CC BY
45
БІОЛОГІЯ
© Р. В. Козовий, Р. І. Багриновський
УДК 575. 113+616. 12
Р. В. Козовий, Р. І. Багриновський
ЦИТОГЕНЕТИЧНІ ПОКАЗНИКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ГЕНОМУ НЕЙТРОФІЛЬНИХ ГРАНУЛОЦИТІВ ПЕРИФЕРІЙНОЇ КРОВІ У ДОВГОЖИТЕЛІВ ІВАНО-ФРАНКІВСЬКОЇ ОБЛАСТІ
ДВНЗУ «Івано-Франківський національний медичний університет» (м. Івано-Франківськ)
Дана робота є фрагментом НДР «Цитогенетичні механізми формування здоров’я населення та розробка заходів для його покращення», державний реєстраційний номер 01/311000768.
Вступ. Актуальним в умовах сучасного антропогенного навантаження стає вивчення особливостей функціонування активності геному. Краще розуміння фундаментальних механізмів старіння і факторів довголіття має першочергову значущість для реалізації повного потенціалу здорового старіння [1]. Особливої уваги набувають роботи з вивчення епігенетичних механізмів регуляції функціонування геному. Епігенетика - наука, що вивчає спадкові зміни в фенотипі або в експресії генів, що викликані іншими механізмами, ніж зміни послідовності нуклеотидів ДНК [6]. Такі зміни можуть залишатися видимими протягом декількох клітинних поколінь чи навіть кількох поколінь живих організмів. Кращим прикладом епігенетиних змін для евкаріот є процес диференціації клітин. Протягом морфогенезу тотипотентні стовбурові клітини стають плю-рипотентними клітинними лініями ембріону, які в свою чергу диференціюються в різні види клітин, які присутні в живому організмі. Це здійснюється шляхом активації одних генів та інгібування інших. Епігенетичні механізми залучені до контролю багатьох біологічних процесів, зокрема до специфічної експресії генів, регуляції структури хроматину, реплікації ДНК, клітинного диференціювання, геномного імпринтингу, інактивації Х-хромосоми [6, 8, 12]. Одним із зручних об’єктів для скри-нінгових досліджень епігенетичних механізмів регуляції функціонування геному є ней-трофільні гранулоцити периферійної крові (НГПК). Більшість досліджень експресії генів у нейтрофільних гранулоцитах ґрунтується на їх стимуляції цитокінами і сфокусовано на обмеженому числі специфічних генів, які контролюють синтез відомих молекул. Водночас, глобальна оцінка НГПК при цьому часто випадає з поля зору дослідників. Для об’єктивної оцінки функціональної активності генів НГПК на різних етапах реалізації
спадкової інформації є встановлення особливостей функціонального стану геному (ФСГ) цих клітин [2]. У довгожителів подібні дослідження не проводились.
Мета роботи - встановлення особливостей функціонального стану геному нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові у довгожителів, що проживають в різних екологічних зонах Івано-Франківської області.
Об’єкт і методи дослідження. Об’єктом дослідження слугували нейтрофільні гранулоци периферійної крові довгожителів (основна група) та людей зрілого віку (група порівняння). Розподіл населення на екологічні зони проводився на основі результатів попередніх наших досліджень, екологічних паспортів області та звітів екологічних досліджень [5,7]. Серед довгожителів і осіб групи порівняння переважали люди з населених пунктів з помірним екологічним навантаженням (табл. 1).
Групу порівняння склали особи віком від 36 до 60 років у родоводах, яких не було довгожителів.
Забір матеріалу, виготовлення препаратів з наступним забарвленням за Фьольгеном у модифікації, яка дозволяє провести диференційне фарбування ДНК ядра і РНК ядерець - основних компонентів клітини здійснювали за відповідною методикою [3,10].
Дослідження виготовлених препаратів проводили на оптико-електронному комплексі „Метаскан - 2”.
Індекси ФСГ вивчали у 100 ядровмісних епітелі-оцитах кожного обстежуваного. Індекс хроматизації
Таблиця 1
Розподіл досліджуваного населення, що проживає в різних екологічних зонах Прикарпаття
Досліджувані групи Екологічні зони
Зона екологічного благополуччя, п=137 Зона помірного екологічного навантаження, п=196 Зона з несприятливими екологічними умовами, п=149
Основна, п=264 75 107 82
Порівняльна, п=218 62 89 67
(IX) встановлювали за відношенням кількості клітин, в ядрах яких переважав евхроматин до кількості клітин, з перевагою гетерохроматину. Статевий хроматин (СХ), ядерцевий індекс (ЯІ), індекс морфологічно змінених ядер (МЗЯ) - за відсотком відповідних клітин.
