CC BY
75
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 575+575(470.67)
ЦИТОГЕНЕТИКА МАЛЯРИЙНОГО КОМАРА ANOPHELES PLUMBEUS STEPH.
®2011 Алиева З.А., Джамалутдинова Т.М., Джахбарова З.М., Гаджиева С.С.
Дагестанский государственный педагогический университет
В статье представлены результаты изучения структуры рДНКу малярийного комара An. plumbeus Steph. и разработка специфических праймеров для молекулярной диагностики данного вида. Анализ нуклеотидного состава выявил значительные различия в структуре ITS2 и впервые позволил подобрать видоспецифичные праймеры для An. plumbeus Steph.
The article represents the results of studying the structure of rDNA of An. plumbeus Steph. malarial mosquito and the development of the specific primers for the molecular diagnostics of the given species. The analysis of the nucleotide structure revealed the considerable distinctions in ITS2 structure and for the first time allowed to select the species-specific primers for An. plumbeus Steph.
Ключевые слова: рибосомная ДНК, праймер, ген, нуклеотид, комар.
Keywords: ribosomal DNA, primer, gene, nucleotide, mosquito.
Одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биологии является создание новой систематики, которая призвана дополнить
традиционные способы определения видов молекулярными методами
диагностики. Особенно актуальна разработка молекулярных методов диагностики для близкородственных видов малярийных комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae). Процесс эволюции и адаптивной специализации малярийных комаров слабо затронул морфологические признаки, поэтому среди представителей рода Anopheles сформировались группы видов-двойников. Несмотря на
морфологическое сходство, эти виды экологически изолированы и отличаются по способности передавать малярию.
Эффективным методом диагностики видов-двойников является полимеразная цепная реакция. В настоящее время для выявления межвидовых различий
изучается структура рДНК. Рибосомная ДНК малярийных комаров, как и у других эукариот, представлена в геноме множеством копий тандемно
повторяющихся транскрипционных единиц. Каждая транскрипционная единица состоит из областей, кодирующих три рибосомные
субъединицы - 18S, 5,8S и 28S. Эти области разделены двумя внутренними транскрибируемыми спейсерами 1 и 2. Структура и длина второго внутреннего транскрибируемого спейсера ITS2 различны у разных видов малярийных комаров [3].
Задачей настоящей работы было изучение структуры ITS2 у An. plumbeus Steph и разработка специфических праймеров для молекулярной
диагностики данного вида. В работе использовали фиксированных в спирте личинок An. plumbeus Steph. Молекулярный анализ впервые по этому виду комара выполняли в лаборатории
популяционной генетики Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН. Для выделения ДНК использовали набор для выделения ДНК DIAtomTM DNA Prep (Isogene, Москва), принцип которого основан на использовании лизирующего реагента с
гуанидинтиоцианатом. В реакцию амплификации брали 0,1 мкг выделенной тотальной ДНК.
ПЦР с образцами ДНК An. plumbeus Steph проводили с использованием праймеров, описанных ранее [1, 3].
Последовательность прямого праймера была комплементарна консервативной области 5.8S рДНК (5-TGTGAACTGCA GGACACATG-3'), обратный праймер был выровнен против консервативной области 28 S рДНК (5'-atgcttaaattta gggggta-3'). ПЦР проводили по условиям, описанным ранее [4] на термоциклере GeneAmpR PCR System 2700 (Applied Biosystems, USA). Результаты полимеразной цепной реакции проверяли электрофорезом в 1-2% геле (Agarose Type I, Sigma).
Для секвенирования продукты амплификации выделяли из геля, используя набор JETQUICK Gel Spin Kit (Genomed). Секвенирование продуктов
амплификации проводили на
автоматическом секвенаторе ABI 373 (Applied Biosystems, USA) с использованием ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Последовательность,
полученная в результате секвенирования продуктов амплификации, была зарегистрирована в GeneBank. Выравнивание полученных
нуклеотидных последовательностей с последовательностями базы данных GeneBank и филогенетический анализ проводили с использованием пакета
филогенетических программ CLUSTAL X 1,8 [5] и Genebee.
ПЦР со специфическими праймерами проводили в следующих условиях:
предварительная денатурация - +94°С, 2 мин; после чего 25 циклов: денатурация -15 сек при +94°С, отжиг праймеров - 15 сек при +59°С, синтез - 20 сек при +72°С;
завершающий синтез - 6 мин при +72°С. Для специфической амплификации брали по 20 нг ДНК, по 44 пкМ универсального праймера и по 20 пкМ специфического. Концентрации специфических праймеров, использованные в ПЦР, рассчитывали исходя из нуклеотидного состава праймеров по программе Oligo calculator (Kubarenko A.V.). Общий объем смеси составлял 25 мкл. В качестве прямого праймера использовали универсальный праймер, комплиментарный 5,8S рДНК. При проведении ПЦР со смесью специфических праймеров в комбинации с прямым универсальным 5,8S праймером смешивали 0,1 мкг ДНК одного из видов Anopheles, 44 пкМ универсального праймера, комплиментарного 5,8S рДНК и по 20 пкМ смеси всех видоспецифичных праймеров.
