CC BY
22
© Ковальцова М. В.
УДК 616. 37-091. 8-092. 9:[612. 017. 1+577. 118] Ковальцова М. В.
цитокины, макро- и микроэлементы при нарушении морфофункционального состояния поджелудочной железы у беременных крыс и их потомства вследствие гипокалорийной диеты
Харьковский национальный медицинский университет (г. Харьков)
Данная работа является фрагментом НИР «Патогенез впливу екзогенних шюдпивих факторiв на морфофункцюнальний стан пщшлунково! залози», № гос. регистрации 012Ш02381.
Вступление. Заболевания поджелудочной железы (ПЖ) занимают значительное место в структуре заболеваемости детей и взрослых. ПЖ - это орган, который благодаря сочетанию внешнесекре-торной и эндокринной функций участвует во многих физиологических процессах. Анатомические особенности расположения ПЖ и сложность регуляции функций создают трудности в диагностики различных ее патологических состояний [1]. Известно, что обязательным компонентом системного ответа организма на воздействие практически любого «чрезвычайного раздражителя» (каким может явиться нарушение питания, особенно во время беременности), приводящего к патогенетически значимому повреждению тканей, являются нейрогормональ-ная стресс-реакция, обусловленная активацией «системы гипофиз-надпочечники» и симпатической нервной системы и системный гуморальный ответ, основу которого составляет активация экспрессии и повышение содержания в крови различных биологически активных веществ, прежде всего цитокинов [2]. Кроме того, дисбаланс макро- и микроэлементов, возникший в условиях несбалансированного питания может способствовать развитию патологии ПЖ [6].
Целью исследования явилось уточнение патогенеза повреждения ПЖ при действии неблагоприятных факторов на систему мать-плод, путём изучения особенностей морфофункционального состояния ПЖ, уровня цитокинов, макро- и микроэлементов при гипокалорийной диете у беременных крыс и их потомства.
Объект и методы исследования. При выполнении исследования использована экспериментальная модель, разработанная автором [4]. Изучены морфофункциональные изменения ПЖ беременных крыс и их потомства популяции WAG/G Б1о с использованием гистологического, цитохимического и
цитоморфометрического методов. Для оценки цитокинов в сыворотке крови иммуноферментным методом по прилагаемым инструкциям определялись ИЛ-4 с помощью набора реагентов фирмы Вектор БЕСТ (Новосибирск), ИЛ-12 с помощью набора реагентов фирмы Ani Biotech Oy (Elisa Kit), Orgenium laboratories Business Unit, Finland. В гомогенате ткани ПЖ спектрофотометрическим методом по прилагаемым инструкциям определялись цинк с помощью набора реагентов фирмы Spectromed (Молдова), магний и кальций с помощью наборов реагентов фирмы «Филист-Диагностика» (Днепропетровск).
Все группы экспериментальных животных включали 10 голов. Основные группы: беременные крысы (1 гр.) и их потомство - новорождённые крысята (гр. 1. 1), 1-месячные крысята (гр. 1. 2), 2-месячные крысята (гр. 1. 3). Группу сравнения составили животные, получившие сбалансированное питание, и их потомство аналогичного возраста. Содержание животных и эксперименты проводились согласно положений «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментов и других научных целей» (Страс-сбург, 1985), «Загальних етичних принцитв експе-римен^в на тваринах», утвержденных Первым национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2001). Статистическая обработка данных проводилась при помощи программы Microsoft Excel-2003, компьютерной программы Biostat. exe-2008 с использованием однофакторного дисперсионного анализа.
Результаты исследований и их обсуждение. У 100% крыс основной группы (1-й) по сравнению с животными группы сравнения наблюдается уменьшение объёма паренхимы (на 8,7%, p<0,001), увеличение объёма стромальной части ПЖ (на 23,3%, p < 0,001) и существенное снижение средней площади ацинусов (на 20,1%, p<0,001) гипопанкреатизма.
У новорождённых крысят (гр. 1. 1) степень выраженности изменений ПЖ больше, чем у матерей: относительный объём паренхимы уменьшен на 18,5% (p<0,05), относительный объём стромы увеличен на 41,4% (p<0,05); однако средняя площадь ацинусов
уменьшена менее существенно (на 7,7%). За два месяца жизни крысят основных групп произошло увеличение относительного объёма паренхимы на 6% и площади ацинусов на 2,4%, что меньше аналогичных показателей у крысят групп сравнения.