Результати досліджень та їх обговорення.
Вивчення цитологічних характеристик НГПК є інформативним та доступним методом для оцінки загального стану організму. Саме зміни ФСГ можуть вказувати на функціональні порушення генотипу, зумовлені екзо- та ендогенними чинниками, стан адаптивних можливостей організму. Найважливішим маркером експресибельності геному, що опосередковано корелює з кількістю дерепресованої ДНК є індекс конденсації хроматину [4]. За допомогою сучасного молекулярно-генетичного аналізу в гетерохроматині виявлено еволюційно консервативні ансамблі білків, які сприяють гетерохро-матизації, що супроводжується пригніченням експресії генів [13]. У довгожителів всіх екологічних зон встановлено перевагу ядер з деконденсованим хроматином порівняно з таким у групі людей зрілого віку (табл. 2). Загальний показник IX у основній групі становив (0,98±0,41) та (1,08±0,10) ум. од. в групі порівняння. Варто зазначити, що деконденса-ція хроматину була істотніша у чоловіків, ніж у жінок з основної групи. Показник конденсації хроматину був меншим у довгожителів, які проживають в умовах екологічного благополуччя, порівнянно з такими в інших зонах (р<0,01). Така ж тенденція спостерігалась і в контролі. Отримані дані можуть вказувати на негативний екзогенний вплив мутагенів на активість спадкового аппарату. Це дозволяє припустити зниження активності транскрипції - початкового етапу
реалізації спадкової інформації залежно від статі та умов проживання.
Особливої уваги потребує аналіз показника регуляції ФСГ - індексу гетеропікнотичної Х-хромосоми (СХ). У жінок одна з двох Х-хромосом неактивна, її виявляють у 40-60 % ядер. Таке явище називають «компенсація дози гена». Порушення епігенетичної регуляції генів може бути спричинине змінами конденсації Х-хромосоми.
Досвід ідентифікації гетеропікнотичної Х-хромо-соми дозволяє стверджувати, що цей індекс у сучасного покоління жінок не перевищує 35 % [9]. Отже оцінювання СХ повинно проводитись з урахуванням статевих особливостей. Так, середнє значення СХ у жінок із основної групи було (26,86±0,48) % та (28. 80±0,57) % у жінок із групи порівняння. Встановлено достовірну відмінність показника СХ між жінками з основної та порівняльної груп, які проживають у зоні помірного екологічного навантаження (табл. 2, рис. 1а).
Спостерігалась залежність даного показника від зони проживання. Таку тенденцію змін СХ у досліджуваній вибірці можна інтерпретувати як свідчення порушення регуляції експресії генів у людей з екологічно забруднених територій. Хоча цитологічні показники ядерцевого апарату змінені не так суттєво, метаболізм клітини може бути порушений через недостатність регуляторної функції Х-хромосоми. У постнатальному періоді гетеропікнотичну Х-хромосому можна визначити в інтерфазних ядрах соматичних клітин переважно осіб жіночої статі, однак показник СХ. ідентифіковано і в чоловіків при різних патологічних станах [8]. Нормальним є те, що даний показник у всіх обстежених жінок перевищував такий у чоловіків. Однак між досліджуваними
Таблиця 2
Цитологічні показники нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові у довгожителів (А) та групи порівняння (В) з різних досліджуваних районів Івано-Франківської' області (М±т)
Екологічна зона Стать Індекс хроматизації, ум. од Статевий хроматин, % Ядерцевий індекс, % Морфологічно змінені ядра, %
А В А В А В А В
Зона екологічного благополуччя ж 0,83±0,54 0,88±0,04 27,58±0,38 28,13±0,53 3,72±0,38 3,86±0,29 2,98±0,51 3,21±0,14
ч 0,95±0,37є 0,91±0,01 4,65±0,23 5,15±0,33 4,98±0,47 4,04±0,52 4,08±0,27 4,41±0,22
Зона помірного екологічного навантаження ж 0,95±0,33 1,07±0,05 23,71±0,74є 28,33±0,41 4,58±0,72 5,14±0,39 4,28±0,28* 4,71±0,31*
ч 1,05±0,29 1,14±0,06 3,42±0,12* 3,56±0,51* 4,29±0,33є 6,40±0,67 4,89±0,44*є 6,29±0,42*
Зона з несприятливими екологічними умовами ж 1,02±0,52 1,20±0,04 29,28±0,32* 29,93±0,78* 5,14±0,28* 5,23±0,04* 4,75±0,32* 5,01±0,31*
ч 1,10±0,41 1,26±0,38* 5,84±0,14* 5,47±0,22 5,32±0,55 5,35±0,14 5,14±0,54* 5,85±0,23*
Примітка; * вірогідність відмінностей з показниками зони екологічного благополуччя р<0,001; е вірогідність відмінностей довгожителів з группою порівняння. р<0,001.
