CC BY
57
жТб%*1И“тр“7% Оригинальные статьи
©2004, СПбРОРААКИ
ЦИТОКИНИНДУЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ БИОПОЛИМЕРОВ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ
Запорожец Т.С., Ивануппсо Л.А., Звягинцева Т.Н.*, Молчанова В.Н.*, Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М.**
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН;
* Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН
** Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, Владивосток, Россия
Резюме. Изучено влияние биополимеров морских гидробионтов митилана - гликопротеина из Crenomytilus gray anus, транслама - Р 1,3; 1,6 - D-глюкана из Laminaria cichorioides, зостерина - пектина из морских трав Zosteraceae, фукоидаиа - сульфатированного полисахарида из бурых водорослей Fucus evanescens и тинростима - пептида из оптических ганглиев кальмара Benitiuthis magister на спонтанную и стимулированную митогенамн продукцию цитокинов. Показано, что исследованные биополимеры морских гидробионтов являются мультицитокиновыми индукторами, обеспечивающими увеличение продукции цитокинов, вырабатываемых преимущественно моиоцитами/макрофагами (TNFa, IL-la, IL-8), Thl (IFNy, IL-2), Th2 (IL-4). Зостершг, фукоидан, митилан обладают способностью к преимущественной индукции провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-la, IL-8, IFNy), в действии тинростима и транслама доминирует способность стимулировать продукцию противовоспалительных цитокинов (IL-4). Все исследуемые биополимеры стимулируют продукцию IL-2. В действии исследованных биополимеров на нести-мулированные клетки преобладает регуляторный эффект: исходно низкая продукция цитокина усливаег-ся, исходно высокая ослабляется. Стимулированные клетки отвечают снижением уровня цитокинов в культурах клеток крови с исходно высокой спонтанной продукцией и увеличением продукции при низких концентрациях цитокинов.
Ключевые слова: цитокины, шшупомодуляторы, морские гидробионты.
Zaporozhets T.S., Ivanushko L.A., Zvjagintseva T.N., Molchanova V.N., Besednova N.N., Epshtein L.M.
INDUCED CYTOKINE ACTIVITY WITH BIOPOLIMERS OF MARINE HYDROBIONTS
Abstract. Spontaneous and phytohemagglutinin and E.coli lipopolysccaharide induced production of cytokines in of human peripheral blood supernatants following stimulation by biopolimers isolated from objects of marine flora and fauna was investigated. Five stimuli were utilized: mytilan - carbohydrate-protein-contain biopolmer from mussel Crenomytilus grayanus, translam—hite-molecular - P 1,3; 1,6 - D-glucan from Laminaria cichorioides, fucoidan - sulfated heteropolysaccharide from brown algas Fucus evanescens, tinrostim -poly-peptide complex from optical ganglions of squid Berritiuthis magister and zosterin - pectin from marine grasss of family Zosteraceae. It has been shown that the investigated biopolymers of marine hydrobionts are nulticytokine inductors, ensuring increase of production of cytokines (TNFa, IL - la, IL-8, IFNy, IL-2, IL-4). Mytilan, fucoidan and zosterin have an ability to inducte proinflammatory cytokines (TNFa, IL-la, IL-8, IFNy). Tinrostim and translam stimulate the production of antiinflammatory cytokines (IL-4). All the researched biopolymers stimulate production of IL-2. The investigated biopolymers of marine hydrobionts render regulator effect on unstimulated cells: initially low production of cytokine increases, initially high production of cy-
_____________________________________ tokine decreases. Stimulated by phytohemagglutinin or
Адрес для переписки: E.coli lipopolysaccharide, cells respond by the decrease
Запорожец Татьяна Станиславовна of the level of cytokines in blood cell cultures with ini-
690187, г. Владивосток, ул.Сельская,1 tially high spontaneous production of cytokines and by
Тел.: (4232) 44-24-4, (4232) 53-30-64. theincrease of production in cultures with low concen-
Факс: (4232) 44-14-38 trations of cytokines. (Med.Immunol., 2004, vol.6,
E-mail: niiem_@mail.m № 1-2, pp 89-96)
Введение
В настоящее время цитокины выделены в новую самостоятельную систему регуляции основных функций организма, существующую наряду с нервной и эндокринной системами и связанную, в первую очередь, с поддержанием гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. Скоординированная продукция цитокинов играет ведущую роль в регулировании имунных реакций, контролируя пролиферацию, дифференцировку и функции иммунокомпетентных клеток, а дефекты продукции и секреции цитокинов приводят к дефектам Т- и В-лимфоцитов, фагоцитирующих клеток и естественных киллеров, которые клинически проявляются комбинированными иммунодефицитными состояниями разной степени выраженности с рецидивирующими инфекциями, генерализацией гнойно-воспалительных процессов и другой иммунопатологией [9]. Принципы фармакологической коррекции дефектов цитокиновой сети включают: влияние на продукцию и секрецию цитокинов (стимуляция, ингибиция, восстановление баланса), влияние на экспрессию рецепторов цитокинов (стимуляция, ингибиция или блокада), связывание и выведение избытка цитокина и вмешательство на уровне передачи сигнала от рецептора к ядру на уровне факторов транскрипции [8].
