CC BY
45
УДК 632.4.01/.08
А.Г. Буланов*, Т. В. Балабанова, А.А. Шагаев, Е.Н. Дмитриева, Н.С. Марквичев, А.А. Белов
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 * e-mail: me@alexbulanov.com
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕЗИСТЕНТНОГО ШТАММА FUSARIUM OXYSPORUM К ПРЕПАРАТУ «МАКСИМ»
Изучено влияние фунгицидного препарата «Максим» на гриб Fusarium oxysporum штамм F2010. Показано, что при росте микроорганизма в глубинных условиях на среде Чапек с добавлением различных концентраций препарата происходит изменение ферментативной активности дегидрогеназ и количества липидов в клетках пропорционально увеличению концентрации. Предполагается, что данные изменения свидетельствуют о развитии признаков резистентности к использованному действующему веществу.
Ключевые слова: Fusarium oxysporum, флудиоксонил, механизмы резистентности, мембранные липиды, дегидрогеназная активность, препарат «Максим»
Fusarium oxysporum - почвенный грибковый патоген, вызывающий сосудистые заболевания растений путем проникновения через прикорневую и корневую системы [1]. Болезнь распространена повсеместно и ей подвержены различных культуры: зерновые, бобовые, овощные и декоративные. Многие возбудители заболеваний имеют избирательное действие, угнетая конкретные культуры, и практически безвредны по отношению к другим. В частности, Fusarium oxysporum spp., является избирательным по отношению к овощным растениям [2].
Повсеместно применяются фунгицидные препараты для борьбы с сельскохозяйственными заболеваниями. По данным организации по противодействию фунгицидной резистентности (FRAC) сегодня существует более 50 групп химических соединений [3], на основании которых только в России синтезированных препаратов превышает 1300 наименований [4]. Однако, самой большой проблемой применения химических препаратов является высокая вероятность возникновения резистентнотсти к ним у патогенных микроорганизмов.
Флудиоксонил относится к классу финилпиррольных соединений и не входит в группу препаратов повышенного риска возникновения устойчивости вследствие относительно недавнего появления его на мировом рынке [5]. Этот препарат представляет собой синтетический аналог выделенного из Pseudomonas pyrociniae природного антибиотика pyrrolnitrin [6] и он обладает широким спектром активности против трех основных классов грибков: аскомицетов, базидиомицетов и дейтеромицетов [7]. В последнее время все чаще появляются сообщения в средствах массовой информации о проявлениях признаков резистентности у обрабатываемых фунгицидом фитопатогенных микрорганизмов, что привлекает внимание ученых со всего мира к вопросу необходимости более детального исследования
механизмов резистентности и совершенствования методов использования данного фунгицида [8].
Пока механизм действия фенилпирролов, до конца не ясен, однако многочисленные исследования указывают на возникновения нарушений сигнальной системы клетки, отвечающей за процесс осморегуляции микроорганизма при стрессовых воздействиях, путем стимуляции рецепторов ответа двухкомпонентной системы и отклика HOG1 MAPK сигнальной системы [9,10]. В исследованиях препаратов класса дикарбоксамидов, имеющих аналогичных механизм действия, выявлено влияние на процессы биосинтеза компонентов плазматической мембраны клетки, в частности на биосинтез мембранных липидов, а в ряде исследований отмечены также изменения в составе и метаболизме липидов [11].
Известно, что флудиоксонил конкурирует с природным субстратом, и поскольку концентрация фунгицида в клетке увеличивается со временем, то в результате все больше блокируются необходимые для жизни клетки процессы метаболизма. Синтез дополнительного фермента целевого сайта фермента (т.е. сверхэкспрессия мишени) повышает вероятность связывания природного субстрата с активным центром фермента, таким образом, клеточные процессы, такие как, например, дыхание, в некоторой степени всё же реализуются, а следовательно, повышается и вероятность выживания клетки [12].
Задачей исследования являлось определение воздействия флудиоксонила на цитологические и биохимические свойства клеток. А также изучение взаимосвязи между фактом возникновением резистентности и изменениями этих параметров.
