритания) и инкубировали при 4 оС в течение 28 суток. Затем проводили обработку проявителем Д-19, фиксировали в 33 % растворе гипосульфита натрия и окрашивали гематоксилином. Индекс меченых ядер (ИМЯ) рассчитывали на основании просмотра не менее 5 000 фибробластов каждого монослоя и выражали в процентах.
Параметры ядрышкового аппарата клеток оценивали с помощью компьютерной морфоцитометрии на анализаторе изображения «МЕКОС-Ц» в монослоях фибробластов, окрашенных азотнокислым серебром. Исследовали площадь ядер фибробластов, количество зон ядрышковых организаторов (ЯОР), суммарную площадь зон ЯОР в ядре. Площади ядер и зон ЯОР рассчитывали на основании измерения 50 клеток. Для анализа количества зон ЯОР просматривали 200 ядер фибробластов.
Результаты исследования обрабатывали с использованием программы «Statistica 6.0». Различия между контрольной и опытными сериями считали статистически достоверными при р<0,05, используя ^критерий Стьюдента. Всего в эксперименте было исследовано 24 монослоя фибробластов.
Результаты и обсуждение
Воздействие ДГК на первичную культуру пуль-мональных фибробластов (серия 2) индуцировало угнетение продукции супероксид-радикала: наблюдалось достоверное снижение интенсивности люци-генен-зависимой ХМЛ на 35,5 % (рис. 1). Показатель активности ДНК-синтетических процессов - индекс меченых ядер, характеризующий долю фибробластов в S-фазе клеточного цикла, - после воздействия ДГК не имел достоверных отличий от контрольного параметра (ИМЯ контроль - 30,69±3,70 %; ИМЯ ДГК -26,33±2,90 %). Морфометрическое исследование ядер фибробластов выявило достоверное уменьшение их размеров на 9,5 % (таблица). Кроме того, мы наблюдали достоверное снижение суммарной площади зон ЯОР на 7,8 %. Количество зон ЯОР в ядрах фибробластов, подвергнутых воздействию ДГК, не отличалось от контрольного. Воздействие ДГК на размер ядер и ядрышковый аппарат фибробластов может быть обусловлено способностью биофлаво-ноидов ингибировать активность мембранной тиро-зинкиназы, необходимой для реализации эффектов ростовых факторов [8].
Таблица
Параметры ядрышкового аппарата в первичной культуре пульмональных фибробластов исследуемых экспериментальных серий
Исследуемая серия Площадь ядра (мкм2) Суммарная площадь зон ЯОР (мкм2) Количество зон ЯОР
Контроль 218,60±4,39 17,03±0,39 3,95±0,07
ДГК 197,94±3,94* 15,70±0,37* 3,98±0,08
Оксидативный стресс 80,83±3,46* 8,24±0,46* 3,11±0,10*
ДГК + оксидативный стресс 126,07±5,91*-** 12,99±0,47*- ** 3,35 ± 0,10*
Примечание. * - р<0,05 по отношению к серии «контроль»; ** р<0,05 по отношению к серии «оксидативный стресс».
Воздействие на культивируемые пульмональные фибробласты среды с 60 мкМ перекиси водорода (серия 3 - «оксидативный стресс») индуцировало достоверное повышение интенсивности люцигенен-зависи-мой ХМЛ в культуре на 78,3 % (рисунок). Выраженная активация процессов свободнорадикального окисления в культуре сопровождалась практически полным блоком ДНК-синтетических процессов в культуре: в монослоях клеток, подвергнутых воздействию оксида-тивного стресса, встречались лишь единичные меченые ядра, с минимальной интенсивностью метки. По мнению Davies K.J. (1999), при оксидативном стрессе происходит блокада синтеза ДНК с целью защиты генетического аппарата от оксидативного повреждения.
Рис. Интенсивность люцигенин-зависимой ХМЛ в суспензированной культуре пульмональных фибробластов новорожденных белых крыс: 1 - контроль; 2 - ДГК; 3 -оксидативный стресс; 4 - ДГК + оксидативный стресс Примечание. * - р<0,05 по отношению к серии «контроль»; ** - р<0,05 по отношению к серии «оксидативный стресс».