В последние годы результаты, полученные при изучении механизма действия иммуномодуляторов на молекулярном и клеточном уровнях, демонстрируют связь эффектов иммуномодуляции с микроокружением, в котором действуют препараты, включая изменение профиля цитокинов [9]. Углубленное исследование цитокинопосредованного взаимо-
действия клеток иммунной системы и факторов, влияющих на нее, представляется перспективным, так как открывает принципиально новые подходы к терапии ряда заболеваний.
Ранее нами в различных экспериментальных моделях in vitro и in vivo показана способность биополимеров морских гидробиоитов оказывать выраженный защитный эффект при экспериментальных инфекциях, стимулировать гуморальный и клеточный иммунный ответ, фагоцитарную активность макрофагов и нсйтрофилов [2,3,4].
Целью настоящего раздела работы явилось изучение влияния полисахаридов, углевод-белковых комплексов и пептидов, выделенных из морских гидробионтов, на спонтанную и стимулированную продукцию цитокинов, вырабатываемых преимущественно Thl (IL-2 и IFNy), Th2 (IL-4) и мононукле-арными фагоцитами (TNFa, IL-la, IL-8).
Материалы и методы
В работе использовали биополимеры из объектов морской флоры и фауны Тихого океана: итилан
- гликопротеин, выделенный из мантии мидии СгепотуШштранслам-1,3; 1,6 - Р- Б-гл 10-кап, полученный из морской водоросли Ьаттапа ск!гопо1с1е$1 фукоидан - сульфатированный полисахарид из бурых водорослей Риси.ч evanescens, зосте-рин - пектин из морских трав семейства 1о51егасеае, тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара ВетйшЫэ magister.
При изучении синтеза цитокинов 0,6 мл свежей гепаринизированной крови (20 МЕ/мл) доноров смешивали с 2,4 мл среды КРМ1-1640 («Бегуа»)
Табл.1. КОНЦЕНТРАЦИЯ №сс (рд/ш1) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДОНОРОВ С ИСХОДНО НИЗКИМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНА (СПОНТАННОЙ И СТИМУЛИРОВАННОЙ ФГА)
Исследуемый биополимер Спонтанная продукция TNF? Стимулированная ФГА продукция TNF?