При микроскопическом исследовании ПЖ крыс, обнаружен меж- и внутридольковый фиброз (у 80%±12,6, р<0,001), липоматоз и отёк стромы (у 80%±12,6, р<0,001), умеренно выраженная воспалительная инфильтрация (у 40%±15,5), дистрофические изменения ядер, активизация процесса апоптоза ациноцитов (у 100%). У новорождённых крысят помимо указанных выше изменений ПЖ крыс-матерей, незрелость стромы (у 100%), полнокровие капилляров (у 100%) и дистрофия цитоплазмы экзокриноцитов (у 100%). По мере роста крысят большинство из указанных морфологических изменений ПЖ сохраняются до 2-месячного возраста.
У крыс-матерей установлена морфофункцио-нальная перестройка эндокринного аппарата ПЖ, заключающаяся уменьшении площади ОЛ (в среднем на 25,3%, р<0,001), уменьшении р- и а-клеток в ОЛ (на 27,3% и 28% соответственно, р<0,001). У новорождённых крысят наблюдаются аналогичные изменения, но степень их выраженности несколько меньше. Однако по мере роста крысят указанные нарушения прогрессируют и к 2-месячному возрасту площадь ОЛ, количество р- и а-клеток составляет соответственно 48,7%, 69,4% и 68,5% (р<0,001) от нормы.
При микроскопическом исследовании ПЖ у 100% крыс основной группы имелось уменьшение количества ОЛ, местами их гипертрофия, уменьшение размеров и дегенеративные изменения ядер а- и р-клеток, дистрофия их цитоплазмы, усиление апоптоза. У новорождённых крысят кроме этого имеются ОЛ неправильной и лентовидной формы, но и апоптоз отсутствует. Однако в течение дальнейшей жизни у крысят отмечается отрицательная: прогрессивно уменьшается количество гипертрофированных ОЛ на фоне выраженного доминирования мелких.
Таким образом, влияние гипокалорий-ной диеты на организм крыс до и в период беременности оказывает повреждающее действие на экзо- и эндокринный аппарат не только их собственной ПЖ, но и ПЖ плодов.
С учётом того, что обнаруженные у крысят морфологические изменения ПЖ имеют стойкий характер без существенной положительной динамики в течение 2-х месяцев жизни, представляется важным выяснение участия иммунных механизмов в повреждении ПЖ и состояния баланса макро- и микроэлементов, поскольку его нарушения могут вносить негативный вклад в поддержание функциональных и морфологических изменений ПЖ. С этой
целью был исследован уровень в сыворотке интер-лейкинов 12 и 4 (ИЛ-12, ИЛ-4), а так же содержание в гомогенате ткани ПЖ кальция, магния и цинка. Из множества про- и противовоспалительных цитоки-нов мы выбрали ИЛ-12 и ИЛ-4 так как они определяют направление дифференцировки Т-лимфоцитов из Ой4+-Т-клеток с образованием Т-хелперов 1-го (ТИ1) и 2-го (ТИ2) типов [7], т. е. являются маркерными цитокинами ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов. Их уровень позволяет судить о пути реализации иммунного ответа на повреждение тканей, поскольку известно, что ТИ1-клетки опосредуют реакции клеточного иммунитета, основанные на взаимодействии антиген-Т-лимфоцит, а ТИ2 клетки - реакции гуморального иммунного ответа, связанного со стимуляцией В-лимфоцитов и выработкой антител [5].
Результаты исследования содержания цитоки-нов и микроэлементов представлены в таблице. Установлено, что у крыс-матерей и 2-месячных крысят имеется существенное повышение содержания ИЛ-12 (в 1,8 и 1,6 раза соответственно) и снижение ИЛ-4 (в 2,4 и 3,5 раз соответственно). У 1-месячных крысят, в отличие, от животных других групп, имеется снижение уровней ИЛ-12 (в 1,8 раза) и ИЛ-4 (в 3,9 раза), что свидетельствует о недостаточности иммунного ответа на повреждение ткани ПЖ. Соотношение ИЛ-12 / ИЛ-4 у крыс матерей составляет 22,5 (в группе сравнения 5,0), у 1-месячных крысят -13,5 (в группе сравнения 6,3), у 2- месячных крысят - 22,1 (в группе сравнения 4,1). Это свидетельствует о том, что наиболее выраженный цитокиновый дисбаланс имеет место у крыс-матерей, наименее выраженный - у 1-месячных крысят.
