Цитокиновый профиль перитонеальной жидкости и периферической крови больных с наружным генитальным эндометриозом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© М. И. Ярмолинская ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИлЬ ПЕРИТОНЕАл ЬНОЙ

ЖИДКОСТИ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НИИ акугарства и гашжшогаи БОлЬНЫХ С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАлЬНЫМ

им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург ЭНДОМЕТРИОЗОМ

УДК 618.145-007.415-07

■ Были изучены особенности продукции цитокинов (ПТС-у, TNF-a, IL-2, ^-10, IL-6 и IL-4), а также соотношения их содержания в перитонеальной жидкости и периферической крови у пациенток с наружным генитальным эндометриозом. Показано, что при эндометриозе наблюдается иммунный ответ по

№2 типу, и, следовательно, снижены клеточно-опосредованные реакции, причем эти изменения более выражены при рецидивах заболевания и сочетании НГЭ с аденомиозом. Представленные данные подтверждают целесообразность применения цитокинов и их ансамблей в комплексной терапии генитального эндометриоза.

■ Ключевые слова: цитокины; Т-хелперы 1-го типа; Т-хелперы 2-го типа; наружный генитальный эндометриоз

Введение

Эндометриоз является дисгормональным, иммунозависи-мым, генетически обусловленным заболеванием, для которого характерно рецидивирующее течение. Несмотря на длительное изучение проблемы лечения наружного генитального эн-дометриоза (НГЭ), применяемые схемы терапии не обеспечивают достаточного эффекта. Нарушения в иммунной системе занимают одно из ведущих мест в патогенезе эндометриоза. Они обеспечивают имплантацию, способствуют пролиферации эндометриоидных очагов, причем особое место отводится нарушению клеточного иммунитета, поэтому изучение особенностей иммунного ответа при данном заболевании является актуальной задачей для разработки новых патогенетически обоснованных методов лечения с применением иммуномоду-лирующих препаратов.

Сложные взаимоотношения иммунокомпетентных клеток при возникновении и развитии патологических процессов опосредуются универсальными молекулами межклеточных взаимодействий — цитокинами. В иерархии уровней специфического действия цитокинов наибольшее значение имеют паракринный и аутокринный и гораздо меньшее системный (эндокринный) эффекты. Клеточный иммунитет, включая Т-клеточно-опосредованную цитотоксичность, активируется или подавляется цитокинами, продуцируемыми Т-хелперами 1-го (ТЫ) и 2-го (ТЪ2) типа соответственно. В нормальных условиях существует механизм контроля баланса между ТЫ и ТЪ2. Например, ТЫ секретируют ^-12, который активирует цитотоксичную активность NK клеток, тогда как ТЪ2 могут снижать активность NK клеток благодаря продукции 10. №N-7, продуцируемый ТЫ, подавляет активность ТЪ2, а 4 и ^-10, продуцируемые ТЪ2, подавляют активность ТЫ. Несомненно, важной задачей является выявление взаимосвязи между показателями местного иммунитета (содержание ци-токинов в перитонеальной жидкости) и общей реакцией (содержание цитокинов в периферической крови), позволяющей охарактеризовать системные механизмы иммунорегуляции.

Цель работы

Изучение особенностей продукции цитокинов, а также соотношения их содержания в перитонеальной жидкости и периферической крови у пациенток с НГЭ.