Доноры М±т Доноры М±т
1 2 3 4 5 8 1 2 3 4 5 6
Контроль 1,5 8.8 О 0 3,4 0 2,3±3,5 25 34 38 64 98 83 57*29
Митилан 54 340 110 105 50 48 117*112“ 370 450 300 440 248 194 381*104'
Транслам 79 64 42 260 110 72 104*79” 540 280 185 330 400 350 347*128*
Фукоидан 280 370 320 430 240 155 299*97" 500 380 320 500 390 500 431*78“
Зостерин 408 520 480 500 420 370 449*59“ 340 540 540 620 500 500 490*75"
Тинростим 2,5 22 55 2 40 2 20,8*22,7 215 200 140 100 160 200 169*44'
Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01 • показатель достоверности различий по отношению к контролю (использован непараметрический Х-критерий Ван-дер-Вардена)
с добавлением 2 мМ глутамина («ПанЭко») и 80 мкг/мл гентамицина. В 96-луночиый планшет в лунки каждого ряда вносили по 100 мкл среды 11РМ1-1640. Подготовленные образцы периферической крови тщательно перемешивали и вносили по 100 мкл во все лунки ряда. При исследовании спонтанного синтеза цитокинов исследуемые биополимеры добавляли в лунку в конечной концентрации 100 мкг/мл (митилан, транслам, зостерин, фукои-дан), 0,01 мкг/мл (тинростим). Синтез 1Ь-1а индуцировали лиггополисахаридом (ЛПС) Е.соП («Sigma») 100 мкг/мл в течение 24 часов, 1Ь-2, И-4, 1Ь-8, ТЫИа - фитогемагглютинином (ФГА) («Бегуа») 10 мкг/мл в течение 24 часов, 1РЫ-у- ФГА 10 мкг/мл 72 часа. Костимулирующее влияние исследуемых биополимеров изучали при их совместном действии с ФГА и ЛПС. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С02, после чего отбирали супернатанты и определяли концентрацию цитокинов методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-сис-тем «Протеиновый контур» (1Ь-8,1РЫ-у. П--4,11.-2) и «Цитокин» (ТОТос, 1Ь-1а) в соответствии с прилагаемой к наборам инструкцией.
Результаты обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением г-критерия Стьюден-
та [1] и непараметрического Х-критерия Ван-дер-Вардена [7]. Для описания основных тенденций и дисперсии распределений изучаемых признаков рассчитывали средние значения (М) и ошибки средней (т).
Результаты
Исследуя цитокининдуцирующую активность биополимеров морских гидробионтов, мы принимали во внимание тот факт, что интенсивность продукции цитокинов, вырабатываемых в контрольных образцах крови, отличается заметной гетерогенностью у различных доноров и не является стабильным генетически детерминированным признаком [9]. Такие различия были выявлены и в наших экспериментах. Значения концентраций ТЫБа, измеренные в супернатантах, указывали на стимуляцию продукции цитокииа у всех доноров с исходно низкой его продукцией при внесении в пробы крови митилана, транаслама, зостерина и фукоидана. Тинростим в трех случаях из 6 вызывал незначительное увеличение концентрации ци-токина, в трех - не оказывал влияния на продукцию ТЫР-а. Средний показатель в группе недостоверно отличался от контроля (табл.1). Кости-
Табл. 2. КОНЦЕНТРАЦИЯ Шос (рд/т1) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА С ИСХОДНО ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНА
Исследуемый биополимер Спонтанная продукция ТМЯа Стимулированная ФГА продукция Т^а
Контроль 1200±257 1487±294
Митилан 600*128* 1256*184*
Транслам 1175*248 1185*209*
Фукоидан 1005±342 1020±258*
Зостерин 989*220 1200*209*
Тинростим 1000*220 1584*299
Примечание: * - р<0,05 - показатель достоверности различий по отношению к контролям Табл.З. КОНЦЕНТРАЦИЯ И-1а (рд/т!) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДОНОРОВ
Исследуемый Доноры
биополимер 1 2 3 4 5 6 7 М±т
Контроль (спонтанная продукция цитокина) 9 19 10 6 9 5 4 9,3±5,1
Митилан 9 8 12 10 10 5 5 9,8*2,6
Транслам 8 10 10 6 12 5 5 8,5*2,7
Фукоидан 10 45 16 10 12 15 12 20*12*
Зостерин 18 160 75 10 35 15 38 89*53"
Тинростим 8 8 10 6 10 7 8 9,5*1,4
Примечание: * - р<0,05; 5** - р<0,01 - показатели достоверности различий по отношению к контролям (использован непараметрический Х-критерий Ван-дер-Вардена)
мулирующий эффект проявился при использовании всех исследуемых препаратов при их действии на индуцированную ФГА секрецию ТЫБа с исходно низкими значениями цитокина (табл.1). При увеличении исходного уровня ТИРа в среде инкубации до 1200 pg/ml стимуляции спонтанной продукции цитокина не происходило (табл.2). Стимулированный ФГА синтез ТКТа в культурах клеток крови с исходно высокой спонтанной продукцией снижался (при добавлении митилана, транслама, фукоидана и зостерина) либо не изменялся (тинростим) (табл.2).
