CC BY
43
kaznmu.kz • КазНМУ • №1-201 6*
ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА В АРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ РЕСПУБЛИКИ
КАЗАХСТАН В ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ СЕЗОН 2015 Г.
Т.И. ГЛЕБОВА1, Н.Г. КЛИВЛЕЕВА1, М.Г. ШАМЕНОВА1, Н.Т. САКТАГАНОВ1, Г.В. ЛУКМАНОВА1, М.К. КАЛКОЖАЕВА1, А.Ж. МУРЗАГАЛИЕВА2 , Г. ДОСАНКЫЗЫ3
1РГП на ПХВ «Институт микробиологии и вирусологии» КН
МОН РК, Казахстан, г. Алматы 2Государственное коммунальное предприятие «Областная клиническая инфекционная больница» на праве хозяйственного ведения государственного учреждения «Управление здравоохранения Актюбинской области» 3 Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр экспертизы» Комитета по защите прав потребителей МНБ РК по Кызылординской области
УДК 578:23 578.1/.2 578.08
В январе - марте 2015 г. в лечебных учреждениях Актюбинской и Кызылординской областей от больных людей с диагнозами ОРВИ, ринофарингит и аденовирусная инфекция собрано 293 носоглоточных смыва и 48 сывороток крови.
В полимеразной цепной реакции генетический материал вируса гриппа А был обнаружен в 12,6% случаев, вируса гриппа В - в 1,0%. При субтипировании РНК вируса гриппа A/H3N2 идентифицирована в 9,2% проб, A/H1N1 - в 2,7%, в 0,7% проб РНК одновременно выявлена к обоим подтипам вирусов гриппа А(Н1М1+Н3Ы2). Результаты, полученные при скрининге носоглоточных смывов в ПЦР, также как и данные серологических исследований в реакции торможения гемагглютинации и иммунноферментном анализе, представленные в статье, свидетельствуют о социркуляции на территории Аральского региона вирусов гриппа A/H3N2, А/H1N1 и В.
В работе приводятся сведения по изоляции вирусов гриппа А/Н1Ы1 от больных людей на культуре клеток МОСК и развивающихся курин ых эмбрионах.
Ключевые слова: вирус гриппа, циркуляция, изолят, гемагглютинин, нейраминидаза
ВВЕДЕНИЕ.
Острые респираторные вирусные инфекции и грипп являются самыми массовыми инфекциями человечества и представляют серьезную проблему для общественного здравоохранения. По социальной значимости, огромному ущербу наносимому здоровью населения и экономике, грипп находится на первом месте среди всех заболеваний человека. На долю гриппа и ОРЗ приходится 10 — 30% временной нетрудоспособности населения. Обычно грипп и ОРЗ составляют до 40% всех заболеваний взрослых, более 80% всей инфекционной патологии, более 60% заболеваний среди детей. Смертность от гриппа в разных странах колеблется от 2 до 80 случаев на 100 000 населения [1, 2]. Заболевания гриппом регистрируются постоянно в течение всего года в крупных городах и промышленных регионах, спорадическая заболеваемость не прекращается даже в летние месяцы, тем самым обеспечивая непрерывность эпидемического процесса гриппозной инфекции [3]. Спектр эпидемических штаммов вирусов гриппа и их характеристика варьируют в зависимости от сезонов года. В последнее время в мире, в том числе и в различных регионах Казахстана наблюдается одновременная циркуляция вирусов гриппа подтипов А(НШ1), А(НЗ^) и рода В [4, 5, 6]. Кроме того, необычайная сложность эпидемической ситуации связана с появлением реассортантных вирусов [7, 8].
Целью настоящего исследования являлось изучение особенностей циркуляции вирусов гриппа в Аральском регионе Казахстана в эпидемический сезон 2015 г. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Сбор клинических образцов (назофарингеальные смывы, сыворотки крови) от больных осуществляли в лечебных учреждениях в эпидемический период 2015 г. Пробы до вирусологических исследований хранили в жидком азоте. Первичный скрининг носоглоточных смывов в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (РТ-ПЦР) осуществляли на амплификаторе RotorGen 6000 (CorbettResearch, Австралия) с применением наборов "РИБО - преп", "АмплиСенс® Influenzavirus A/B-FL" и "АмплиСенс ®
Influenzavirus A-тип -FL" (производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, РФ) [9]. Изоляцию вирусов проводили в двух системах традиционными методами: на культуре клеток МДСК с добавлением ТРСК - трипсина (2 мкг/мл) и 9-11-дневных куриных эмбрионах (КЭ). Для индикации вируса в реакции гемагглютинации (РГА) использовали 0,75% взвесь эритроцитов петуха и человека 0(1) группы крови. Инфекционную активность изолятов определяли по общепринятому методу [10] и их титр выражали в lg ЭИД50/0.2мл и ^ТЦИД50/0 .2мл.