Материал и методы исследования

В исследование вошли пациентки в возрасте от 23 до 45 лет (средний возраст 31,5 ± 4,4 лет). Всего обследована 41 женщина с НГЭ 1-11 степени распространенности. Диагноз был подтвержден на основании лапароскопии и гистологического исследования. Степень распространенности генитального эн-

Таблица

Содержание цитокинов перитонеальной жидкости и периферической крови в различных группах (СИФ)

Группа Материал IFN-y, M ± m TNF-a, M ± m IL-2, M ± m IL-10, M ± m IL-6, M ± m IL-4, M ± m

Группа сравнения кровь 7,38 ± 0,30 * 7,73 ± 0,30 * 4,11 ± 0,20 * 7,93 ± 0,39 * 8,23 ± 0,41 * 5,97 ± 0,29 *

пж 7,27 ± 0,36 7,75 ± 0,30 * 4,49 ± 0,21 9,05 ± 0,45 * 30,67 ± 2,50 * 6,18 ± 0,30 *

НГЭ кровь 8,15 ± 0,40 * 7,54 ± 0,30 * 4,92 ± 0,24 10,37 ± 0,51 8,74 ± 0,43 * 6,76 ± 0,33 *

пж 7,87 ± 0,39 7,76 ± 0,30 * 5,24 ± 0,26 15,51 ± 0,77 * 40,32 ± 2,00 * 6,97 ± 0,34 *

Рецидивы НГЭ кровь 8,08 ± 0,40 * 7,89 ± 0,30 * 4,98 ± 0,24 * 10,15 ± 0,50 * 9,05 ± 0,45 * 7,28 ± 0,36 *

пж 7,59 ± 0,37 8,03 ± 0,40 * 5,37 ± 0,26 * 18,45 ± 0,90 * 36,8 ± 1,8 * 8,03 ± 0,35 *

НГЭ + аденомиоз кровь 8,72 ± 0,40 * 8,09 ± 0,40 * 5,05 ± 0,25 * 12,21 ± 0,60 * 14,57 ± 0,70 * 7,07 ± 0,35 *

Контрольная группа кровь 8,53 ± 0,42 7,81 ± 0,39 4,51 ± 0,22 11,34 ± 0,56 10,24 ± 0,51 7,43 ± 0,37

пж 7,21 ± 0,36 7,72 ± 0,30 4,53 ± 0,23 6,81 ± 0,34 20,54 ± 1,02 6,02 ± 0,30

* — достоверность отличий относительно контрольной группы p < 0,05

TNF-a IL-2

группа сравнения I

IL-10 IL-6

НГЭ □ рецидивы

IL-4

Рис. 1. Средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) цитокинов в перитонеальной жидкости

дометриоза определяли по классификации R-AFS. НГЭ I степени был выявлен у 13 человек (31 %), II степени установлен у 28 человек (69 %). 10 пациенток (24 %) были прооперированы по поводу рецидива генитального эндометриоза два и более раз. Группу сравнения составили 14 пациенток без признаков эндометриоза с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза вне обострения, подтвержденными лапароскопией. В контрольную группу вошли 9 здоровых женщин, обратившихся для проведения лапароскопической стерилизации. Во время операции у пациенток производили забор перитонеальной жидкости (ПЖ) и периферической крови (ПК). Методом проточной цитофлюорометрии с помощью набора CBA (Cytometry Beads Array, BD Bioscience) — набора частиц, меченных антителами — определяли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), соответствующую концентрации следующих веществ:

IFN-y, TNF-a, IL-2, продуцируемых Th1 и IL-10, IL-6 и IL-4, продуцируемых Th2. Измерения проводили на проточном цитофлюориметре FACScan BD Bioscience с помощью программы BD CBA 8 Bead Analysis (BD Bioscience). Затем полученные результаты были обработаны с помощью статистических средств программы Microsoft Office Excel. В частности, для определения взаимосвязи между исследуемыми параметрами использовался коэффициент линейной корреляции (Пирсона).

Результаты исследования

У женщин с НГЭ отмечается повышение концентрации IL-10 и IL-6 в ПЖ по сравнению с пациентками с хроническими воспалительными заболеваниями в стадии ремиссии, составившими группу сравнения (рис. 1). Так, значения СИФ в группе сравнения для IL-10 и IL-6 составили 9,05 ± 0,45; 30,67 ± 2,50 соответственно; в группе с НГЭ зна-

чения СИФ для ^-10 составили — 15,51 ± 0,7; для ^-6 — 40,32 ± 2,00. В ПЖ женщин контрольной группы уровни цитокинов ^-10 и ^-6 значительно ниже по сравнению с больными с НГЭ и хроническими воспалительными заболеваниями (в стадии ремиссии) (р < 0,05) (табл.).

