CC BY
70
Саприн А.Н., Калинина E.B. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов // Успехи биологической химии. 1999. Т.39. С. 289-326.
Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Фэн, 2001. С. 32-34.
УДК 633.174 : (575.224.4 + 581.143.6 +581.331.2)
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАНТОВ СОРГО С
МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ, ПОЛУЧЕННЫХ ОБРАБОТКОЙ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO СТРЕПТОМИЦИНОМ
М.И. Цветова, JI.A. Эльконин ГНУ Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН, 410010 Саратов, ул. Тулайкова, 1; e-mail: elkonin@mail.saratov.ru
К настоящему времени у различных видов растений выявлены и исследованы многочисленные гены, контролирующие развитие пыльцы. Мутации в таких генах, ведущие к мужской стерильности, найдены или искусственно индуцированы у разных видов, и их исследование представляет интерес, как с теоретической точки зрения, так и в целях практической селекции. При этом, было установлено, что отдельные гены влияют на строго определённые этапы формирования пыльцы (Kaul, 1988; Kaul, Singh, 1991; Kindiger et al., 1991).
В данной работе исследовали цитологические механизмы стерилизации пыльцы у линии сорго Ma&no-ms-str с мутацией мужской стерильности, которая была получена от регенеранта из каллуса линии Майло-10, обработанного стрептомицином (Эльконин, 1999).
Материал и методика
Линия зернового сорго (Sorghum bicolor (L.) Moench paca durra) Майло-OTí-sfr была получена на основе одного мужски-стерильного растения, регенерированного из каллуса линии Майло-10, обработанного стрептомицином (500 мг/л). Этот регенерант с мутацией мужской стерильности, обозначенной ms-str, был опылен пыльцой исходной линии. Стерильные растения из гибрида Fl были вновь бэккроссированы с Майло-10. Полустерильные растения из ВС1 были самсспылены и в их потомстве выявлены стерильные, полу стерильные и фертильные растения. В дальнейшем мутация мужской стерильности поддерживалась путем самоопыления полустерильных растений в течение 9 поколений. Стерильные растения из 8-го поколения были подвергнуты цитологическому исследованию.
Соцветия фиксировали в ацетоалкоголе (1:3), промывали и хранили в 75% спирте. Для окраски использовали ацетокармин (2%) после предварительного протравливания материала в 4% растворе железо-аммонийных квасцов в течение 25 минут при температуре 45-50о. Для
приготовления давленных препаратов из пыльников сорго использовали смесь 45% уксусной кислоты и 70% хлоралгидрата (1:1), подкрашенную ацетокармином.
Результаты и обсуждение
Цитологический анализ формирования пыльцы у мужски-стерильных мутантов выявил значительные нарушения в ходе микроспорогенеза. У мутантных растений материнские клетки пыльцы (МКП) в пределах одного пыльника делились асинхронно: одновременно наблюдались стадии от профазы I до II деления мейоза, а в некоторых случаях даже до микроспор с формирующейся оболочкой (рис. 1), чего никогда не наблюдается в норме. При этом на разных стадиях формирования пыльцы наблюдались разнообразные нарушения, причём, отдельные растения различались спектром наблюдаемых аномалий.
У двух из исследованных растений (20-2 и 20-6) наблюдался цитомиксис, который интенсивнее всего проявлялся в профазе I, особенно на стадии пахитены. В результате миграции ядерного материала образовывались: а) клетки, у которых кроме ядра в цитоплазме находились дополнительные свободные ядрышки и/или хроматин (рис. 2, 3); б) двуядерные клетки (рис. 4); в) клетки, у которых отсутствовало ядро, но в цитоплазме находилось ядрышко без хромосом, или хроматин без ядрышка; г) безъядерные клетки. В двуядерных клетках ядра могли быть на разных стадиях мейоза (рис. 4), либо делиться синхронно (рис. 5, 6). Интересно отметить, что в цветках, в которых имел место цитомиксис, МКП значительно различались по размеру. Кроме того, в этих же цветках отмечены синцитиальные образования с 2-4 ядрами. В отдельных цветках цитомиксисом было затронуто до 28% мейоцитов. При этом многие из них имели признаки дегенерации, независимо от того, имели они избыток или недостаток хроматина.