Идентификацию изолятов проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции ингибиции нейраминидазной активности (РИНА) с наборами поликлональных диагностических сывороток согласно рекомендации ВОЗ [11, 12].
Уровень специфических антител к вирусам гриппа в сыворотках крови определяли в РТГА и иммуноферментном анализе (ИФА). РТГА проводили согласно рекомендации ВОЗ с использованием как эталонных вирусов: A/California/04/09 (H1N1), A/New Jersey/8/76(H1N1), A/Wisconsin/67/05 (H3N2), B/Shandong/07/07, так и коммерческих диагностикумов производства ФГБУ НИИ гриппа (г.Санкт-Петербург). Для ИФА использовали тест-системы производства ООО «ППДП» (г. Санкт-Петербург) к вирусам гриппа подтипов A(H1N1), A(H3N2) и типа В. Результаты и обсуждение.
Сбор материалов проводили в эпидемический сезон (январь - март 2015 г.) в поликлиниках и инфекционных больницах Актюбинской и Кызылординской областей. Всего от больных людей было собрано 293 смыва из верхних дыхательных путей и 48 сывороток крови. Процентное соотношение собранных образцов в зависимости от диагноза составило: «ОРВИ» - 97,27% (285 образцов) от общего числа смывов, «ринофарингит» - 2,04% (шесть проб) и «аденовирусная инфекция» - 0,68% (2 образца). Наибольшее количество носоглоточных смывов получено от детей до 14 лет (67,1%).
Результаты первичного скрининга носоглоточных смывов в РТ-ПЦР представлены на рисунке 1.
ВЕСТНИК-
N21-2016 • КазНМУ • кагпти.кг
0,7%
2,7%
9,2%
'тип В ил/Н1 иА/НЗ 1 А(Н1+ НЗ)
Рисунок 1 - Результаты ПЦР - скрининга носоглоточных смывов на наличие РНК вируса гриппа
Как видно из рисунка 1, при исследовании 293 проб генетический материал вируса гриппа был обнаружен в 13,6 % случаев от общего числа проб (40 образцов). РНК вируса гриппа А выявлена в 12,6% (37 проб), вируса гриппа В - в 1,0% (три образца). Субтипирование позволило обнаружить РНК вируса гриппа А/НШ1 в 2,7% случаев (восемь смывов), в 9,2% (27 смывов) обнаружена РНК вируса А/Н3^, в двух пробах (0,7%) выявлена РНК одновременно к обоим подтипам вирусов гриппа А(НШ1+Н3Ы2).
Таким образом, первичный смывов в РТ-ПЦР показал,
скрининг носоглоточных что в Актюбинской и Кызылординской областях циркулируют вирусы гриппа подтипов А/НШ1, А/Н3^ и типа В.
В результате первичного заражения КЭ и культуры клеток МБСК 293 пробами и проведения последующих пассажей выделено восемь гемагглютинирующих агентов (ГАА) (таблица 1).
Таблица 1 - Гемагглютинирующая и инфекционная активность казахстанских изолятов вирусов гриппа, выделенных на куриных
Изолят Титр РГА при культивировании на Инфекционная активность изолятов на
куриных эмбрионах культуре клеток MDCK куриных эмбрионах, ^ ЭИД50/0,2мл культуре клеток MDCK, ^ТЦИД50/0.2мл
02/15 1:512 1:4 3,77 2,33
03/15 1:512 1:4 4,5 3,77
06/15 1:512 1:8 8,77 6,33
18/15 1:128 1:4 7,98 4,33
20/15 1:128 1:4 6,00 3,33
58/15 1:8 1:2 2,33 1,23
83/15 1:16 1:4 3,77 2,33
121/15 1:8 1:4 3,33 3,77
Как видно из таблицы 1, наименьшей инфекционной активностью обладал изолят 58/15 (2,33 ^ ЭИД5о/о,2мл и 1,23 ^ТЦИД5о/о.2мл), наибольшей - 06/15 (8,77 ^ЭИД5о/о,2мл и 6,33 ^ТЦИД5о/о.2мл). Для дальнейшей работы отобрано пять актюбинских изолятов (2/15, 3/15, 6/15, 18/15 и 20/15) с более высокими гемагглютинирующими титрами. При определении подтипа гемагглютинина в РТГА установлено, что гемагглютинирующая активность всех
изолятов от % до 1/32 гомологичных титров подавлялась иммунными сыворотками к вирусам А/США/1976/31 (Н1Ы1), А/Соломоновы 0строва/03/06 и
А/Калифорния/04/09 (H1N1)pdm. Это позволило отнести ГАА к вирусу гриппа А с подтипом гемагглютинина Н1 (таблица 2).