Интерлейкин-6 (^-6) — многофункциональный провоспалительный цитокин, продуцируемый Т-клетками и макрофагами и стимулирующий иммунный ответ при повреждении тканей. Он индуцирует продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами, способствует активации Т-кле-ток и при высоких уровнях связан с увеличением продукции антител. Его продукция регулируется ^-1, стимулирующим увеличение триггеров воспалительного ответа. Согласно литературным данным, также отмечено, что у женщин с эндо-метриозом концентрация ^-6 в ПЖ значительно повышается, причем наблюдается корреляция уровня данного цитокина со степенью распространенности заболевания [7].

Интерлейкин-10 (^-10), являясь противовоспалительным цитокином, снижает синтез провос-палительных цитокинов, таких как 1КЫ-у, ^-2, ^-3, TNF-a. Кроме того, он может стимулировать некоторые Т-лимфоциты, тучные клетки и В-лим-фоциты. Он продуцируется главным образом ТЪ2 и В-лимфоцитами. Повышенный уровень ^-10 в ПЖ вызывает отклонения в функционировании иммунной системы, которые могут способствовать развитию эндометриоза. Полагают, что Ш-10 нарушает функции иммунной системы путем уменьшения активации перитонеальных Т-лим-фоцитов, особенно при прогрессировании эндометриоза. Многие исследователи сообщают, что существует корреляция между концентрацией Ш-10 в ПЖ, наличием эндометриоза и стадией заболевания. Тем не менее, единого мнения по этому вопросу не сформировано — в ряде исследований не выявлено корреляции между уровнями ^-10 в ПЖ и тяжестью заболевания [7].

При рецидивах заболевания нами также отмечено достоверное увеличение содержания цитокинов (значения СИФ для ^-10 18,45 ± 0,90 и для ^-6 — 36,80 ± 1,84) по сравнению с контрольной группой и пациентками с воспалительными заболеваниями органов малого таза в стадии ремиссии (табл.). Кроме того, при рецидивах НГЭ наблюдается тенденция к повышению концентрации ^-4 в ПЖ относительно группы сравнения (значения СИФ ^-4 в группе сравнения 6,18 ± 0,30, у пациенток с рецидивами НГЭ — 8,03 ± 0,35). Возможно, что у женщин с генитальным эндо-метриозом цитокины ТЪ2-типа в ПЖ подавляют клеточно-опосредованный иммунитет благодаря увеличению секреции ^-4 и ^-10. В результате,

15,00 т

о

0,00 -I-1-1-1

0,00 5,00 10,00 15,00

СИФ ТЫР-а

Рис. 2. Корреляция между содержанием ШЫ-у и ЮТ-а в пери-тонеальной жидкости у больных НГЭ

уменьшение Т-клеточной цитотоксичности делает возможной имплантацию эндометриальных клеток на брюшину и пролиферацию эндометри-оидных очагов.

Интерлейкин-4 (^-4) продуцируется ТЬ2-клет-ками и действует преимущественно на В-клетки, Т-клетки, макрофаги и тучные клетки. ^-4 способствует пролиферации и дифференцировке В-клеток, а также костимуляторной их активации. Известно, что он является фактором переключения синтеза иммуноглобулинов с IgG на ^Е. Он регулирует экспрессию главного комплекса гис-тосовместимости (МНС-класса II) покоящимися В-клетками и макрофагами, а также способствует процессу презентации антигена. Кроме того, ^-4 стимулирует пролиферацию тимоцитов и Т-клеток и вызывает рост тучных клеток. Ш-4 является ключевым цитокином ТЬ2-типа ответа — индуцирует активацию и созревание В-клеток, а также диффе-ренцировку ТЪО в ТЪ2-типа. Кроме того, ^-4 ин-гибирует дифференцировку и функцию ТЫ.