Спонтанная продукция 1Ь-1а лейкоцитами периферической крови доноров находилась в пределах от 4 до 19 Р8/т1. Стимулирующий эффект был выявлен при внесении в образцы исследуемой крови фукоидана и зостерина. Транслам, митилан и тинростим не вызывали статистически значимого изменения концентрации 1Ь-1а в супернатантах (табл.З). Костимулирующий дозозависимый эффект проявился при использовании фукоидана и зостерина - препаратов, активных в отношении стимуляции спонтанной продукции цитокина (контроль ЛПС-стимулированной продукции 1Ь-1а -46±13 pg/ml, фукоидан - 88±17 pg/ml (р<0,05), зо-стерин - 97±21 pg/ml (р<0,05).
При исследовании влияния биополимеров морских гидробионтов на спонтанную продукцию хе-маттрактанта 1Ь-8 лейкоцитами периферической
крови установлены закономерности, выявленные в предыдущих экспериментах. У всех доноров с исходно средненормальными значениями наблюдалась выраженная стимуляция цитокина (табл.4). При добавлении исследуемых биополимеров в культивируемую периферическую кровь доноров с повышенной спонтанной продукцией 1Ь-8 тинростим оказывал модулирующее действие, снижая спонтанный уровень цитокина в супернатантах, остальные препараты не изменяли содержания П.-8 (табл.4). Увеличение концентрации 1Ь-8 в супернатантах образцов крови доноров до 1200-1500 pg/ml не вызывало стимуляции синтеза цитокина в ответ на ФГА. В этом случае митилан, транслам, зостерин и фукоидан не проявляли костимулирующего действия, а тинростим снижал концентрацию 1Ь-8 в кондиционной среде. В том случае, когда исходный уровень продукции цитокина был невысоким, все исследуемые препараты, за исключением тинрости-ма, проявляли костимулирующее действие, увеличивая концентрацию цитокина в супернатантах (табл.5).
Спонтанная продукция 1РЫулейкоцитами периферической крови доноров находилась в пределах от 0 до 24 pg/ml. Статистически значимый стимулирующий эффект был выявлен при внесении в образцы исследуемой крови углеводсодержащих биополимеров фукоидана, зостерина, митилана и транслама (табл.6). При их действии на индуцированную
Табл.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ 11.-8 (рд/т1) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА С ИСХОДНО СРЕДНЕНОРМАЛЬНЫМ И ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНА (СПОНТАННОЙ)
Исследуемый биополимер Исходно средненормальный уровень продукции цитокина Исходно высокий уровень продукции цитокина
Доноры М±т Доноры М±т
Контроль 1 2 3 3 5 1 2 3
(спонтанная
продукция цитокина) 72 22 15 170 19 59±49 1400 1520 980 1280±213
Митилан 1680 1250 1270 1650 1180 1370±207*** 1560 1600 920 1360±293
Транслам 140 1280 1290 1290 1100 1020±352** 1320 1700 950 1323±251
Фукоидан 1700 1400 1650 1650 1540 1588±94*** 1540 1450 890 1293±242
Зостерин 1650 1680 1650 1650 1270 1580±124*** 1100 1520 800 1140*253
Тинростим 1680 1445 1400 1400 1320 1449±92“** 170 1400 650 740±440
Примечание: * - р<0,05, **- р<0,01, *** - р<0,001 - показатели достоверности различий по отношению к контролям (использован непараметрический Х-критерий Ван-дер-Вардена)