Рис. 1. Нейтрофільні гранулоцити периферійної крові: 1 -гетеропікнотична Х-хромосома у препараті крові довгожительки М., що проживає у зоні несприятливих екологічних умов (а) та 2 - морфологічно змінене ядро у препараті крові чоловіка К. із групи порівняння, що проживає у зоні помірного екологічного навантаження (б).
Забарвлення за Фьольгеном. Зб. : об. 90 ок. 10.
групами у осіб чоловічої статі достовірних відмінностей не діагностовано.
На наступному етапі роботи наша увага була зосереджена на механізмах, які забезпечують трансляцію - синтез білкової молекули. Показником цього процесу є активність ядерцевого апарату. В ядерцях здійснюється транскрипція генів, які кодують рибосом ні білки [6]. Кількість ядерець, їхні розміри і структура відображають метаболічну активність клітин або рівень диференціювання і, відповідно, транскрипцію генів рибосомної РНК. Оскільки структурно-функціональні зміни ядерець є важливим компонентом реакції клітин на стрес і зумовлюють їх адаптацію до зовнішніх впливів, ЯІ може бути об’єктивним діагностичним маркером активності трансляційного апарату. Встановлено, що ЯІ був найбільшим у чоловіків порівняльної групи із зон з помірним екологічним навантаження (табл. 2). Слід відмітити, що у жінок обох досліджуваних груп, що проживають у зоні з несприятливими екологічними умовами даний показник достовірно був більшим порівняно із таким у осіб із зони екологічного благополуччя (р<0,05). У обстежених довгожителів ЯІ суттєво не відрізнявся від такого у групі порівняння, однак він був незначно меншим у основній групі, ніж у осіб, котрі проживали в таких же екологічних умовах та не мали спадкової схильності до довголіття.
Не викликає сумніву той факт, що метаболізм клітини залежить від морфо-функціональних особливостей ядра. Структура і забарвлення хроматину в МЗЯ приблизно відповідала хроматину ядер в нормі або була гомогеннішою. В цитоплазмі деяких клітин з’являлися вакуолі, які мали округлу форму. Для диференціації вакуолізації ядер від стану конденсації хроматину, при якій також утворюються порожнини, що розділяють грудки і тяжі хроматину, враховано рекомендації про те, що ядро при гетерохромати-зації не набухає, а навпаки, зморщується і хроматин стає темнішим і щільнішим [11].
При порівнянні МЗЯ досліджуваних людей із зони з несприятливими екологічними умовами встановлено його достовірне збільшення числа МЗЯ порівняно з таким у осіб, що проживають умовах екологічного благополуччя (р<0,001).
Кількість МЗЯ була найбільшою у чоловіків групи порівняння, які проживають у зоні помірного екологічного навантаження (рис. 1б), що було взаємопов’язано зі збільшенням у даній вибірці ЯІ (г=0,86, р<0,01). Отриманий результат потребує глибшого вивчення. Кількість МЗЯ залежала також від статі. Так, їхня кількість була незначно більшою у чоловіків, що може пояснюватись особливостями способу життя.
Аналіз чотирьох індексів ФСГ вказує на те, що причиною його пригнічення у людей, які проживають на територіях з високим техногенним навантаженням, першочергово є незбалансованість змін окремих механізмів, які беруть участь у реалізації спадкової інформації на клітинному рівні.
Функціонування геному в обстежених осіб відбувається за принципом саморегуляції, що стверджено на підставі різноспрямованих відхилень окремих індексів нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові.
Висновки.
1. На основі проведенного аналізу показників ФСГ у осіб, що проживали в різних екологічних умовах нами встановлено перевагу ядер з деконденсо-ваним хроматином у довгожителів всіх екологічних зонах порівняно із показниками групи порівняння.
2. Доведено відмінність показника СХ між жінками з основної та порівняльної груп, які проживають у зоні помірного екологічного навантаження, а також залежність даного показника від зони проживання.
3. Виявлено, що ЯІ у основній групі суттєво не відрізнявся від такого у групі порівняння, однак він мав тенденцію до зниження у довгожителів, а ніж у осіб, котрі проживали в таких же екологічних умовах та не мали спадкової схильності до довголіття. Він
був найбільшим у чоловіків порівняльної групи із зон з помірним екологічним навантаження
4. Визначено збільшення частоти патологічних ядер у довгожителів залежно від екологічних умов проживання.