У больных НГЭ в ПЖ обнаружена взаимосвязь между содержанием ШЫ-у и Т"ОТ-а (коэффициент корреляции 0,89; р < 0,05) (рис. 2).

Фактор некроза опухолей а (Т"ОТ-а) — цито-кин, секретируемый нейтрофилами, активированными макрофагами, эндотелиальными клетками и некоторыми другими клетками при повреждении. Его секреция стимулируется некоторыми другими медиаторами, включая ^-1. Он влияет на воспаление, ангиогенез и цитотоксический эффект в отношении клеток-мишеней, обычно действует синергично с ^-1 и ^-6, принимает участие в активации ТЫ. Вместе с активированными макрофагами вышеуказанный цитокин играет центральную роль в патогенезе эндометриоза, эффекты секретируемого Т"ОТ-а могут усиливать местные и системные проявления заболевания. Отмечено, что уровень Т"ОТ-а в ПЖ больных эндометриозом повышен, однако не существует единого мнения о корреляции его уровня со степенью заболевания [7].

Интерферон-у (ШЫ-у) — цитокин, секретиру-емый главным образом ТЫ и ЫК-клетками, способствует активации макрофагов и дифферен-

цировке ТЫ, повышению экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и II и молекул адгезии. Есть сообщения, что концентрация ШЫ-у в ПЖ больных эндо-метриозом снижена, по данным других авторов отличий не отмечается. Предполагается, что сниженная активность ЫК-клеток является важным фактором, который способствует имплантации, выживанию и пролиферации занесенных в брюшную полость эндометриальных клеток, хотя механизмы подавления активности ЫК-кле-ток не ясны. Продукция ШЫ-у снижена при недостаточной активности ТЫ и/или ЫК-клеток. Сообщается, что ШЫ-у ингибирует пролиферацию человеческого эндометрия [4].

У больных с НГЭ в ПЖ обнаружена также взаимосвязь между уровнем ШЫ-у и !Ь-2 (коэффициент корреляции 0,86; р < 0,05).

Интерлейкин-2 (ГЬ-2) продуцируется ТЫ и является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов, ЫК-клеток, обеспечивает диффе-ренцировку Т-киллеров и способствует проявлению функциональной активности Т-хелперов. ГЬ-2 усиливает синтез иммуноглобулинов предварительно активированными В-лимфоцитами. Он непосредственно воздействует на моноциты, экспрессирующие рецептор ГЬ-2 [1, 3, 5, 8]. Имеются сообщения, что синтез ГЬ-2 в ПЖ и ПК пациенток с эндометриозом снижен. Это связано с уменьшением содержания активированных Т-лимфоцитов и ЫК-клеток в ПЖ больных эндо-метриозом. Этот феномен усиливается при III-IV степенях распространенности заболевания. Однако исследование М. Gogacz et а1. показало, что у больных эндометриозом с бесплодием концентрация ГЬ-2 в ПЖ повышена [9].

В группе сравнения нами также обнаружена взаимосвязь между уровнем ШЫ-у и ЬЬ-2 (коэффициент корреляции 0,72; р < 0,05).

В случаях рецидивов генитального эндомет-риоза в ПЖ наблюдается взаимосвязь между содержанием ШЫ-у и ТЫБ-а (коэффициент корреляции 0,99; р < 0,05), между ШЫ-у и ЬЬ-2 (коэффициент корреляции 0,79; р < 0,05).

Несмотря на то, что значимые эффекты ци-токинов определяются на ауто- и паракринном уровнях, их определение в ПК также может иметь важное значение для оценки системных механизмов регуляции иммунных реакций при НГЭ.