В результате ПЦР с праймерами, специфичными для генов 5,8S и 28S рРНК, были получены продукты амплификации (область второго транскрибируемого спейсера,
фланкированного участками 5,8- и 28S рДНК) для An. plumbeus Steph. Размеры продуктов амплификации представлены в таблице 1. Для сравнения в таблице приведены размеры продуктов амплификации, полученных у
родственных видов малярийных комаров.
Таблица 1
Продукты амплификации, полученные для результате ПЦР с праймерами, специфичными к генам 5,8S и 28S рДНК
Вид Размер продукта, п.н.
An. maculipennis Mg. -390
An. messeae Fall. -410
An. beklemishevi Steg. -750
An. claviger Mg. -500
An. plumbeus Steph. -400
Продукт амплификации был секвенирован. Нуклеотидная
последовательность 1Т82 Ап. р1итЬеш Steph. была зарегистрирована в СспсВапк под номером А1555483 (рис.). Область второго внутреннего транскрибируемого спейсера у Ап. р1итЬеш Steph. определена впервые.
1 tataagttga acgcatattg cgcatcgtgc gacacagcat gatgcacaca tttttgagtg
61 cctatattta tactatcatt caaactacga ggtggggccc ccgccgggtt ccatcgcgtg 121 catattgatg cgttgacctt ctgctagcag aatctcaaac attcaaaacc gcgtagcatg 181 ttctcgcatc tgggtggctt cggcctaccc gcttgcttgc gtgtgccagt ccaacgcctc 241 accaacgtcc cgttggatcg tgtgcgttcg gtactggagt actgcagctt gcagcaggat 301 gtagcagaac ggcaacacgc caagaccggg gaaagatagt agccctcaaa taataatgcc 361 ggccaaaa
Рис. Нуклеотидный состав второго внутреннего транскрибируемого спейсера ITS2 рДНКу An. plumbeus Steph.
Нуклеотиды 1-80 относятся к участку гена 5,88 рДНК; нуклеотиды 81-329 -второй внутренний транскрибируемый спейсер ГГ82 (выделен жирным шрифтом); нуклеотиды 330-368 -
участок гена 288 рДНК.
У Ап. р1шпЬеш 81ерЬ. процентный состав ОС достигает 53,6%. Гомология 1Т82 у Ап. р1итЬеш 81ерЬ. с 1Т82 у Ап тасиПрепшз составила 54%.
Специфический праймер для
Анализ нуклеотидного состава выявил значительные различия в структуре 1Т82 у сравниваемых видов малярийных комаров и впервые позволил подобрать видоспецифичные праймеры для Ап. р1итЬеш 81ерЬ. В таблице 2 приводится обратный праймер. В качестве прямого праймера использовался универсальный праймер, предложенный ранее [4].
Таблица 2
диагностики Ап. р1итЬеш Н1ерк.
Вид Название праймера Нуклеотидная последовательность Температура отжига Длина продукта, н.п.
An.plumbeus Steph. Арі 5'-cgaagccacccagatgcgagaacat-3' 59 226
В результате амплификации с видоспецифичным праймером для Ап. рІитЬеш 8іер1і. был получен фрагмент 226 п.н. В опытах с этим праймером для чужих видов ДНК не
амплифицировалась.
Метод ДНК-диагностики открывает новые возможности для изучения биологии переносчиков.
Перспективными направлениями
молекулярно-генети-ческих исследований малярийных комаров
являются: идентификация видов,
совместно обитающих в различных географических регионах; выявление криптических (скрытых) видов и оценка филогенетических связей; анализ
изменчивости генетических маркеров, используемых для диагностики переносчиков; определение
Примечания
генетических процессов в популяциях. В этих целях впервые были исследованы размер и структура 1Т82 у дупляного малярийного комара Ап. р1итЬеш 81ерЬ. Хотя этот вид считается второстепенным переносчиком малярии, его
эпидемиологическое значение зависит от условий обитания. Важной задачей является выявление внутривидовых группировок с различной экологической специализацией у Ап. р1шпЬеш 81ерЬ. В данной работе получены данные о составе 1Т82 у особей из природной популяции дупляного малярийного комара. В дальнейшем необходимо исследовать структуру 1Т82 у формирующихся городских рас Ап. р1итЬеш 81ерЬ. - потенциального переносчика тропической малярии в Западной и Центральной Европе [2].
1. Collins F.H., Paskewitz S.M. A review of the use of ribosomal DNA (rDNA) to differentiate among cryptic Anopheles species // Insect Molecular Biology. 1996. V. 5. P. 1-9. 2. Marchant P., Eling W„ van Gemert G.-J., Leake C.J. Curtis C.F. Could British mosquitoes transmit falciparum malaria // Parasitology Today. 1998. V. 14. P. 344-345. 3. Porter C.H. Collins, F.H. Species-diagnostic differences in a ribosomal DNA internal transcribed spacer from the sibling species Anopheles freeborni and Anopheles hermsi (Diptera: Culicidae) // American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 1991. V. 45. P. 271-279. 4. Proft J„ Maier W.A. Kampen H. Identification of six sibling
species of the Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) by a polymerase chain reaction assay // Parasitology Research. 1999. V. 85. P. 837-843. 5. Thompson J. D., Gibson T. G., Plewniak F. Jeanmougin F. Jiggins D. G. The Clustal X windows interface flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic Acids Research. 1997. V. 24. P. 4876-4882.
CmambH nocmynujia epedaKifuio 18.04.2011 z.
