CC BY-ND
43
декабрь n»I2 (297) ЗНиСО
47
УДК 578.833.28:614.4 (470.63)
ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА НА ТЕРРИТОРИИ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ В 2011-2015 ГГ.
Я.В. Лисицкая, А.С. Волынкина, Е.С. Котенев, Л.И. Заревина, Е.А. Манин, Н.В. Цапко, Л.И. Шапошникова, О.А. Белова
ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора», Ставрополь, Россия
Представлены результаты мониторинга за вирусом Западного Нила в 2011-2015 гг. в Ставропольском крае. Методом полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа исследовано 1 140 пулов иксодовых и аргасовых клещей, 62 пула комаров, 709 проб мозга и печени птиц, 1 541 проба мозга и печени диких млекопитающих, 169 сывороток донорской крови. Приводятся результаты генетического типирования изолятов РНК вируса Западного Нила, а также информация о заболеваемости лихорадкой Западного Нила в Ставропольском крае. Ключевые слова: вирус Западного Нила; лихорадка Западного Нила; изоляты РНК вируса; индикация; мониторинг; циркуляция вируса; заболеваемость.
Yar.V. Lisitskaya, A.S. Volynkina, E.S. Kotenev, L.I. Zarevina, E.A. Manin, N.V. Tsapko, L.I. Shaposhnikova, O.A. Belova □ CIRCULATION OF WEST NILE VIRUS IN THE TERRITORY OF THE STAVROPOL REGION IN 2011-2015 □ Stavropol Antiplague Research Institute of Rospotrebnadzor, Stavropol, Russia.
The results of the monitoring of West Nile virus in 2011-2015 in the Stavropol territory are presented. By the polymerase chain reaction and enzyme immunoassay 1 140 pools of Ixodes and Argas ticks, 62 mosquito pools, 709 samples of brain and liver of birds, 1 541 samples of brain and liver of wild mammals, 169 samples of blood serum have been tested. Presented the results of genetic typing of isolates RNA of West Nile virus and the information about the West Nile fever morbidity in Stavropol territory.
Key words: West Nile virus; West Nile fever; isolates of viral RNA; indication; monitoring; circulation of the virus; morbidity.
Наличие в ряде административных территорий Российской Федерации природных очагов лихорадки Западного Нила (ЛЗН), заболеваемость вспышечного характера среди населения с летальными исходами позволяют отнести это заболевание к числу инфекций, представляющих региональную проблему в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения [6]. Ареал вируса Западного Нила (ВЗН) занимает огромные территории в экваториальном, тропическом и южной части умеренного климатического пояса в Африке, Европе, Америке, Азии, Австралии [5], в пределах Российской Федерации включает юг Европейской части России, южные районы Сибири и Дальнего Востока, однако самые высокие показатели заболеваемости ежегодно регистрируются в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях и Краснодарском крае [4].
ВЗН, впервые изолированный в 1937 г. в Уганде, является представителем семейства Flavivi-ridae рода Flavivirus, относится к антигенному комплексу японского энцефалита и принадлежит к экологической группе арбовирусов.
ВЗН имеет широкий круг восприимчивых хозяев - он способен инфицировать многие виды птиц, млекопитающих и рептилий. Циркуляция ВЗН в природных очагах поддерживается в эпизоотическом цикле, включающем его передачу между птицами и комарами, однако в этот цикл в результате укусов инфицированных комаров могут также включаться люди, лошади и некоторые другие млекопитающие [2]. Основным резервуаром являются птицы, которые в свою очередь способны обеспечить занос вируса на неэндемичные территории. Клиническая картина ЛЗН у восприимчивых хозяев может протекать в различных формах: инаппа-рантной (преобладающая), лихорадочной - до
80 % клинических случаев, менингеальной -13 %, энцефалитической - 6 % [5].