Табл.5. КОНЦЕНТРАЦИЯ И-8 (рд/т!) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДОНОРОВ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ ФГА
Исследуемый биополимер Исходно средненормальный уровень спонтанной продукции цитокина Исходно высокий уровень спонтанной продукции цитокина
Контроль (стимулированная ФГА продукция ТЫРа) 135 ±45 1360 ±20
Митилан 657 ± 89** 1360 ±106
Транслам 1130 ±173" 1290 ±56
Фукоидан 1380 ±105"* 1325 ±86
Зостерин 1350 ±168" 1083 ±288
Тинростим 216 ±29 610 ±17"*
Примечание: * - р<0,05, **- р<0,01, *** - р<0,001 - показатели достоверности различий по отношению к контролям
Табл. 6. КОНЦЕНТРАЦИЯ 1ГОу И И-2 (рд/т1) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДОНОРОВ (СПОНТАННОЙ И СТИМУЛИРОВАННОЙ ФГА)
Исследуемый биополимер Концентрация 1РМу в супернатантах Концентрация 11.-2 в супернатантах
Спонтанная продукция цитокина Стимулированная ФГА продукция цитокина Спонтанная продукция цитокина Стимулированн ая ФГА продукция цитокина
Средненормальный уровень 1РЫу после стимуляции ФГА Высокий уровень 1РМу после стимуляции ФГА
Контроль 11,2±3,6 423*42 1323±152 395±14 463*22*
Митилан 31±6,8* 405±37 805±180" 583±46* 433±35
Транслам 44±8,7" 389±69 849±169* 520±40* 393*18
Фукоидан 109±12,6" 396±75 796±175‘ 677±51* 390±35
Зостерин 32±7,9‘ 423±52 823±122* 803±223* 398*42
Тинростим 10,0±9,2 441±45 1101*215 520±40* 400±44
Примечание: * - р<0,05, **- р<0,01 - показатели достоверности различий по отношению к контролям
Табл.7. КОНЦЕНТРАЦИЯ И-4 (рд/т!) В СУПЕРНАТАНТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДОНОРОВ С ИСХОДНО НИЗКИМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНА (СПОНТАННОЙ И СТИМУЛИРОВАННОЙ ФГА)
Исследуемый биополимер Спонтанная продукция 1Ь4 Стимулированная ФГА продукция 11.-4
Средненормальный уровень 11.-4 после стимуляции ФГА Высокий уровень 11-4 после стимуляции ФГА
Доноры М±т Доноры М*т Доносы М±т
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7
Контроль 0 0 0 1.2 1,0 1,0 0,53*0,54 5 30 32 0 16,8*15 11 8 15 6 14 0 138*19,1
Митилан 28 32 32 66 12 10 30,0*20,1" 0 30 10 40 20,0*18,2 10 12 5 9,0*3,6”
Транслам 35 122 133 12 35 10 57,8*55,1 •* 1 40 30 5 20,3*18 30 32 10 24*12,1"
Фукоидан 12 28 32 58 12 10 25,3*18,5" 5 40 28 0 18,2*18,9 5 12 10 9,0*3,6"
Зостерин 42 12 10 32 10 10 19,3*14,1" 2 28 10 5 11,2*11,6 2 2 5 3,0*1,7”*
Тинростим 30 30 105 155 12 10 57,0*59,3" 5 32 30 0 16,8*16,6 5 2 2 3,0*1.7*”
Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01 - показатель достоверности различий по отношению к контролю (использован непараметрический Х-критерий Ван-дер-Вардена)
ФГА продукцию 1РЫу выявлен модулирующий эффект: внесение исследуемых биополимеров в образцы крови доноров, клетки которых отвечали высокой секрецией 1РИу в ответ на ФГА, приводило к снижению концентрации цитокина в супернатантах и не изменяло его уровень в интервале средненормальных значений (табл.6).
Все исследуемые биополимеры морских гидро-бионтов увеличивали спонтанную продукцию 11.-2 лейкоцитами периферической крови. Внесение ФГА в образцы цельной крови доноров приводило к стимуляции продукции 11.-2. Добавление исследуемых биополимеров не изменяло уровень его секреции (табл.6).