Наряду с мейоцитами, затронутыми цитомиксисом, в пыльниках содержались МКП, в которых мейотическис процессы протекали нормально, либо наблюдались аномалии, не связанные своим происхождением с цитомиксисом. Среди 20-хромосомных МКП, находящихся в диакинезе, 71,1% имели по 10 бивалентов. В остальных наблюдали нарушения коньюгации (униваленты наряду с бивалентами, раскрытые биваленты, квадриваленты и в 4х случаях (1,3%) коньюгацию типа епс14о-епс1, когда от 4 до 6 хромосом, соединённых концами, составляли цепочки. Диады, сформировавшиеся у этих мутантов, варьировали по размеру. Около 10% из них имели от 1 до 10 микроядер. Очевидно, что эти микроядра образовалась как в результате аномального расхождения хромосом, так и из хроматина, попавшего в цитоплазму некоторых МКП в результате цитомиксиса.
В дальнейшем, у этих мутантов (20-2 и 20-6) наблюдали микроспоры аномальной формы, двуядерные, с микроядрами. Около 10% микроспор были значительно крупнее других, возможно, что они образовались из
MM ! I ^
-> * 3 •
4
. у
r
»
-s' 6
J
%% \ Ш
1 .
t - Ь -
/ \
MK*f] tvt h
. _ МКЯ ' *
8 • 9 Ш
1
V
V
Ш
J 0.
Л» & ШСП
i
11 12
Рисунок. Аномалии при развитии пыльцы у линии Майло-/ш-л7г
мейониты в профазе I и микроспора в одном пыльнике; 2 ■ ядрышко в цитоплазме МКП на стадии гелофазы hi- чужеродный хроматин в плазме МКП на стадии . рофазы I; 4 6 двуядерные клетки на разных стадиях мейоза; - микроспоры из одного цветка растения 20-6; а нормальная; б - неразъедкнившиеся. по образовавшие оболочку; н - не образовавшие оболочку; 8 - клетка тапетума и микроспоры с микроядрами; 9. 10 - результаты нарушения цитокинеза в телофазе II, / / вакуолизация тапетума; 12 формирование оболочки вокруг половинок диад, мксп-микроспора; я - ядрышко; 111 профаза I; Ml - метафаза I; мкя - микроядро; т -тапетум
*
половинок диад, в которых не прошло II деление мейоза. Часть тетрад не распадалась. При этом микроспоры в этих тетрадах продолжали развитие: у них формировались оболочки и пора. В то же время часть микроспор, высвободившихся из тетрад, не образовывали оболочки, хотя и увеличивались в размерах. Все пыльцевые зёрна у этих растений прекращали развитие на стадии одноядерной вакуолизированной пыльцы (рис. 7).
У одного из этих растений (20-2) во время вакуолизации пыльцы клетки тапетума не отличались от таковых у фертильной исходной линии Майло-10. Однако у другого растения (20-6) в разных цветках от 7 до 13% тапетальных клеток имели микроядра (рис.8), и до 5% клеток имели ядра, значительно различающиеся по размеру, чего мы не наблюдали в норме. Кроме того, клетки тапетума у этого растения варьировали по длине от 16.7 до 75.2 мкм (в норме пределы изменчивости этого признака 20.9-33.4 мкм).
У двух других растений (19-1 и 23-12) в обоих мейотических делениях свыше 20% ана-телофаз происходили аномально (1-7 отставших хромосом и/или нарушения цитокинеза) (рис. 9). В результате в микроспорах содержалось различное количество ядер и микроядер, формировались «двойные» и «тройные» Г13 (рис.10), и в некоторых случаях формировались гигантские пыльцевые зёрна (ПЗ), содержащие 4 ядра.