Перспективи подальших досліджень полягають у комплексному вивченні особливостей епігенетичних механізмів регуляції реалізації спадкового потенціалу в інших соманичних клітинах на ультраструктурному рівні.
Література
1. Анисимов В. Н. Moлeкyляpныe и физиологические механизмы старения. - Cl^. : Наука, 200З. - 468 с.
2. Встановлення динаміки мутагенного навантаження на організм на основі обліку змін показників функціонального стану геному дітей різних регіонів !вано-Франк!всько'|' області I Л. Є. Ковальчук, Р. В. Козовий, З. Р. Кочерга, Н. В. Чернюк II Вісник морфології. - 200З. - Т. 2, № 2. - C. 4З0-4З2.
3. Ганина К. П. Цитогенетическая диагностика в онкоморфологии I Ганина К. П. - К. - Наукова думка. - 1980. - 176 с.
4. Гвоздев В. А. Гетерохроматин и его функциональные характеристики I В. А. Гвоздев, Л. А. Усакин, Г. Л. Коган II Meди-цинская генетика. - 200З. - № 7. - C. 290 - 296.
5. Екологічний паспорт ^ано-Фран^сь^' області (http: IIwww. menr. gov. uaIcontentIarticleI5982).
6. Кочерга З. Р. Діагностика затримки внутрішньоутробного розвитку плода за показниками фукціонального стану нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові новонароджених I З. Р. Кочерга, Л. Є. Ковальчук II Галицький лікарський вісник. - 2011. - Т. 18, № 2. - C. 50-5З.
7. Mіністepствo екології та природних ресурсів України. !нформаційно аналітичний центр Державної системи моніторингу довкілля. Розділ огляди, бюлетні і звіти стану довкілля http: IIwww. ecobank. org. uaIGovSystemIEnvironmentStateI ReviewsIPagesIdefault. aspx.
8. Нейко Є. M. Епігенетичні механізми регуляції активності генів і мультифакторні хвороби I Є. M. Нейко, Л. Є. Ковальчук, Н. В. Чернюк II Галицький лікарський вісник. - 2007. - Т. 14. - № 1. - C. 11-14.
9. Палійчук I. В. Цитогенетичні показники функціонального стану геному нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові у хворих на протезні стоматити I I. В. Палійчук, Л. Є. Ковальчук, О. C. Ястребова II Вісник стоматології. - 2010. - № З. -C. 55-60.
10. Рац. пропозиція З0!2З19 !вано-Франківськ Виявлення ДНК в цитологічних препаратах I [Ковальчук Л. Є., Ковальчук Н. В., !лик В. В.]; заявник і патентовласник !вано-Франк. держ. мед. ун-т. - 1997.
11. вічева Л. П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кариоло-гических показателей при оценке цитогенетического статуса человека I Л. П. вічева II Meдицинскaя генетика. -2007. - Т. 6. - № 11 (65). - C. З-11
12. Толмачова Е. Н. Инактивация X-хромосомы и патология человека I Е. Н. Толмачова, А. А. Кашеварова, И. Н. Лебедев II Meдицинскaя генетика. - 2009. - № 7. - C. 9-15.
13. Newburger P. E. Global analysis of neutrofil gene expression I P. E. Newburger, Y V. Subrahmanyam, S. M. Weissman II Cur. Opin. Haematol. - 2000 - Vol. 1, № 7. -- Р. 16 - 20.
УДК 575. 113+616. 12
ЦИТОГЕНЕТИЧНІ ПОКАЗНИКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ГЕНОМУ НЕЙТРОФІЛЬНИХ ГРАНУЛОЦИТІВ ПЕРИФЕРІЙНОЇ КРОВІ У ДОВГОЖИТЕЛІВ ІВАНО-ФРАНКІВСЬКОЇ ОБЛАСТІ
Козовий Р. В., Багриновський Р. І.
Резюме. Проведено комплексний аналіз чотирьох показників інтерфазних ядер нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові (індексів хроматизації, ядерцевого, морфологічно змінених ядер та статевого хроматину) у 264 довгожителів (основна група) і 218 осіб зрілого віку (група порівняння) з трьох екологічних зон Прикарпаття. Встановлено залежність активності різних етапів експресії генів від інтенсивністі забруднення довкілля та статевих особливостей. Структурно-функціональні зміни спадкового апарату більше виражені в людей, що проживають в екологічно несприятливих умовах. Найістотніше порушення регуляції функціональної активності геному виявлено у чоловіків з групи порівняння. Збільшення морфологічно змінених ядер може слугувати індексом ступеня впливу факторів довкілля. Вищі показниками деструкції у осіб із зони з високим техногенним навантаженням, порівняно з такими у осіб з інших екологічних зон може засвідчувати нестабільность спадкового апарату спричинену негативним екзогенним впливом.