Спонтанная продукция 11.-4 в супернатантах проб периферической крови всех доноров была низкой (пип-шах - 0 - 1,2 pg/ml). Внесение биополимеров морских гидробионтов в образцы цельной крови доноров приводило к усилению секре-
ции цитокина, выявляемому во всех индивидуальных пробах (табл.7). Наибольшую активность в отношении стимуляции 11.-4 проявляли транслам и тинростим. Средние значения в группах с высокой степенью достоверности превышали показатели контроля (для обработки данных использовали непараметрический Х-критерий Ван-дер-Вардена). Внесение ФГА в образцы цельной крови доноров приводило к неодинаковой стимуляции секреции цитокина. В том случае, когда концентрация 11.-4 в супернатантах ФГА-стимулиро-вапных образцов крови находилась в интервале средненормальных значений (0'32 рд/т1), добавление исследуемых биополимеров не изменяло уровень его секреции. Инкубирование препаратов с кровью доноров, клетки которых отвечали высокой секрецией 11.-4 в ответ на ФГА, приводило к снижению концентрации цитокина в супернатантах (табл.7).
Обсуждение
Обсуждая результаты, демонстрирующие способность биополимеров морских гидробионтов стимулировать in vitro продукцию разнообразных ди-токинов, следует принимать во внимание обстоятельства общего характера, связанные с процессами клеточной активации. Решающим моментом в регуляции имунной реакции является согласованная продукция цитокинов после активации лимфоцита [14], обусловленная изменением количественных аспектов экспрессии генов цитокинов и белковой секреции [15, 16,17].
Полученные нами данные позволяют заключить, что биополимеры морских гидробионтов - митилан, транслам, фукоидан, зостерин, тинростим - являются мультицитокиновыми индукторами, обеспечивающими увеличение продукции цитокинов, вырабатываемых преимущественно как моноцитами/макрофагами (TNFa, IL-la, IL-8), так и Thl (IFNy, IL-2) и Th2 (IL-4). При этом, зостерин, фукоидан и митилан обладают способностью к преимущественной индукции провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-la, IL-8, IFNy), в то время как в действии тинростима и транслама доминирует способность стимулировать продукцию противовоспалительных цитокинов (IL-4). Способность исследуемых препаратов влиять па продукцию IL-2, экспрессия генов которого происходит параллельно с активацией клетки, доказывает их роль в процессах активации.
При интерпретации результатов, полученных в экспериментах с цельной кровыо, когда в продукции, секреции и рецепции цитокинов могут участвовать Т-, В-лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, нейтрофилы, тромбоциты, необходимо принимать во внимание возможность каскадных эффектов, что не исключает одновременной продукции и секреции клетками цитокинов, являющихся антагонистами. В то же время, максимальный уровень экспрессии генов и продукции цитокинов различается при использовании разных стимулов [13]. Так, количество мРНК, кодирующих IL-2 и IFNy при стимуляции мононуклеаров ФГА или анти-СБЗ, намного превышающее количество мРНК, кодирующих IL-6, IL-10, TNFa [13], доказывают, что действие этих двух стимулов направлено прежде всего на Т-клетки и, в гораздо меньшей степени, на моноциты, основные продуценты IL-6, TNFa и IL-10.
Относительная избирательность действия исследуемых биополимеров свидетельствует скорее об однонаправленном, а не об альтернативном действии биополимеров на продукцию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Подоб-
ная закономерность прослежена в работе [5] при изучении влияния тимических пептидов на синтез и внутриклеточное содержание IL-4 и IFNy. Авторы, показавшие одновременное увеличение численности активированных CD3+ Т-клеток, содержащих в цитоплазме и IL-4 и IFNy под действием тимоге-на, делают вывод, что пептид действует не на диф-ференцировку Т-лимфоцитов, а лишь на синтез соответствующих цитокинов. При сопоставлении до-зовой зависимости влияния пептида на секрецию и внутриклеточное содержание IFNy была обнаружена дискорданность действия пептида па эти показатели, что, по мнению авторов, свидетельствует о независимости этих признаков.
