CC BY
8
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2010 УДК 614.72:616-018.73-053.6-076.5:575
J1. П. Сычева', С. И. Иванов', М. А. Коваленко', В. С. Журков', Н. Н. Беляева', Б. М. Анциферов2
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ ВБЛИЗИ ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОГО КОМБИНАТА
'ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва; Территориальный отдел ТУ Роспотребнадзора по Архангельской области в Коряжме, Вилегодском и Ленском районах
Сычева Л. П. — д-р биол. наук, зав. лаб. генетического мониторинга (т. 499-246-48-13); Иванов С. И. — д-р мед. наук, проф., зам. дир. по научной работе (s ivanov@comcor.ru); Коваленко М. А. — канд. биол. наук, старш. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (499-246-09-^9); Журков В. С. — д-р мед. наук, проф., вед. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (т. 499-246-09-69); Беляева Н. Н. — д-р биол. наук, зав. лаб. цитогистологии (т. 499-245-03-14)
Для оценки цитогенетического и цитотоксического действия комплекса загрязнений г. Коряжмы провели полный кариологический анализ (цитогенетические показатели, показатели апоптоза и косвенные показатели пролиферации) эксфолиативных клеток буккального и назального эпителия двух групп детей старшего школьного возраста, проживающих на разном удалении от целлюлозно-бумажного комбината (ЦБК). Район проживания вблизи ЦБК можно считать неблагоприятным по воздействию генотоксических факторов, поскольку у детей в назальном эпителии повышен уровень цитогенетических нарушений в 1,6 раза и клеток с ядром атипичной формы в 1,65 раза на фоне снижения уровня апоптоза клеток в 1,57 раза. Выявили изменения кариологических показателей слизистой носа, но не слизистой щеки, что позвомет рекомендовать для оценки действия факторов окружающей среды, особенно влияния загрязнения атмосферного воздуха, проведение цитогенетических исследований на клетках не только буккального эпителия (который лучше изучен), но и назального.
Ключевые слова: здоровье детей, цитогенетический статус, целлюлозно-бумажный комбинат, цитотоксическое действие
L. P. Sycheva, S. I. Ivanov, М. A. Kovalenko, V. S. Zhurkov, N. N. Belyaeva, В. М. Antsiferov . - THE CYTOGENETIC STATUS OF CHILDREN LIVING IN THE VICINITY OF A PULP-AND-PAPER MILL
To evaluate the cytogenetic and cytotoxic effects of a set of pollutions in the town of Koryazhma, the investigators made a complete karyological analysis (cytogenetic, apoptotic, and indirect proliferation parameters) of buccal and nasal epithelial exfoliative cells in two groups of old school age children living at various distances from a pulp-and-paper mill (PPM). The residential area that is adjacent to the PPM can be considered to be poor in the influence of genotoxic factors since there were 1.6- and 1.65-fold increases in cytogenetic disorders and cells with an a typically shaped nucleus, respectively, with a 1.57-fold reduction in the level of cell apoptosis. Karyological changes were revealed in the nasal mucosa, rather than in the buccal mucosa, which permitted one to recommend for the evaluation of the influence of environmental factors, the impact of ambient air pollution in particular, and to conduct cytogenetic studies on the cells of not only the buccal epithelium (that has been better studied), but also those of the nasal epithelium.
Key words: healthy children, cytogenetic status, pulp-and-paper mill, cytotoxic effect
Целлюлозно-бумажный комбинат (ЦБК) является градообразующим предприятием в Коряжме Архангельской области и основным источником загрязнения атмосферного воздуха. Его вклад в выбросы стационарных источников города достигает 99% [3]. Общий объем выбросов ЦБК, загрязняющих атмосферный воздух веществ, составляет 17 982,9 т в год. Среди них отмечают канцерогенные соединения: шестивалентный хром, бензол и сажу (1-й класс опасности по классификации МА-ИР), бенз(а)пирен (2А класс), оксид никеля и этил-бензол (2В класс). В связи с загрязнением атмосферного воздуха города канцерогенными веществами, обладающими также мутагенным действием, можно предполагать нарушение состояния здоровья населения, в том числе обусловленное действием этих веществ на генетический аппарат человека. В ГУ НИИ экологии человека разработан подход, позволяющий анализировать эксфолиа-тивные клетки пограничных эпителиев человека (слизистых щеки и носа) и оценивать цитогенети-ческое и цитотоксическое действие факторов среды [6]. Эти ткани представляют особый интерес, поскольку являются первым барьером на пути воздействия факторов окружающей среды (воздух, вода, пища).