В фибробластах, подвергнутых воздействию перекиси водорода, по сравнению с контролем, наблюдалось достоверное значительное (на 63 %) уменьшение показателя площади ядер фибробластов; снижение (на 51,6 %) суммарной площади зон ядрышковых организаторов, а также достоверное уменьшение количества зон ЯОР в ядрах фибробластов (таблица). По данным Mayer C., Grummt I. (2005) и Wnuk M., et al. (2008), оксидативный стресс угнетает синтез рибосомаль-ной РНК, что выражается в отклонении параметров ядрышкового аппарата.
Выраженность изменений в первичной культуре фибробластов, индуцированных воздействием перекиси водорода, была несколько меньше в монослоях, предварительно инкубированных с ДГК (серия 4). Интенсивность люцигенин-зависимой ХМЛ в этих образцах культуры оставалась достоверно выше кон-
трольного параметра (на 21,3 %), однако была достоверно (на 32 %) ниже аналогичного параметра группы «оксидативный стресс» (рисунок).
Аналогичная закономерность наблюдалась и при анализе размеров ядер и состояния ядрышкового аппарата у фибробластов, подвергнутых действию ок-сидативного стресса на фоне ДГК. Так, показатель площади ядер фибробластов и суммарной площади ядрышек клеток серии «ДГК+оксидативный стресс» был достоверно ниже контрольных параметров, однако, достоверно выше аналогичных показателей серии «оксидативный стресс» (таблица).
Особенно отчетливо цитопротективный эффект ДГК был заметен при анализе процессов синтеза ДНК в культуре фибробластов. Если в серии монослоев, подвергнутых воздействию перекиси водорода, мы наблюдали практически полное исчезновение ДНК-синтетической активности, то предварительное воздействие ДГК восстанавливало индекс меченых ядер культуры фибробластов до 6,56±1,50 %.
Результаты проведенного исследования в условиях первичной клеточной культуры указывают на наличие у растительного биофлавоноида дигидрокверцетина собственного прямого цитопротективного эффекта, реализующегося в условиях оксидативного стресса. Аналогичные по характеру эффекты были зарегистрированы Braganhol Е., et а1 (2006) при исследовании влияния кверцетина на культуру нейронов гиппокам-па [4]. Молекулярные механизмы цитопротективного влияния дигидрокверцетина в условиях оксидативного стресса требуют дальнейшего исследования.
Выводы
1. Влияние 160 мкМ ДГК на первичную культуру пульмональных фибробластов индуцирует угнетение продукции супероксид-радикала, достоверное уменьшение размеров ядер фибробластов и суммарной площади зон ЯОР.
2. Воздействие на культивируемые пульмональные фибробласты 60 мкМ перекиси водорода вызывает достоверную активацию продукции супероксид-радикала в культуре, блокаду ДНК-синтетической активности клеток и достоверное снижение площади ядер и суммарной площади зон ЯОР.
3. На фоне действия ДГК имеет место существенное снижение цитотоксического действия оксида-тивного стресса: уменьшается продукция супероксид-радикала, происходит частичное восстановление пролиферативной активности клеточной культуры.
Литература
1. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. - 2009. - Т. 49. - С. 341-388.
2. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксидан-ты. - М.: Фирма «Слово», 2006. - С. 556.
3. Самохвалов В.А., Сметанина М.Д., Мусейки-на Н.Ю. и др. Влияние низкой концентрации перекиси водорода на метаболизм клеток крови // Биомедицинская химия. - 2003. - Т. 2. - С. 122-127.
4. Braganhol E., Zamin L.L., Canedo D., et al. Antiproliferative effect of quercetin in the human U138MG glioma cell line // Anti-Cancer Drugs. - 2006. - Vol. 17 (6). - P. 663-671.
5. Csokay B., Prajda N., Weber G., Olah E. Molecular mechanisms in the antiproliferative action of quercetin // Life Sciences. - 1997. - Vol. 60 (24). - P. 2157-2163.
6. Davies K.J. The broad spectrum of responses to oxidants in proliferating cells: a new paradigm for oxidative stress // IUBMB Life. - 1999. - Vol. 48 (1). - P. 41-70.
7. Kim H.S., Quon Michael J., Kim Jeonga. New insights into the mechanisms of polyphenols beyond antioxidant properties; lessons from the green tea polyphenol, epigallocatechin 3-gallate // RedoxBiology. - 2014. -Vol. 2. - P. 187-195.
8. Liang Y.C., Lin-shiau S.Y., Chen C.F., Lin J.K. suppression of extracellular signals and cell proliferation through EGF receptor binding by(-)-epigallo- catechin gal-lateinhuman A431 epidermoid carcinoma cells // J. Cell. Biochem. - 1997. - Vol. 67. - P. 55-65.