Зарегистрированный исследователями факт одновременной продукции многочисленных цитокинов популяцией стимулированных Т-клеток [13,15, 16] вызвал дискуссию о предполагаемых механизмах регуляции - либо общих, либо независимых. Противоречивые данные в литературе поддерживают обе возможности. Заключения о способах регулирования независимыми путями основаны на количественных различиях IFNy, IL-2, и IL-2R, продуцируемых стимулированными лимфоцитами периферической крови [15, 16], а также на количественных различиях в экспрессии генов цитокинов [13]. В основу предположения об общем пути регуляции положены данные об одновременной (от 1 до
4 ч после стимуляции) индукции экспрессии IL-2, IFNy, TNFa, IL-6 и IL-10 мРНК [И, 12, 13], позволяющих отнести их к ранней [19] группе генов. Авторы полагают, что механизмы, посредством которых регулируется продукция разных цитокинов, могут быть независимыми, однако их транскрипция индуцируется одновременно. Это положения дополнительно подтверждают сообщения о способности к продукции почти всех цитокинов ThO [18], IL-2, IFNy, IL-4 СБ4+Т-клетками здоровых доноров в ответ на стимуляцию различными митогенами [13], а также данные, показывающие, что IL-2 и IFNy-гены имеют гомологичные последовательности в их
5 “ конце [18].
Учитывая данные литературы и собственные результаты, мы полагаем, что усиление продукции цитокинов клетками периферической крови доноров при инкубации с биополимерами морских организмов может быть обусловлено их влиянием на экспрессию генов, транскрипцию мРНК и внутриклеточный синтез белка.
Следует отметить, что, несмотря на способность исследуемых биополимеров стимулировать продукцию TNFa и IL-la in vitro, их введение in
vivo не сопровождается какими-либо нежелательными эффектами, характерными для парентерального введения этих цитокинов. Вполне очевидно, что в условиях in vivo избыточность продукции цитокинов ограничивается существованием всех видов регуляторных механизмов ауто- и интра-около-, ретро- и паракрииных [6]. В частности, считается, что при аутокринной регуляции формируется эффективная аутогенная регуляторная дуга (АРД), где продукт секреции осуществляет механизм обратной связи в отношении клетки, которая его продуцировала [6]. Принцип действия АРД хорошо объясняет модулирующий эффект исследуемых биополимеров, зависящий от исходного уровня цитокинов. При низкой концентрации индуцирующего агента клетка продуцирует продукт, связывающийся с его собственным рецептором на этой же клетке, и тем самым стимулирующий ее пролиферацию. Высокие концентрации того же агента подавляют экспрессию рецепторов к продукту, что обусловливает подавление пролиферации клетки в результате снижения количества рецепторов [6]. В работе [13] также приводятся факты о неодинаковой активации кон-ституитивной низкой экспрессии генов цитокинов здоровых доноров в течение выделения и культивирования клеток, обусловливающих различия в уровне спонтанной продукции цитокинов, а также функциональных свойств (пролиферативных, цитотоксических и др). В наших исследованиях эти допущения были учтены при анализе и интерпретации полученных результатов, что позволило выявить регуляторный эффект исследуемых биополимеров, выражающийся в усилении исходно низкой и ослаблении исходно высокой продукции цитокинов.
В целом, результаты, представленные в этой главе, демонстрируют способность биополимеров морских гидробионтов к индукции ряда регуляторных цитокинов иммуиокомпетентными клетками, что может определять их эффективность в качестве иммуномодулирующих препаратов при состояниях, сопровождающихся развитием вторичной иммунной недостаточности.
Выводы
1. Биополимеры морских гидробионтов (митн-лан, транслам, фукоидан, зостерии, тинростим) являются мультицитокиновыми индукторами, обеспечивающими увеличение продукции цитокинов, вырабатываемых моноцитами/макрофагами (TNFa, IL-la, IL-8), Thl (IFNy, IL-2), Th2 (IL-4).
2. Зостерин, фукоидан, митилан обладают способностью к преимущественной индукции провос-палительных цитокинов (TNFa, IL-la, IL-8, IFNy), в действии тинростима и транслама доминирует способность стимулировать продукцию противовоспалительных цитокинов (IL-4).
3. Все исследуемые биополимеры стимулируют продукцию IL-2.