Целью исследования являлось изучение кариологических и цитогенетических показателей в
клетках слизистой щеки и носа подростков, проживающих в районе выбросов ЦБК.
Материалы и методы
Обследовали 50 подростков 16—17 лет, учащихся 10-го класса, которые были разделены на 2 группы в зависимости от района проживания. Все подростки на момент обследования были здоровы. В условные группы воздействия и сравнения включили по 25 детей из школ, расположенных на расстоянии 350 и 1760 м от санитар-но-защитной зоны ЦБК (1-я и 6-я школы). Отбор материала, приготовление и анализ препаратов проводили в соответствии с рекомендациями [5, 7, 9]. У каждого ребенка стерильным деревянным шпателем собирали клетки слизистой щеки и готовили мазки на предметном стекле; ватной палочкой собирали эксфолиативные клетки носа и в виде отпечатков наносили на предметные стекла. Препараты высушивали и готовили к микроскопическому исследованию. На зашифрованных препаратах анализировали по 1000 эксфолиативных клеток буккального и назального эпителия от каждого человека с помощью микроскопа Olympus СХ-31 при увеличении 10 х 100. Учитывали отдельно лежащие неповрежденные клетки практически без наложений друг на друга с хорошо окрашенной цитоплазмой и неповрежденной клеточной оболочкой.
В соответствии с классификацией и критериями, предложенными JI. П. Сычевой [10], учитывали следующие показатели: клетки с цитогенетическими наруше-
гнена и санитария 1/2010
I абл и ца 1
Цитогенетичсские и другие кариологимеские показатели (в "/„) буккального эпителия детей старшего школьного возраста (М ± т)
Показатель
Группа обследованных
сравнения
воздействия
Клетки с цитогенетическими повреждениями
Доля клеток с микроядрами 0,36 ± 0,14 0,16 ± 0,07
Доля клеток с протрузиями 2,12 ± 0,59 1,04 ±0,25
Доля клеток с цитогенетическими повреждениями (суммарно микроядра и протрузии) 2,48 ± 0,57 1,20 ±0,30
Доля клеток с ядром атипичной формы 0,88 ± 0,26 0,96 ±0,17
Двуядерные клетки (косвенно характеризуют пролиферацию)
Доля клеток со сдвоенными ядрами 3,28 ± 0,36 3,64 ±0,52
Доля клеток с двумя изолированными ядрами 4,64 ± 0.57 2,56 ± 0,45*
Сумма двуядерных клеток 7,88 ± 0,72 6,20 ±0,77
Кариологические показатели раннего апоптоза
Доля клеток с перинуклеарной вакуолью 26,12 ± 5,20 24,2 ± 4,93
Доля клеток с вакуолизацией ядра 164,68 ± 22,27 140,32 ± 20,33
Доля клеток с конденсацией хроматина 311,84 ± 31,40 279,88 ± 32,61
Доля клеток с началом кариолизиса 22,68 ± 4,48 21,96 ±4,25
Кариологические показатели позднего апоптоза
Доля клеток с кариорексисом 4,16 ± 1,19 4,08 ± 1,04
Доля клеток с кариопикнозом 28,48 ± 1,94 22,88 ± 2,31
Доля клеток с полным кариолизисом 7,48 ± 2,27 8,20 ±2,19
Доля клеток с завершением апоптоза 62,80 ± 7,57 57,12 ± 7,18
Доля всех клеток в апоптозе 565,44 ± 36,75 501,52 ± 42,27
Примечание. Здесь и в табл. 2 : * — достоверность различий с группой сравнения по /-критерию Стьюдента р < 0,05.