9. Mayer C., Grummt I. Cellular stress and nucleolar function // Cell Cycle. - 2005. - Vol. 4 (8). - P. 1036-1038.
10. O'Donnell V.B., Azzi A. High rates of extracellular superoxide generation by cultured human fibroblasts: involvement of a lipid-metabolizing enzyme // Biochem J. -1996. - Vol. 318 (Pt 3). - P. 805-812.
11. Wnuk M., Lewinska A., Bugno M., Bartosz G., Slota E. Oxidant-induced decrease of the expression of nucleolar organizer regions in pig lymphocytes can be useful for monitoring the cellular effects of oxidative stress // Mutat Res - 2008. - Vol. 653 (1-2). - P. 124-129.
Literature
1. Vladimirov Yu.A., Proskurnina E.V Free Radicals and Cell Chemiluminescence // Advances in Biological Chemistry. - 2009. - Vol. 49. - P. 341-388.
2. Menshikova E.B., Lankin VZ., Zenkov N.K., et al. Oxidative stress. Prooxidants and antioxidants. - M.: Slo-vo, 2006. - P. 556.
3. Samokhvalov V.A., Smetanina M.D., Museiki-na N.Yu., et al. Influence of low hydrogen peroxide concentration on blood cells metabolism // Biomedical Chemistry. - 2003. - Vol. 2. - P. 122-127.
4. Braganhol E., Zamin L.L., Canedo D., et al. Antiproliferative effect of quercetin in the human U138MG glioma cell line // Anti-Cancer Drugs. - 2006. - Vol. 17 (6). - P. 663-671.
5. Csokay B., Prajda N., Weber G., Olah E. Molecular mechanisms in the antiproliferative action of quercetin // Life Sciences. - 1997. - Vol. 60 (24). - P. 2157-2163.
6. Davies K.J. the broad spectrum of responses to oxidants in proliferating cells: a new paradigm for oxidative stress // IUBMB Life. - 1999. - Vol. 48 (1). - P. 41-70.
7. Kim H.S., Quon Michael J., Kim Jeonga. New insights into the mechanisms of polyphenols beyond antioxidant properties; lessons from the green tea polyphenol,epigallocatechin 3-gallate // RedoxBiology. -2014. - Vol. 2. - P. 187-195.
8. Liang Y.C., Lin-shiau S.Y., Chen C.F., Lin J.K. suppression of extracellular signals and cell proliferation through EGF receptor binding by(-)-epigallo- catechin gal-lateinhuman A431 epidermoid carcinoma cells // J. Cell. Biochem. - 1997. - Vol. 67. - P. 55-65.
9. Mayer C., Grummt I. Cellular stress and nucleolar function // Cell Cycle. - 2005. - Vol. 4 (8). - P. 1036-1038.
10. o'Donnell V.B., Azzi A. High rates of extracellular superoxide generation by cultured human fibroblasts: involvement of a lipid-metabolizing enzyme // Biochem J. -1996. - Vol. 318 (Pt 3). - P. 805-812.
11. Wnuk M., Lewinska A., Bugno M., Bartosz G., slota E. oxidant-induced decrease of the expression of nucleolar organizer regions in pig lymphocytes can be useful for monitoring the cellular effects of oxidative stress // Mutat Res - 2008. - Vol. 653 (1-2). - P. 124-129.
Координаты для связи с авторами: Сазонова Елена Николаевна - д-р мед. наук, вед. науч. сотр. ЦНИЛ ДВГМУ, зав. кафедрой нормальной и патологической физиологии ДВГМУ, тел. +7-924-206-34-63, e-mail: sa-zen@mail.ru ; Яковенко Дарья Валерьевна - преподаватель кафедры нормальной и патологической физиологии ДВГМУ, тел. +7-924-115-65-18, e-mail: yakovenkodariya@ya.ru; Лебедько Ольга Антоновна - д-р мед. наук, зав. лабораторией комплексных методов исследований бронхолегочной и перинатальной патологии Хабаровский филиал ФГБУ «Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания» СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; Мальцева Ирина Михайловна - главный врач ООО «Медико-эстетический центр «Биарриц»; Тимошин Сергей Серафимович - д-р мед. наук, профессор, заведующий ЦНИЛ ДВГМУ
□□□