4. В действии исследованных биополимеров на нестимулировагшые клетки преобладает регуляторный эффект: исходно низкая продукция цитокина усиливается, исходно высокая ослабляется. Стимулированные клетки отвечают снижением уровня цитокинов в культурах клеток крови с исходно высокой спонтанной продукцией и увеличением продукции при низких концентрациях цитокинов.
Список литературы
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях - Л,-1962,- 180 с.
2. Гажа А.К. Иммуноактивный пептид из оптических ганглиев кальмара. Дис. канд. м.н. Владивосток. 1994.
3. Запорожец Т.С. Иммуностимулирующая активность биогликанов морских беспозвоночных. Ав-тореф. дис.... канд. мед. наук,- М., 1986.
4. Игнатенко Л.А. Иммуномодулирующие и ра-диозащитные свойства транслама: Автореф. дис.... канд. мед. наук,- Владивосток, 1994.
5. Ким К.Ф., Климова С.В., Дьяконова В.А., Никонова М.Ф., Григорьева Т.Ю., Дентин В.И., Пи-негин Б.В., Ярилин А.А. Влияние тимических пептидов на синтез и внутриклеточное содержание некоторых цитокинов // Иммунология.-2002.-№5.-С.274.
6. Козлов В.А.. Некоторые аспекты проблемы цитокинов // Цитокины и воспаление,- 2002.-Т.1.-№ 1,- С. 5-8.
7. Лакнн Г.Ф. Биометрия. Уч. пособие для биол. спец. вузов,- 3 изд. - М.: Высш. шк. - 1980.- 293 с.
8. Фрейдлин И.С. Дефекты цитокиновон сети и принципы их коррекции //Иммунология,- 1998,- № 6,- С.23.
9. Чекановская Л.А., Генералов А.В. Влияние препарата гамма-плант на продукцию TNFa, IL-ip и IL-6 мононуклеарами периферической крови человека in vitro // Вопросы Медицинской Химии. -2001,- Т. 47. - Вып. 2,- С.34-41.
10. Ярилин А.А. Основы иммунологии М.: Медицина, 1999. - 606 с.
11. Efrat S., Kaempfer R.Control of biologically active interleukin 2 messenger RNA formation in induced human lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1984.-V. 81- P.2601-2605
12. Efrat S., Pilo S., Kaempfer R. Kinetics of induction and molecular size of RNAs encoding human in-terleukin-2 and -interferon //Nature.- 1982,- V.297.-P.236-239.
13. Fan J., Nishanian P., Breen E.C., McDonald M„ Fahey J.L. Cytokine gene expression in normal human lymphocytes in response to stimulation // Clin.and Diagn. Laboratory Immunol.-1998.-№ 3 V.5.- P.335-340.
14. Fraser J. D., Straus D., Weiss A. Signal transduction events leading to T-cell lymphokine gene expression //Immunol. Today.- 1993. -№ 14.- P. 357-361.
15. Gauchat J.-F., Gauchat D., De Week A.L., Sta-dler B.M. Cytokine mRNA levels in antigen - stimulat-
ed peripheral blood mononuclear cells // Eur. J. Im-munol.-1989.- V.19.- P.1079-1085.
16. Gauchat J.-F., Walker C., De Week A.L., Sta-dler B.M. Stimulation- dependent lymphokine mRNA levels in human mononuclear cells // Eur, J. Immunol.
- 1985,- V.18- P.1441-1446.
17. Crabtree G.R. Contingent genetic regulatory events in T lymphocyte activation // Science.- 1989. -V. 243,- P.355-361.
18. Mita S., Maeda S., Obaru K., Nishino N„ Shimada K., Hirano Т., Onoue K., Ogawa Т., Ogawa H. Isolation and characterization of a human interleukin 2 gene // Bio-chem. Biophys. Res. Commun.-. 1983.- V. 117,-PI 14-121.
19. Ullman K. S.,. Northrop J. P., Verweij C. L., Crabtree G. R. Transmission of signals from the T lymphocyte antigen receptor to the genes responsible for cell proliferation and immune function: the missing link // Annu. Rev. Immunol. - 1990.-Vol. 8.- P.421-452.
поступила в редакцию 20.02.04 отправлена на доработку 05.03.04 принята к печати 19.03.04