ниями (микроядрами, протрузиями, суммой цитогенети-ческих нарушений); клетки с атипичной формой ядра (предполагаемыми цитогенетическими нарушениями); клетки с повышенной плоидностью, являющиеся косвенными показателями пролиферации (двумя ядрами; сдвоенными ядрами, суммой всех клеток с более чем одним ядром); клетки с началом деструкции ядра (пери-нуклеарной вакуолью; вакуолизацией ядра; конденсацией хроматина; начальным кариолизисом; суммарным по-
казателем раннего апоптоза); клетки на позднем этапе деструкции (кариорексисом, кариопикнозом; полным кариолизисом; суммарным показателем позднего апоптоза); суммарным показателем всех клеток в апоптозе — полного апоптоза. Значимость указанных показателей обобщена в работе [6].
По результатам кариологического анализа сформировали базу данных. Статистический анализ проводили с помощью компьютерной программы Statistica for Win-
Таблица 2
Цитогенетичсские и другие кариологические показатели (в "/«,) назального эпителия детей старшего школьного возраста (М ± т)
Показатель
Группа обследованных
сравнения
воздействия
Клетки с цитогенетическими повреждениями
Доля клеток с микроядрами Доля клеток с протрузиями
Доля клеток с цитогенетическими повреждениями (суммарно микроядра и протрузии) Доля клеток с ядром атипичной формы
Двуядерные клетки (косвенно характеризуют пролиферацию)
0,68 ± 0,16
1,64 ± 0,32
2,32 ± 0,44
1,16 ± 0,26
Доля клеток со сдвоенными ядрами
Доля клеток с двумя изолированными ядрами
Сумма двуядерных клеток
Кариологические показатели раннего апоптоза
Доля клеток с перинуклеарной вакуолью Доля клеток с вакуолизацией ядра Доля клеток с началом кариолизиса Суммарная доля клеток в стадии раннего апоптоза
Кариологические показатели позднего апоптоза
Доля клеток с кариорексисом Доля клеток с кариопикнозом Доля клеток с полным кариолизисом Доля клеток с завершением апоптоза Доля всех клеток в апоптозе
1,00 1,64 2,64
± 0,24 ± 0,33 ± 0,41
0,52 ± 0,15
2,64 ± 0,26*
3,16 ± 0,32
1,92 ± 0,26*
0,96 ± 0,20
2,04 ± 0,33
3,00 ± 0,46
4,12 ± 0,63 5,08 ± 0,93
114,68 ± 8,57 64,04 ± 6,64*
62,20 ± 7,27 44,12 ± 4,90*
180,12 ± 12,72 113,24 ± 10,63*
6,96 ± 0,77 4,20 ± 0,98*
12,48 ± 1,31 10,56 ± 0,92
11,20 ± 2,29 6,72 ± 1,21
30,72 ± 3,53 21,48 ± 2,3*
211,24 ± 14,90 134,80 ±12,51*
Таблица 3
Корреляционная связь цитогенетических и других кариологиче-ских показателей с районом проживания детей (к = 50)
Коэффициент Кариолотические показатели корреляции Спирмена Значимость показателя (р)
Клетки с протрузиями 0,40 0,004
Сумма клеток с микроядрами и
протрузиями 0,31 0,021
Клетки с атипичной формой ядра 0,32 0,028
Вакуолизация ядра -0,58 0,000
Кариорексис -0,43 0,002
Начальная стадия деструкции ядра -0,53 0,000
Поздняя стадия деструкции ядра -0,31 0,030
Сумма клеток с деструкцией ядра -0,81 0,000
dows 6.0. Данные по группам сравнивали с помощью /-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р < 0,05. Взаимосвязь показателей оценивали с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение
Результаты кариологического анализа буккаль-ного эпителия представлены в табл. 1. Статистически достоверных различий между двумя группами по всем анализированным показателям в целом не выявили. Отметили изменение только одного показателя (снижение доли клеток с двумя ядрами), однако суммарная доля двуядерных клеток (с изолированными и сдвоенными ядрами) не различалась у детей в группах воздействия и контроля.
В назальном эпителии, в большей степени отражающем ингаляционное воздействие загрязнений атмосферного воздуха, отметили достоверные изменения двух групп кариологических показателей (табл. 2): цитогенетических и апоптоза. Средняя доля клеток с микроядрами была сходна у подростков обеих групп: 0,52%о в группе воздействия и 0,68%о в группе сравнения. В то же время средняя доля клеток с протрузиями в группе воздействия (2,64%о) была достоверно выше показателя в группе сравнения (1,64%о). Суммарный уровень клеток с цитогенетическими повреждениями составил 3,1бХо в группе воздействия и 2,32%о в группе сравнения. У детей в группе воздействия также отметили достоверное повышение средней доли клеток с ядром атипичной формы.