В ПК при НГЭ наблюдалась тенденция к увеличению содержания !Ь-6, !Ь-10 и !Ь-4 по сравнению с группой пациенток с хроническими воспалительными заболеваниями вне обострения, однако эти отличия не были столь значительны, как в ПЖ. При рецидивах заболевания в ПК также отмечалось повышение концентрации

/и

60

50

9

с; 40

О

О

н т 30

С)

V

^ 20

чО

10

0

-10

-20

Рис. 3. Изменение содержания цитокинов в периферической крови (в % к контролю)

15,00 т

?>

2 10,00

в 5,00 О

0,00 -

0,00 5,00 10,00 15,ОС

СИФ ТЫР-а

Рис. 4. Корреляция между содержанием ШЫ-у и ТЫБ-а у больных НГЭ в периферической крови

вышеуказанных цитокинов.

Значения СИФ цитокинов в ПК было увеличено практически во всех группах по сравнению с контрольной. В группе с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза в стадии ремиссии концентрация ШЫ-у повышалась на 8 %, ТЫБ-а — на 27 %, ¡Ь-2 — на 12 %, ¡Ь-6 — на 20 %, ЬЬ-4 — на 32 %, однако содержание Ш-Ш было ниже на 9 %. Снижение уровня Ш-Ш, который является оппозитным по отношению к провоспа-лительным цитокинам у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза, может являться свидетельством «потенциальной готовности» к обострению воспалительного процесса вследствие снижения «сдерживающих» факторов. В группе больных НГЭ содержание ШЫ-у увеличивалось на 19 %, ТЫБ-а — на 24 %, ¡Ь-2 — на 34 %, ¡Ь-10 — на 19 %, ¡Ь-6 — на 28 %, ТЬ-4 — на 49 %; у пациенток с рецидивами НГЭ содержание ШЫ-у увеличивалось на 18 %, ТЫБ-а — на 29 %, ¡Ь-2 — на 35 %, ¡Ь-10 — на 22 %, ¡Ь-6 — на 32 % и ¡Ь-4 — на 61 % (рис. 3).

Данные, полученные при анализе цитоки-нов ПК, в целом коррелируют с показателями, полученными при исследовании ПЖ однако, результаты были не столь однозначными. Это подтверждает наше представление о том, что наибольшее значение имеет определение цито-

П Группа сравнения ■ НГЭ □ Рецидивы НГЭ

кинов непосредственно в месте развития патологических очагов (ПЖ).

В ПК при НГЭ обнаружена корреляция между 1Ш-у и ТОТ-а (коэффициент корреляции 0,88; р < 0,05), ШК-у и ^-2 (коэффициент корреляции 0,89; р < 0,05) и между ^-10 и ^-4 (коэффициент корреляции 0,89; р < 0,05) (рис. 4).

В группе сравнения в ПК отмечена взаимосвязь между содержанием ШК-у и ^-2 (коэффициент корреляции 0,72; р < 0,05).

При рецидивах НГЭ в ПК установлена взаимосвязь между всеми указанными цитокинами: между №N-7 и ТОТ-а (коэффициент корреляции 0,94; р < 0,05), №N-7 и ^-2 (коэффициент корреляции 0,84; р < 0,05), ^-10 и ^-4 (коэффициент корреляции 0,86; р < 0,05) и также между ^-10 и ^-6 (коэффициент корреляции 0,83; р < 0,05).