Таким образом, результаты исследования манифестируют наличие у животных системного гуморального ответа в виде дисбаланса противо- и провоспалительных цитокинов с преобладанием маркерного цитокина ТИ1-лимфоцитов (ИЛ-12), что отражает преимущественное вовлечение в патогенез повреждения ПЖ клеточного звена иммунитета. У части животных (40%) уже на момент
таблица
содержание цитокинов в сыворотки крови и микроэлементов в гомогенете ткани поджелудочной железы (M±m) у крыс-матерей 2-й группы и их потомства (в % от норматива)
Показатели Крысы-матери (гр. 1) Возраст крысят
1 месяц (гр. 1. 2) 2 месяца (гр. 1. 3)
ИЛ-12 (%) 186,6±9,1*** 55±1,5*** 156±3,3*** (р2<0,001)
ИЛ-4 (%) 45,4±6*** 25,6±3,4*** 28,7±2,4*** (р2=0,466)
Кальций (%) 120,9±2,6** 55,6±0,6*** 82,4±0,7*** (рр<0,001)
Магний (%) 91,2±3 86±1*** 71±1,4*** (р2<0,001)
Цинк (%) 55,7±1,8*** 71,3±0,7*** 93,6±0,4*** (р2<0,001)
Примечание: ***р < 0,001, ** р < 0,01, *р < 0,05 (сравнение с группой контроля);
р2 - сравнение с гр. 2. 1
исследования мы обнаружили морфологические признаки воспаления в ПЖ. Это свидетельствует, во-первых, о значимости имеющегося у животных цитокинового дисбаланса в патогенезе повреждения ПЖ и развития в ней хронического воспалительного процесса и, во-вторых, о риске возникновения хронического панкреатита у остальных животных в связи с длительно сохраняющейся иммунопатологической реакцией (специфической аллергической реакцией замедленного типа).
Исследование уровня макро- и микроэлементов в гомогенате ткани ПЖ показало, что у 100% крыс-матерей имеется повышение уровня кальция на 20,9%. Уровень магния снижен у 50% крыс (у 20% нормальный его уровень, у 30% - повышенный), при этом среднее значение показателя практически не отличается от такового у животных группы сравнения. Уровень цинка снижен (в среднем на 44,7%) у 100% животных (табл.).
У всех крысят обеих групп, в отличие от их матерей, наблюдается существенное снижение уровня кальция, а изменения содержания магния и цинка такие же, как у матерей, но степень их выраженности меньше (табл.). Полученные данные свидетельствуют о том, что при повреждении ПЖ, вызванном влиянием гипокалорийной диеты, морфологические изменения её сочетаются с дисбалансом макроэлементов (кальция и магния) и снижением уровня цинка. Это, безусловно, негативно сказывается на внутриклеточном метаболизме пан-креацитов, их экзо- и эндокринной секреторной активности, что может ещё больше усугубить повреждение ПЖ и способствовать развитию воспаления и панкреатической недостаточности [3].
Выводы.
1. У всех беременных крыс, получавших гипо-калорийную диету, и у их потомства наблюдаются морфофункциональные изменения ПЖ стереотипного характера, проявляющиеся сочетанием дистрофических и некробиотических, атрофических
и склеротических изменений, а также усилением апоптоза в специализированных клетках ПЖ.
2. У животных всех экспериментальных групп выражен системный гуморальный ответ в виде дисбаланса про- и противовоспалительных ци-токинов с преобладанием маркерного цитокина ТИ1-лимфоцитов (ИЛ-12). Это свидетельствует о преимущественном вовлечение в патогенез повреждения ПЖ клеточного звена иммунитета.
3. У животных всех групп имеет место дисбаланс макро- и микроэлементов в ткани ПЖ (гипер-или гипокальциемия, гипомагниемия, снижение содержания цинка), который может усугублять нарушения метаболизма панкреацитов, возникшие вследствие гормонально-субстратных нарушений при гипокалорийной диете.
4. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что гипокалорийная диета беременных крыс является существенным фактором риска развития органической патологии ПЖ с секреторной недостаточностью не только у них самих, но и у их потомства.
Перспективы дальнейших исследований. Результаты исследования свидетельствуют о перспективности дальнейших научных разработок в данном направлении, поскольку на сегодня ещё остаются неизученными вопросы, касающиеся дальнейшей динамики морфофункциональных изменений ПЖ у потомства крыс, имевших алиментарную недостаточность в течение беременности, значимость этих изменений на становление репродуктивной функции у этих животных и здоровье их потомства, реальную угрозу формирования хронических заболеваний ПЖ (в том числе панкреатита и сахарного диабета) в зрелом возрасте животных. Выяснение этих вопросов на уровне эксперимента имеет важное значение для углубления знаний относительно патогенеза повреждения ПЖ при нарушении питания у взрослых людей и детей, а значит и совершенствования методов профилактики и лечения у них заболеваний ПЖ.