Таблица 2 - Идентификация подтипа гемагглютинина актюбинских изолятов вирусов гриппа 2015 г. выделения в РТГА
Иммунная сыворотка к вирусам Гомологичный титр сывороток к вирусам -эталонам Титр антигемагглютининов к изолятам
02/15 03/15 06/15 18/15 20/15
А/США/1976/31 (НШ1) 1280 160 80 80 80 320
А/Соломоновы 0строва/03/06 640 160 40 20 20 160
А/Калифорния/04/09(НШ1^т 640 160 40 20 20 160
А/Висконсин/67/05 (^N2) 640 <20 <20 <20 <20 <20
А/Панама/2009/99 (^N2) 640 <20 <20 <20 <20 <20
В/Флорида/09/06 640 <20 <20 <20 <20 <20
Примечание - приведены обратные величины титров специфических антигемагглютининов
Результаты идентификации поверхностного гликопротеида
подтипа
второго
изолятов вируса гриппа А в РИНА представлены в таблице 3.
Изолят Титр антител к подтипам нейраминидазы
N1 N2
02/15 100 <20
03/15 100 <20
06/15 100 <20
18/15 100 <20
20/15 100 <20
Примечание - приведены обратные величины титров антинейраминидазных антител
Из таблицы 3 видно, что нейраминидазная активность всех изолятов в титрах 1:100 подавлялась иммунной поликлональной сывороткой к НШ1.
Таким образом, по результатам РТГА и РИНА изоляты А/Актобе/02/15, А/Актобе/03/15, А/Актобе/06/15,
А/Актобе/18/15 и А/Актобе/20/15 отнесены к вирусу гриппа А с антигенной формулой НШ1.
Для изучения сероэпидемиологической ситуации по гриппу в Аральском регионе в 2015г. исследовано 48 сывороток крови в РТГА и ИФА. Результаты РТГА приведены на рисунке 2.
Рисунок 2 - Обнаружение специфических антител к вирусам гриппа в сыворотках крови в РТГА
Как видно из рисунка 2, в 60,4% случаев в сыворотках крови людей обнаружены антигемагглютинины к вирусу гриппа А/Н3^. Титры антител составили 1:40 - 1:640. Серопозитивными по отношению к вирусу гриппа А/НШ1 оказались 10,5% сывороток с титрами антител 1:80 - 1:320. В 6,3% случаев сыворотки были положительными по отношению к вирусу гриппа В, в 2,1% сывороток выявлены
антигемагглютинины одновременно к вирусам гриппа А/Н3^ и В, в 4,2% - к А/НШ1 и А/Н3^. Серологическое исследование 48 сыворотках крови, проведенное в ИФА показало наличие антител к вирусу гриппа А/Н3^ в 69,6% случаев, к А/НШ1 - в 12,6% и к вирусу гриппа В - в 4,2% сывороток (рисунок 3).
о ч о а
Ё
<и Я
О &
69,6
«
о я
00 03
а
ю о
100
50
Л/НШ1
Л/Н3Ш
В
Рисунок 3 - Выявление антител к вирусам гриппа в сыворотках крови в ИФА
0
• Nq1 -201 6 • КазНМУ • kaznmu.kz
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
В результате первичного скрининга в РТ-ПЦР носоглоточных смывов и серологических исследований сывороток крови, собранных в эпидемический сезон 2015 г. от больных людей в Актюбинской и Кызылординской
областях РК, выявлена социркуляция вирусов гриппа А/Н3Ы2, А/H1N1 и В. Циркуляция вируса гриппа с антигенной формулой А/НШ1 подтверждена выделением из клинических образцов пяти изолятов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Салтыкова Т.С. Отсроченная смертность при гриппе среди лиц пожилого возраста// ЖМЭИ. - 2010. - №4. - С. 8-13.
2 Социальное значение эпидемий гриппа [Электронный ресурс]. Дата обновления: 16.11.15. — URL: http://www.vitaminov.net/rus-gripp-epydem-0-20371.html (дата обращения: 16.11.15).
3 Карпухин Г.И. Грипп. - Л.: Медицина. - 1986. - С. 348.
4 Klivleyeva N.G., Glebova T.I., Lukmanova G.V., Bayseit S.B., Taubaeva Sh.Zh., Kalkozhaeva M.K. Influenza virus circulation among the population of Kazakhstan in 2012-2014 / / 17th International Conference on Virology and Infection Diseases. World Academy of Science, Engineering and Technology, International Science Index, Medical and Health Sciences, 2(9), 1030. - London: 2015.- 2(9).- Р. 1030.