Часть тетрад у этих растений, также, как у описанных выше, не распадалась ко времени формирования оболочки и поры ПЗ. У растения 23-12 часть ПЗ не сформировала оболочку и пору к моменту, когда в других ПЗ заканчивалась стадии вакуолизаци]
В клетках тапетума к моменту формирования микроспор у растений 19-1 и 23-12 имелись огромные вакуоли, оттеснявшие цитоплазму и ядра к периферии (рис. 11). В норме у сорго, и, в частности, у исходной линии Майло-10, на этой стадии также наблюдаются вакуоли, но не настолько крупные. Кроме того, у растения 23-12 в некоторых случаях клетки тапетума образовали синцитии.
У еще одного изученного растения, 20-3, на стадии тетрад наблюдались огромные протопласты, которые были, возможно, остатками синцитиальных структур. У этого же растения было резко нарушено расхождение хромосом в первом и втором делениях. При этом микроспорогенез часто прекращался на стадии диад, и половинки диад формировали оболочку одновременно с высвободившимися из тетрад микроспорами (рис.12). При этом в некоторых случаях хромосомы не объединялись в ядро, а оставались разбросанными в цитоплазме
У всех исследованных растений развитие пыльцы не проходило далее стадии одноядерного вакуолизированного ПЗ. На всех стадиях микроспорогенеза наблюдали дегенерацию части мейоцитов, пикноз ядер, а также ряд других аномалий.
Таким образом, у исследованных нами растений линии rn.s-.sfr нарушения происходили на разных стадиях развития пыльника и пыльцы и
имели совершенно различную природу. Так, аномалии в расхождении хромосом и цитокинезе обычно являются результатом нарушений в действии микротрубочек веретена и их взаимодействия с центромерами хромосом (Dawe, 1998). Отсутствие нормально сформированной оболочки у микроспоры на стадии вакуолизации может быть связано с нарушениями синтеза спорополленина. Сохранение нераспавшихся тетрад, скорее всего, связано с нарушениями в процессе растворения каллозы. Изменения в развитии тапетума могут быть вызваны изменениями метаболизма аденина и цитокинина. Многие гены, экспрессия которых влияет на эти процессы, были выявлены и исследованы методами классической и молекулярной генетики (Татинцева, 1968; Warmke, Overman, 1972; Wang et al., 2002; Zhang et al., 2002; Rhee et al., 2003; Xie et al., 2005).
Исследования, проведенные ранее на ячмене, показали, что мутации, нарушающие формирование оболочек ПЗ, были не аллельны мутациям, при которых развитие микроспоры прерывалось после высвобождения из каллозной оболочки, так же как и мутациям, нарушавшим высвобождение микроспор из каллозы (Kaul, Singh, 1991). У кукурузы мутации, определяющие аномалии веретена деления и нарушения цитокинеза были неаллельны мутациям, прерывавшим развитие микроспоры на стадии вакуолизации (Alberstein, Phillips, 1981).
Обнаруженный нами спектр аномалий у разных растений одной и той же мутантой линии ms-str позволяет предположить более сложный мутационный механизм, чем возникновение одного рецессивного мутантного гена. Возможно, что в результате воздействия стрептомицина на каллусную культуру сорго произошла активация транспозона, гена-мутатора, либо возник какой-либо другой тип генетической нестабильности.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (фант 06-04-49119).
Литература
Татинцева С.С. Развитие мужских репродуктивных органов у фертильных и стерильных форм сорго. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Л, 1968. 19 с.
Эльконин Л.А. Модификация систем размножения растений на основе методов культуры in vitro (на примере сорго). Автореф. дкс. ... д-ра биол. наук. Санкт-Петербург, 1999. 48 с.
Albersten М.С., Phillips R.L. Developmental cytology of 13 genetic male sterile locy in maize // Can.J.Genet.Cytol., 1981. V. 23, N2. P.195-208.
Dawe R.K. Meiotic chromosome organization and segregation in plants // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 1998. V.49. P.371-395.
Kaul M.L.H. Male sterility in Higher Plants. Springer, Berlin Heidelberg New York. 1988. 1005 pp.
Kaul M.L.H., Singh R.B. Male sterility in barley. 5. Gene action and microsporogenesis // Cytobios, 1991. V. 66, N265. P.71-85.