Ключові слова: функціональний стан геному, нейтрофільні гранулоцити крові, довгожителі.
УДК 575. 113+616. 12
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГЕНОМА НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДОЛГОЖИТЕЛЕЙ ИВАНО-ФРАНКОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Козовой Р. В., Багриновский Р. И.
Резюме. Проведен комплексный анализ четырех показателей интерфазных ядер нейтрофилов периферической крови (индексов хроматизации, ядрышкового, морфологически измененных ядер и полового хроматина) в 264 долгожителей (основная группа) и 218 человек зрелого возраста (группа сравнения) из трех экологических зон Прикарпатья. Установлена зависимость активности различных этапов экспрессии генов от интенсивности загрязнения окружающей среды и половых особенностей. Структурно-функциональные изменения наследственного аппарата более выражены у людей, проживающих в экологически
неблагоприятных условиях. Cyщeствeнный нарушения регуляции функциональной активности генома обнаружено у мужчин из группы сравнения. Увеличение морфологически измененных ядер может служить индексом степени влияния факторов окружающей среды. Высшие показатели деструкции у лиц из зоны с высоким техногенным нагрузкам, по сравнению с таковыми у лиц из других экологических зон может свидетельствовать об нестабильности наследственного аппарата вызванной негативным экзогенным воздействием.
Ключевые слова: функциональное состояние генома, нейтрофильные гранулоциты крови,долгожители.
UDC 575. 113+616. 12
Cytogenetic Index of Functional Condition of the Genome of Peripheral Blood Neutrophils in Centenarians of Ivano-Frankivsk Region
Kozoviy R. V., Bahrynovskyy R. I.
Summary. Actual in today’s anthropogenic load is studying the functioning of the activity of the genome. A better understanding of the fundamental mechanisms of aging and longevity factors is crucial for the realization of the importance of the full potential of healthy aging. Particular attention acquire work’s on study of the epigenetic mechanisms regulating the functioning of the genome. Epigenetics - the science that studies the heritable changes in phenotype or gene expression caused by mechanisms other than changes in the nucleotide sequence of DNA. One of the convenient facilities for screening investigation of epigenetic regulating mechanisms of the genome functioning are neutrophilic granulocytes of peripheral blood.
A comprehensive analysis of the four indicators interphase nuclei of peripheral blood neutrophils (indexes of chromatization, nucleolar, morphologically altered nuclei and sex chromatin) in 264 centenarians (study group) and 218 persons of mature age (group) of three ecological zones Prykarpattya. Comparison group consisted of persons aged 36 to 60 years in ancestry that were not centenarian. Sampling of material, manufacturing of drugs, followed by Feulgen staining in the modification, which allows for the differential staining of DNA and RNA core nucleoli -basic components of cells was performed using appropriate methods.
Were dependence of activity of different stages of gene expression from the intensity of pollution and reproductive features. The change in functional condition of the genome may indicate functional impairment genotype due to exogenous and endogenous factors, the state of adaptation of the organism. Structural and functional changes in the hereditary apparatus more pronounced in people living in ecologically unfavorable conditions.
Proved the difference between the index sex chromatin in women with primary and comparative groups living in temperate environmental burdens and dependency of this index of area of residence.
Found that nucleolar index in the study group did not differ significantly from that of the comparison group, but he had a tendency to decrease in the long, rather than in those who lived in the same environmental conditions and had no hereditary predisposition to longevity. He was the greatest men in comparable groups from areas with moderate environmental burden
Most significant dysregulation of the functional activity of the genome found in men with comparison group. Increase of morphologically altered nuclei can serve as an index of the degree of influence of environmental factors. Higher rates of degradation in those areas with high technological activity, compared to those of people from other ecological zones may indicate instability caused by hereditary apparatus negative externalities. Analysis of the four indexes functional condition of the genome indicates that the cause of his depression in people living in areas with high technological load imbalance is primarily in selected mechanisms involved in the implementation of genetic information at the cellular level. Functional genome tested were based on the principle of self-regulation, which confirmed the difference of variances based on some indices of peripheral blood neutrophils.
Key words: functional state of the genome, blood neutrophils, centenarians.
Рецензент - проф. Дубінін С. I.
Стаття надійшла 11. 04. 2013 р.