Выводы

Наличие корреляции между содержанием ци-токинов ТЫ-типа (1КК-у, ^-2, ТОТ-а) позволяет предположить, что они продуцируются одной клеточной популяцией — ТЫ-клетками, в то время как отсутствие связи между концентрациями цитокинов ТЪ2-типа в ПЖ (^-10, ^-4) может свидетельствовать о различных их источниках происхождения. Важным является определение взаимосвязи между повышением ^-10, ^-6 и ^-4, как в ПЖ, так и в ПК больных с гениталь-ным эндометриозом. Несомненно, наиболее информативным является анализ содержания цито-кинов в ПЖ, однако получение данного материала возможно лишь при инвазивных вмешательствах, которые проводятся по строгим медицинским показаниям. Поэтому выявление взаимосвязи между содержанием вышеуказанных цитокинов в ПЖ и ПК позволяет в дальнейшем, не подвергая пациентку лапароскопическому вмешательству, судить об изменениях данных иммунологических показателей на фоне терапии, основываясь на анализе ПК.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что при НГЭ наблюдается иммунный ответ по ТЪ2-типу, и, следовательно, снижены клеточно-опосредованные реакции, причем эти изменения более выражены при рецидивах заболевания и сочетании НГЭ с аденомиозом. Представленные данные подтверждают целесообразность применения цитокинов и их ансамблей в комплексной терапии генитального эндометриоза.

Автор выражает благодарность за методические рекомендации с. н. с. лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, к. б. н. А. В. Селютину.

Литература

1. Ярилин А. А. Основы иммунологии / Ярилин А. А. — М., 1999.

2. Bedaiwy M. A. Peritoneal fluid environment in endometriosis / Bedaiwy M. A., Falcone T. // Minerva Ginecoligica. — 2003. — Vol. 55. — P. 333-345.

3. Diminished T-lymphocyte proliferative response to polyclonal mitogens in acutebrucellosis patients / Rodriguez-Zapata M., Alvarez-Mon M., Salmeron I. [et al.] // Infection. — 1996. — Vol. 24, N 2. — P. 115-120.

4. Interfeeron-Y gene dinucleotide (CA) repeat and interleukin-4 promoter region (-590C/T) polymorphisms in Japanese patients with endometriosis / Kitawaki J., Koshiba H., Kitaoka Y. [et al.] // Human Reproduction. — 2004. — Vol. 19, N 8. — P. 1765-1769.

5. Jeal W. Aldesleukin (recombinant interleukin-2): a review of its pharmacological properties, clinical efficacy and tolerability in patients with renal cell carcinoma / Jeal W., Goa K. L. // BioDrugs. — 1997. — Vol. 7. — P. 285-317.

6. Kyama C. M. Potential involvement of the immune system in the development of endometriosis / Kyama C. M., Debrock S., Mwenda J. M., D'Hooghe T. M. // Reproductive Biology and Endocrinology. — 2003. — Vol. 1. — P. 123.

7. Serum and peritoneal abnormalities in endometriosis: potential use as diagnostic markers / Gupta S., Agarwal A., Sekhon L. [et al.] // Minerva Ginecoligica. — 2006. — Vol. 58. — P. 527-551.

8. Taniguchi Т. The IL-2/IL-2 receptor system: a current overview / Taniguchi Т., Minani Y. // Cell. — 1993. — Vol. 73. — P. 5-8.

9. The estimation of IL-2 and IL-2 receptors in peritoneal fluid of infertile patients with endometriosis / Gogacz M., Darmochwal-Kolarz D., Putowski L. [et al.] // Central European Journal of Immunology. — 2007. — Vol. 32, N 3.

Статья представлена С. А. Сельковым НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,

Санкт-Петербург

CYTOKINE PROFILE OF PERITONEAL FLUID AND PAERPHERAL BLOOD IN PATIENTS WITH PELVIC ENDOMETRIOSIS

Yarmolinskaya M. I.

■ Summary: We examined peculiarities of cytokine production (IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-10, IL-6 и IL-4) and their ratio in peritoneal fluid and peripheral blood in patients with pelvic endometriosis. It was shown that immune response in patients with pelvic endometriosis is of Th2 type. That is why cell-mediated reactions are decreased; these changes are stronger in cases of en-dometriosis recidives and in combination of endometriosis with adenomiosis. These data prove the use of cytokines and their ensembles in complex therapy of genital endometriosis.

■ Key words: cytokine; pelvic endometriosis; Th1 immune response; Th2 immune response

■ журналъ акушерства и женскихъ болъзней

том lvii выпуск 3/2008

issn 1684-0461