Не выявили межгрупповых различий по показателям, косвенно характеризующим пролиферацию
(доля клеток со сдвоенными ядрами, двумя изолированными ядрами и суммарная доля двуядерных клеток).
У детей, проживающих вблизи ЦБК, выявили статистически значимое снижение уровня показателей ранних и поздних стадий апоптоза назальных эпителиоцитов, в частности вакуолизации ядра, кариорексиса, начального кариолизиса и интегральных показателей апоптоза. Важно отметить, что снижение апоптоза в клеточной популяции, характеризующейся повышенным уровнем цитогенетических повреждений, является неблагоприятным процессом, приводящим к накоплению генетически поврежденных клеток и, по-видимому, способствующим развитию новообразований [10].
Вторым подходом, подтвердившим выявленные различия, было применение корреляционного анализа (табл. 3). Выявили статистически значимую прямую связь ряда цитогенетических показателей (доля клеток с протрузиями, микроядрами и протрузиями суммарно, атипичной формой ядра) с расстоянием от школы до ЦБК. Также отметили обратную корреляционную связь между долей клеток с вакуолизацией ядра, кариорексисом, начальной, поздней стадией деструкции ядра, суммой клеток с деструкцией ядра (апоптоза) и расстоянием от школы до ЦБК.
Третьим подходом было сравнение исследуемых показателей подростков Коряжмы и других регионов. В литературе преимущественно представлены данные по частоте микроядер буккального эпителия (табл. 4). В основном в обследованных группах детей она не превышала 0,66%о. У детей Коряжмы частота клеток с микроядрами приблизительно соответствовала этой величине. Частота клеток с протрузиями, которые наряду с микроядрами в последнее время рассматривают как цитогенетиче-ский показатель, составила 0,76—0,80%о и оказалась в 2 раза и более выше, чем определенная у 126 детей (0,37%о) [12] и у 105 взрослых жителей Москвы (0,29%о) [10].
Уровни цитогенетических нарушений в назальном эпителии подростков, по-видимому, определены нами впервые. В ряде цитогенетических исследований назального эпителия установлены фоновые значения частоты клеток с микроядрами у взрослых. Средняя доля назальных эпителиальных клеток с микроядрами в исследованиях разных авторов соответствовала 0,25%о [13]; 0,35%о [6]; 0,41%о [16]; 1,2%о [19]; 2%о [17]. В основном фоновые уров-
Частота клеток с микроядрами в буккальном эпителии детей (по данным литературы)
Таблица 4
Страна
Регион
Возраст детей, голы
Число обследованных
Частот клеток с микроядрами, %о
Литературный источник
Россия Коряжма Архангельской области 17
Россия Москва 5—7
Россия Москва 6—17
Россия Санкт-Петербург 5—6
Россия Свердловская область 4—6
Россия Воронеж 3—7
Вьетнам Бинь Зыонг 5—9
Турция Мерсин 5—12
Индия Калькутта 6—17
50 192 121 170 314 170 69 20 269
0,16-0,36
0,42 0,0-0,19 0,38-0,66 0,20-1,20 0,3-1,3 0,20 1,58 0,22
Данное исследование [12] (И 14] 18] [2] [И] [18] [151
[гиена и санитария 1/2010
ни находятся в пределах до 2%о. Определенная нами частота микроядер в назальном эпителии согласуется с результатами этих исследований. В то же время данные по уровню протрузий и сумме цито-генетических нарушений в 1,8 и 1,7 раза выше, чем определенные нами у взрослых жителей Москвы (1,51 и 1,86%о соответственно) [6]. По-видимому, наблюдаемые изменения свидетельствуют о более интенсивном генотоксическом и цитотоксическом действии комплекса факторов среды на подростков Коряжмы по сравнению с жителями Москвы. Это является неблагоприятной тенденцией в свете широкомасштабных исследований, проведенных в Скандинавских странах и Италии, показавших повышение риска развития новообразований с увеличением частоты мутаций у людей [14]. Действительно, анализ многолетней динамики заболеваемости раком легких мужского населения в промышленных городах Архангельской области показал, что в городах Коряжме, Новодвинске и Архангельске, где расположены ЦБК, повышен темп роста данной заболеваемости. Частота заболеваемости среди мужского населения за 1982—2001 гг. возросла в этих городах в 1,81; 1,76 и 1,45 раза Соответственно. В городах Северодвинске и Котласе, где экономика представлена другими видами промышленного производства, частота рака легких изменилась незначительно (в 1,25 и 1,03 раза) [3].