5 Klivleyeva N.G., Lukmanova G.V., Glebova T.I., Shamenova M.G., Saktaganov N.T., Duysenova K.V. Molecular diagnostics and genetic characteristics of influenza A/H1N1 virus circulating in the territory of the West Kazakhstan in 2012-2014 // Journal of Clinical Virology. - Edinburg: 2015.- Р. 22.
6 Ишмухаметова Н.Г., Глебова Т.И., Кузнецова Т.В., Шаменова М.Г., Дуйсенова К.В. Циркуляция вирусов гриппа в Казахстане в эпидемические сезоны 2009 - 2013 гг. // Мат-лы науч.-практич. конференции «Профилактическая медицина: вчера, сегодня, завтра». - Омск: 2013. - С. 57-59.
7 Онищенко Г.Г., Ежова Е.Б., Лазикова Г.Ф. и др. Пандемия гриппа A/H1N1/09 в мире и Российской Федерации в 2009-2010 гг. и прогноз на 2010-2011 гг. // ЖМЭИ. - 2010. - № 6. - С. 12-17.
8 Иванова В.Т., Матюшина Р.О., Слепушкин А.Н. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 2005-2006гг. в России // Вопр. вирусол. - 2008. - №4. - С.13-18.
9 Hoffmann E, Stech J, Guan Y et. al .Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. / / Arch Virol. - 2001. -№ 146 (12). - Р. 2275-89.
10 Reed L., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Amer. J. Hyg.- 1938.- Vol. 27.- P.493.
11 Douwdal W.A., Kendal A., Noble G.R. Influenza virus //Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection. -Washington: 1979. - P. 585-609.
12 Amino D. Method for the quantitative estimation of N-acetilneuraminic acid and their application to hidrolysates of sialomucoids // Biochtm. - 1961. - Vol. 81. - P. 384-392.
Т.И. ГЛЕБОВА1, Н.Г. КЛИВЛЕЕВА1, М.Г. ШАМЕНОВА1, Н.Т. САКТАГАНОВ1, Г.В. ЛУКМАНОВА1, М.К. КАЛКОЖАЕВА1, А.Ж. МУРЗАГАЛИЕВА2, Г. ДОСАНКЫЗЫ3
1ЦР БГМГК «Микробиология жэне вирусология институты» РМК Алматы ц, Цазацстан 2 «Ацтвбе облысыныц денсаулыц сацтау басцармасы» мемлекетт!кмекемесшц шаруашылъщжург!зу цуцыгындагы «Облыстыц клиникалыц инфекциялыц ауруханасы» мемлекетт!к коммуналдыц кэсторыны 3 ЦР ¥ЭМ Тутынушылардыц цуцыцтарын Цоргау комитетшц «¥лттыц сараптама орталыгы» шаруашылыц жург!зу цуцыгындагы
РМКЦызылорда облысы бойынша
КАЗАХСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫН, АРАЛ 0ЩРШДЕП 2015 Ж. ЭПИДЕМИЯЛЬЩ МАУСЫМДАFЫ Т¥МАУ ВИРУСТАРЫНЫН,
АЙНАЛЫМЫ
ТYЙiн: 2015ж. кацтар - наурыз айларында Актебе жэне Кызылорда облыстарындагы емдш мекемелердеп, ЖРВИ, ринофаренгит жэне аденовирусты инфекциялармен наукастанган адамдардан 293 танау мурын сынамасы жэне 48 ;ан сарысуы жиналды. Полимеразды ^збект реакцияда А тумау вирусыныц генетикалы; материалы 12,6 % кураса, В тумау вирусы 1,0 %. Турастын аньщтауда 9,2 % сынамада А/Н3^ тумау вирусыныц РНК курады, 2,7 % - А/НШ1,сонымен коса 0,7 % сынамада тумау вирусыныц А(НШ1+Н3^) ею TYрi бiрдей аныкталды. Биологиялы; сынамаларды полимеразды ^збект реакциясында, сонымен коса ;ан сарысуын иммуноферментп талдау жэне гемагглютинин тежеу рекциясында скрининг жумыстарын ЖYргiзу нэтижелерi макалада керсетшш, Арал ещршде тумау вирустарыныц айналымында А/Н3^, А/НШ1 жэне В TYрлерi бар екендМн айгактайды. Макалада ауру адамдардан А/НШ1 тумау вирусын MDCK клеткаларында жэне дамып келе жаткан тауык эмбриондарында белш алу туралы мэлеметтер кел^ршген.
ТYЙiндi свздер: тумау вирусы, айналым, изолят, гемагглютинин, нейраминидаза