В качестве цитологического показателя исследовалось количество липидов, биохимического - общая дегидрогеназная активность. Первостепенно получали резистентный штамм Fusarium oxysporum путем последовательных пассажей на среде Чапека с «Максимом» в концентрации 2 г/л. О наличии
свойства резистентности судили по скорости роста фитопатогена.
Для количественного определения липидов в мицелии гриба рода Fusaium была выбрана методика, основанная на измерении сухого веса экстрагированных по модифицированному для микроорганизмов методу Блайя и Дайэра липидов [13]. Экстракция была осуществлена путем последовательных обработок отфильтрованной биомассы смесью растворителей
хлороформ:метанол в различных соотношениях (1:2; 1:2:0,8 (H2O); 1:1). Предварительно культура выращивалась на среде Чапек глубинным способом в течение 5 суток при постоянной температуре 28oC с добавлением препарата «Максим» в нужной концентрации, в контрольном образце препарат отсутствовал.
Для определения общей дегидрогеназной активности применялась методика, основанная на регистрации убыли концентрации метиленового синего непрерывно фиксируемого оптическим способом [14]. Исследуемые образцы F.oxysporum, культивирование которых осуществлялось по той же методике, необходимо было предварительно диспергировать для высвобождения
внутриклеточных ферментов при помощи диспергатора «Т 25 digital ULTRA-TURRAX». Результаты по определению дегидрогеназной активности, относили к сухому весу мицелия и значениям протеолитической активности, измеренных методом Ансона (субстрат - казеин) [15], для сравнения значений активности дегидрогеназ, полученных для контрольного и резистентного штамма F.oxysporum. В результате получены следующие показатели количества липидов (таблица 1, график 1) и значений дегидрогеназной активности (график 2). Таблица 1. Содержание липидов в биомассе при культивировании с разными концентрациями фунгицида
Концентрация Количество
"Максима", г/л липидов, %
0 5,8
2 8,2
4 11,1
6 11,4
8 14
10 15,2
Из данных видно, что происходит увеличение количества липидов при культивировании на среде Чапек, содержащей фунгицид «Максим». Из таблицы 1 следует, что процентное содержание липидов увеличивается вместе с увеличением количества внесенного в среду препарата от 8,2% до 15,2%. График 1 показывает зависимость количества
экстрагированных липидов от концентрации фунгицида в среде. По линии тренда, прослеживается прямо пропорциональная зависимость с коэффициентом соотношения, равным 0,9243.
18 16 S 14
0 §12
1 10 <=:
§ 8
_
^ 6 ч
° 4
2 0
...... __У = 0,9243х + б,3286
• ......
•
2 4 6 8
Концентрация фунгицида, г/л
График 1. Изучение влияния концентрации фунгицида на количество липидов в биомассе Fusarium oxysporum
ч loo
/
Ам
_
Ак
40
60
100
Время культивирования, час
График 2. Исследование влияния фунгицидного препарата на общую дегидрогеназную активность Fusarium oxysporum, где Ам - активность резистентного штамма, а Ак - активность контрольного образца
Различие в экстремальных значениях активности дегидрогеназ достигает: 122 усл.ед./г. Показано, что общая дегидрогеназная активность при добавлении фунгицидного препарата к фитопатогенному микроорганизму возрастает в 3,54 раза.
Полученные данные свидетельствуют об изменении процессов биосинтеза,
предположительно мембранных липидов клетки [16] и об изменении общей дегидрогеназной ферментативной активности. Предполагается, что преобразование биохимических процессов связано с возникновение механизмов резистентности к химическому препарату «Максим» на уровне физиологии грибкового патогена Fusarium oxysporum штамм F2010.
Буланов Александр Геннадьевич аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, Москва, Россия
Балабанова Татьяна Викторовна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, Москва, Россия
Шагаев Антон Александрович отудент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, Москва, Россия
Дмитриева Евгения Николаевна ведущий инженер кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия
Марквичев Николай Семенович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия
Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия
Литература
1. Castillejo M.A., Bani M. Understanding pea resistance mechanisms in response to Fusarium oxysporum through proteomic analysis// Phytochemistry - 2015 - Volume 115 - Pages 44-58.