Выводы. 1. Район проживания вблизи ЦБК можно считать неблагоприятным по воздействию генотоксических факторов, поскольку у детей старшего школьного возраста повышен уровень цито-генетических нарушений и клеток с ядром атипичной формы в назальном эпителии на фоне снижения показателей апоптоза клеток.
2. Выявлены изменения кариологических показателей слизистой носа, но не слизистой шеки, что позволяет рекомендовать неинвазивный анализ назального эпителия наряду с буккальным (который лучше изучен) для оценки действия факторов окружающей среды, особенно для выявления ингаляционного действия загрязнений атмосферного воздуха.
Л итература
1. Алещенко А. В., Алчинова И. Б., Дмитриева О. С. и др. // Цитология. — 2006. — Т. 48, № 2. — С. 169— 172.
2. Буторина А. К., Калаев В. Н., Карпова С. С. // Вестник В ГУ. Сер. Химия, биология. - 2000. - С. 91-93.
3. Зайцева Т. Н., Лазарева Н. К., Бобун И. И. // В кн. 'Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха" / Под ред. акад. РАМН Ю. А. Рахманина. — М. — 2003. - С. 134-137.
4. Маймулов В. Г., Китаева Л. В., Верещагина Т. В. Ц Цитология. - 1998. - Т. 40, № 7. - С. 686-689.
5. Методические рекомендации "Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека" / Беляева H. Н., Сычева JI. П., Коваленко М. А. и др. // ГУНИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН. - М.; 2005. - 37 с.
6. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигие-нических исследованиях / Под ред. Ю. А. Рахманина, Л. П. Сычевой. — М„ Гениус, 2007,.
7. Руководство по изучению генетических эффектов в популяциях человека. ВОЗ. Женева; 1989. — 121 с.
8. Сайченко С. П., Никонов Б. И., Плотко Э. Г. и др. О канцерогенной и мутагенной опасности продуктов хлорирования высокоцветных питьевых вод. // Гиг. сан. - 1997. - № 6. - С. 62-64.
9. Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека / Сычева Л. П., Коваленко М. А., Рахманин Ю. А. и др. — Изобретение № 2292027, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20 января 2007.
10. Сычева Л. П. // Медицинская генетика. — 2007. — № 11.-С. 3-11.
11. Сычева Л. П., Можаева Т. Е., Умнова И. В. и др. // Вестн. РАМН. - 2008. - № 1. - С. 19-23.
12. Юрченко В. В., Журков В. С., Кривцова Е. К. и др. // Среда обитания и здоровье детского населения. Сб. науч. тр. Всероссийской науч.-практ. конф. Оренбург, 2003. - С. 27-29.
13. Bailarín С., Sarto F., GiacomelU L. et al. // Mutation Research. - 1992. - Vol. 280. - P. 1-7.
14. Hagmar L., Stromberg U., Bonassi S. et al. // Cancer Research. - 2004. - Vol. 64. - P. 2258-2263.
15. Lahiri T., Roy S., Bawsu C. et al. // Indian J. Med. Res.
- 2000. - Vol. 112. - P. 21-26.
16. Suruda A., Schulte P., Boeniger M. et al. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. — 1993. - Vol. 2, N 5. — P. 453-460.
17. Titenko-Holland N.. Levine A. J., Smith M. T. et al. Mutation Research, Dec 20. — 1996. - Vol. 371, N 3-4.
- P. 237-248.
18. Una! M., Celik A., Ates N. A. et al. // Int J Pediatr Otorhinolarvngol. - 2005. - Vol. 69, N11. -P. 1483-1488.
19. Ying C. J., Yan W. S., Zhao M. Y. et al. // Biomed Environ Sei. - 1997. - Vol. 10. - P. 451-455.
Поступила 05.06 08