Литература
1. Балуш Л. В. Пстох1м1чн1 та електронномлкроскотчш дослщження тдшлунковоУ залози та тл1 експериментального цу-крового д1абету / Л. В. Балуш, А. М. Ященко, В. I. Ковалишин // Кшшчна анатомия та оперативна х1рурпя. - Т. 8, №1.
- 2009. - С. 37-43.
2. Болевич С. Б. Молекулярные механизмы в патологии человека: Руководство для врачей / С. Б. Болевич, В. А. Войнов.
- М.: ООО «Изд-во «Медицинское информационное агентство». - 2012. - С. 8-10.
3. Губергриц Н. Б. Клиническая панкреатология / Н. Б. Губергриц, Т. Н. Христич. - Донецк : ООО «Лебедь», 2000. - 416 с.
4. Пат. 81453 UA, й09В 23/28 (2006. 01), й09В 23/34 (2006. 01) Спос1б моделювання ал1ментарноУ бшково! недостатност1 [текст] / Нколаева О. В., Ковальова М. В., бвтушенко Т. Г. (UA); заявник Харювський нацюнальний медичний ушверси-тет (UA). - № u 2013 01910, заявл. 18. 02. 2013; опубл. 25. 06. 2013. Бюл. № 12. - 4 с.
5. Тотолян А. А. Клетки иммунной системы / А. А. Тотолян. - СПб.: Наука, 2000. - 231с.
6. Herchuelz, A. Na(+)/Ca (2+) exchange and the plasma membrane Ca(2+)-ATPase in p-cell function and diabetes / A. Herchuelz, E. Nguidjoe, L. Jiang, N. Pachera // Adv. Exp. Med. Biol. - 2013. - Р. 385-94.
7. O'Garra, A. Commitment factors for T helper cells / A. O'Garra // Curr. Biol. - 2000. - Vol. 10, № 13. - P. R492-R494.
УДК 616. 37-091. 8-092. 9:[612. 017. 1+577. 118]
ЦИТОКИНЫ, МАКРО- И МИКРОЭЛЕМЕНТЫ ПРИ НАРУШЕНИИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У БЕРЕМЕННЫХ КРЫС И ИХ ПОТОМСТВА ВСЛЕДСТВИЕ ГИ-ПОКАЛОРИЙНОЙ ДИЕТЫ
Ковальцова М. В.
Резюме. В поджелудочной железе беременных крыс, получавших гипокалорийную диету, и у их потомства выявлены морфофункциональные изменения: уменьшение объёма паренхимы и площади ацинусов, отёк, фиброз и липоматоз стромы, её воспалительная инфильтрация, дистрофические изменения ядер и цитоплазмы, активизация апоптоза ациноцитов; у крысят так же наблюдалась незрелость паренхимы, полнокровие капилляров; дисбаланс про- та протизапальних цитоюыв з переважанням маркерного цитоюну ТМ^мфоци^в (1Л-12); дисбаланс макро- и микроэлементов в ткани поджелудочной железы (гипер- или гипокальциемия, гипомагниемия, снижение содержания цинка). Подобные морфофункциональные изменения поджелудочной железы у животных, свидетельствуют о том, что гипокалорийная диета беременных крыс является существенным фактором риска развития хронической патологии поджелудочной железы (в том числе и сахарного диабета) в дальнейшем не только у самих крыс, но и у их потомства.
Ключевые слова: гипокалорийная диета, морфофункциональное состояние поджелудочной железы, беременные крысы и их потомство, цитокины, макро- и микроэлементы.
УДК 616. 37-091. 8-092. 9:[612. 017. 1+577. 118]
ЦИТОЮНИ, МАКРО- ТА М^РОЕЛЕМЕНТИ ПРИ ПОРУШЕНЫ МОРФОФУНКЦЮНАЛЬНОГО СТАНУ ПЩШЛУНКОВОТ ЗАЛОЗИ у ВАПТНИХ ЩУРiВ ТА "IX ПОТОМСТВА ВНАСЛЩОК ППОКАЛОРмНОТ Дieти
Ковальцова М. В.