2. Kraft, J.M., Larsen, R.C., Inglis, D.A., Diseases of pea. In: Allen, D.J., Lenne, J.M. (Eds.)// The Pathology of Food and Pasture Legumes. CAB International, Wallingford, UK - 1998 - pp. 325-370.
3. FRAC Code List © 2016: Fungicides sorted by mode of action (including FRAC Code numbering).
4. Государственный каталог пестицидов и агрохимкатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации (по состоянию на 15 января 2015 г) URL: www.pesticidy.ru/ps.../Государственный_каталог_2015_2743_instructions.pdf (дата обращения: 20.05.2015г)
5. National Registration Authority for Agricultural and Veterinary Chemicals, Evaluation of the new active Fludioxinil in the product Maxim 100 FS Fungicide Seed Treatment, NRA, Canberra, 2000
6. Nishida, M., Matsubara, T., Watanabe, N., Pyrrolnitrin, a new antifungal antibiotic. Microbiological and toxicological observations.//Journals of Antibiotics 18, - 1965 - p.211-219
7. Koch, E., Leadbeater A.J., Phenylpyrroles: a new class of fungicides for seed treatment.//Proceedings of Brighton Crop Protection Conference, Pest and Diseases, - 1992. - vol. 3. British Crop Protection Council, Farnham, Surrey, UK, pp. 1137-1146.
8. R. D. Peters, H. W. Platt, and K. A. Drake. First Report of Fludioxonil-Resistant Isolates of Fusarium spp. Causing Potato Seed - Piece Decay - 2008 - Volume 92, Number 1 - Page 172.
9. Fujimura, M., Mechanism of action of dicarboximide and phenylpyrrole on the stressresponse signal transduction pathway.//Journal of Pesticide Science 35, - 2010. - p. 351-353.
10. Furukawa, K., Randhawa, A., Kaur, H.,Fungal fludioxonil sensitivity is diminished by a constitutively active form of the group III histidine kinase.// FEBS Letters 586, - 2012. - p. 2417-2422.
11. Robert G., Dancer J., O'Neill E.. Lipid composition of Botrytis cinerea and inhibition of its radiolabelling by the fungicide iprodione.// New phitologist - Harwood. 2003 - p. 199-206.
12. Anastasios A. Malandrakis, Konstantinos N. Vattis, Effect of phenylpyrrole-resistance on fitness parameters and ochratoxin production in Aspergillus carbonarius. // international Journal of Food Microbiology, - 2013 - Volume 165, Issue 3, - Pages 287-294.
13. Bligh E.G., Dyer W.J. A Rapid Method of Lipid Extraction and Purification // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959.- V. 37. - P. 911-917.
14. Патент на изобретение №: 2476598 Чухчин Д. Г., Тупин П.А.Способ количественного определения дегидрогеназной активности микроорганизмов. Патент РФ №: 2476598.2008г
15. A n s o n М. The estimation of pepsin, tripsin, papain and eathepsin with hemoglobin / / J . Gener. Phys. - 1938. -Vol. 22, N 1. - P. 79—83.
16. I. Satoshi, Y. Igarashi, Y. Yoneda. Elimination and detoxification of fungicide miconazole and antidepressant sertraline by manganese peroxidase-dependent lipid peroxidation system // International Biodeterioration & Biodegradation - 2015 - Volume 100 - Pages 79-84.
Bulanov Aleksandr Gennadievich*, Balabanova Tatyana Victorovna, Shagaev Anton Aleksandrovich, Dmitrieva Eugenia Nikolavn, Markvichev Nikolay Semenovich, Belov Alexey Alexeevich
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: me @alexbulanov .com
CYTOLOGICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE RESISTANCE STRAIN FUSARIUM OXYSPORUM TO FUNGICIDE «MAXIM»
Abstract
Investigates the impact of Maxim fungicide on Fusarium oxysporum strain 2010. It demonstrates that the development of submerged culture Fusarium oxysporum on Czapek's medium with fungicide added at various concentrations occur the difference of ferments' common dehydrogenase activity and value of lipids in cells. It is expected tha t these changes show signs of resistance development to the use of the active ingredient.
Key words: Fusarium oxysporum, fludioxonil, mechanisms of resistance, membrane lipids, dehydrogenase activity, fungicide "Maxim"