Резюме. У пщшлунковм залозi ваптних щурiв, як отримували ппокалормну дieту, та у 1х нащадюв виявлен морфофункцюнальы змши: зменшення обсягу паренхiми та площi ацинусiв, набряк, фiброз та лiпоматоз строми, II запальна Ыфтьтра^я, дистрофiчнi змiни ядер та цитоплазми, активiзацiя апоптозу ациноцитiв; у щурят так само спостер^алася незртють паренхiми, повнокров'я капiлярiв; дисбаланс про- та протизапальних цитоюыв з переважанням маркерного цитоюну ТМ^мфоци^в (1Л-12); дисбаланс макро-та мiкроелементiв у тканин пiдшлунковоI залози (гiпер- або гiпокальцiемiя, гiпомагнiемiя, зниження вмiсту цинку). Подiбнi морфофункцiональнi змiни пiдшлунковоI залози у тварин, свщчать про те, що гiпокалорiйна дieта вагiтних щурiв е iстотним чинником ризику розвитку хроычно! патологiI пiдшлунковоI залози (у тому чиогм цукрового дiабету) не ттьки у самих щурiв, а й у 1х потомства.
Ключовi слова: гiпокалорiйная дiета, морфофункцiональний стан пщшлунково! залози, вагiтнi щури та 1х нащадки, цитокiни, макро- та мiкроелементи.
UDC 616. 37-091. 8-092. 9:[612. 017. 1+577. 118]
Су1ок1пез, Major Mineral Elements and Trace Elements under Violation of Morphofunctional State of the Pancreas of Pregnant Rats and their Offspring Resulting from a НуросзЬпс Diet
Kovaltsova M.
Abstract. Introduction. The pathology of the pancreas caused by the influence of exogenous pathogenic factors is an actual problem of modern medicine. Modern conditions of human life, and those of pregnant women in particular, result in a problem of fighting long mental and physical stress.
The purpose of the study was specification of pathogenetic actions in the violated pancreas followed by the affectation of adverse exogenous factors in mother-fetus system via analysis of characteristics of major mineral elements and trace elements under violation of morphofunctional state of the pancreas of pregnant rats and their offspring resulting from a hypоcaloric diet
Materials and Methods. We studied morphological changes of pancreas of pregnant rats and their offspring using histological, cytochemical, cytomorphometric and biochemical methods. A core group of adult rats received hypocaloric diet, while their offspring received normal balanced diet. Comparison group consisted of animals with a balanced diet, and their offspring of the same age. For the rats, the experiment was stopped immediately after the birth of offspring in compliance with the ethical principles.
Results. The pancreas of pregnant rats treated with hypocaloric diet revealed morphological changes: reduced parenchymal area and acini, edema, fibrosis and lipomatosis stroma, its inflammatory infiltration, degenerative changes in the nuclei and cytoplasm, activation of apoptosis of exocrine pancreatic cells. Stress during pregnancy in rats affects the morphology and function of the pancreas in the offspring. Symptoms of morphofunctional disorders are obvious even in the pancreas of newborn rats (and they are similar to those of their mothers). Most of them not only saves up until they are two months of age, but has a negative trend of growth severity: reducing the relative amount of parenchymal acini area, number and area of the islets of Langerhans, the number of endocrine cells in them. Young rats also presented immaturity of the parenchyma, moderate congestion of the capillaries. The rats in all groups are diagnosed as having identical tendencies of cytokines change; significant buildup of pro-inflammatory interleukin-12 and reduction of anti-inflammatory interleukin-4 which indicates predominant involvement in pathogenesis of violation of pancreas cell component of immune system. The study of macro-and microelements
level in the tissue homogenate showed an increase of calcium level by 20. 9 % in 100 % of the rats-mothers. Magnesium level decreased in 50 % of the rats (20% showed normal level, 30% - increased), while the average value of the index did not differ from that of animals of the comparison group. The level of zinc (in average by 44. 7 %) reduced in 100 % of animals. All the rats of both groups, in contradistinction to their mothers, showed a significant decrease in calcium level, while the content of magnesium and zinc are the same as in those mothers, but lesser degree of severity. The findings allow to conclude that morphofunctional changes of a hypоcaloric diet violation of the pancreas combine with macrocell imbalance (calcium and magnesium) and reduction of zinc level. These affect intracellular metabolism of pancreacytes, both exo- and endocrine secretory activity that can be a reason for aggravation of the pancreas, and promote inflammation and pancreatic deficiency.
Conclusions. The results suggest that chronic stress of pregnant rats is a significant risk factor for future chronic pathology of the pancreas (including diabetes mellitus) not only in rats themselves, but also in their offspring.
Key words: hypocaloric diet, morphology and function of the pancreas, pregnant rats and their offspring, cytokines, major mineral elements and trace elements.
Рецензент - проф. Костенко В. О.
Стаття надшшла 28. 04. 2014 р.