В России ВЗН активно циркулирует на территории Астраханской, Волгоградской, Ростовской областей и в Краснодарском крае [3]. Близость Ставропольского края (СК) к обозначенным территориям, наличие условий природного и антропогенного характера, подходящих для циркуляции ВЗН, дает возможность расширения ареала вируса. Кумо-Манычская впадина (северная граница СК) имеет необходимые условия для заноса и циркуляции ВЗН: благоприятные климатические условия (ранняя весна, жаркое лето, затяжная теплая осень), наличие путей миграции птиц, мест для их гнездовий, обширная сеть рек, озер и лиманов - мест для выплода векторных видов комаров рода Aedes, Culex, Anopheles. На остальной территории СК также есть благоприятные условия для циркуляции ВЗН в бассейнах таких рек, как Кубань, Кума, Егорлык. Наличие большого количества свалок и лесополос способствует увеличению численности многих видов птиц, таких как грач (Corvus frugilegus), хохотунья (Larus cachinnans), восприимчивых к ВЗН. Их миграции в эндемичные по ЛЗН районы могут, наряду с сезонными миграциями перелетных птиц, обусловливать занос ВЗН на территорию края. Несмотря на то, что основными векторными видами являются орнитофильные комары, в эпидемический процесс могут включаться иксодовые и аргасовые клещи. Развитое на территории СК скотоводство и другие благоприятные условия природного и антропогенного характера обусловливают высокую численность клещей, преимагинальные фазы которых (личинки и нимфы) кормятся на птицах, мышевидных грызунах, насекомоядных, в связи с чем на любом этапе развития эти организмы могут стать векторами для ВЗН.
40
ЗНиСО ДШШ №12 (297)
Впервые заболеваемость ЛЗН в СК зарегистрирована в 2012 году, всего 2 случая: один в г. Ставрополе - завозной, предположительно из Волгоградской области или Краснодарского края, второй случай - в Советском районе СК (без установленной связи с другими регионами). Первый случай протекал с серозным менинго-энцефалитом, а второй характеризовался энце-фалитической формой и окончился летально. В другие годы на территории СК заболеваемость ЛЗН не регистрировалась, однако нельзя исключить возможность инаппарантной формы.
Цель работы - проведение мониторинга за циркуляцией и молекулярно-генетическая характеристика изолятов ВЗН на территории Ставропольского края в 2011-2015 гг.
Материалы и методы. Эпизоотологиче-ское обследование было проведено на территории 15 муниципальных районов СК. Сбор полевого материала проводился в 2011-2015 гг. в период с марта по ноябрь. Материалом для исследования служили иксодовые и аргасовые клещи (1 140 пулов/1б 089 особей): Dermacen-tor marginatus (9/3б), D. reticulatus (39/1045), Haemaphysalis inermis (2/10), Haem. punctata (12/128), Hyalomma marginatum (934/140б2), H. scupense (94/500), Ixodes ricinus (41/1б2), Rhipicephalus rossicus (5/14), Rh. sanguineus (1/2), Argas sp.(3/30), добытые в био- и антропоцено-зах с диких млекопитающих (мышевидных грызунов, ежей, зайцев), диких и домашних птиц, крупного и мелкого рогатого скота (КРС, МРС), собак, лошадей, ослов; кровососущие комары (б2 пула/539 особей): Aedes cataphylla (23/221), Ae. diantaeus (7/7б), Ae. vexans (5/24), Ae. dorsalis (5/33), Ae. flavescens (1/10), Ae. cas-pius (3/11), Ae. cinereus (10/85), Ae. behningi (3/б2), Ae. geniculatus (1/3), Ae. detritus (1/8), Culex pipiens (3/б); мозг и печень птиц (709 проб); мозг и печень диких млекопитающих (1 541 проба).
Выявление РНК ВЗН осуществлялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием сертифицированной диагностической тест-системы производства Центрального НИИ эпидемиологии (Москва) «Ампли-Сенс® WNV-FL». Индикация антигена ВЗН осуществлялась методом иммунноферментного анализа (ИФА) с использованием сертифицированной диагностической тест-системы производства ЗАО БТК «Биосервис» БиоСкрин-ВЗН; IgM и IgG определялись с помощью тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» ВектоНил-IgM и ВектоНил-IgG.
Молекулярно-генетическое типирование вируса Западного Нила осуществляли методом прямого секвенирования двух участков генома: 5/-нетранслируемой области участка и гена С (217 н.о.) [8], а также участка Е-гена (728 н.о.) [9] с последующим филогенетическим анализом.
Очистку продуктов ПЦР проводили с помощью набора реагентов AxyPrep™ PCR Cleanup Kit (Axygen Biosciences, США). Расшифровку нуклеотидных последовательностей полученных продуктов ПЦР осуществляли на автоматическом секвенаторе «ABl 3500 Genetic Analyser» (Applied Biosystems, США) с набором реагентов «Big Dye Terminator Kit v.3.1.».
При проведении филогенетического анали- ^^ за использовались следующие нуклеотидные Is— последовательности из базы данных GenBank: = DQ080060, DQ431702, DQ431701, AF196835, о KC601756, AY278441, DQ786572, AF260969, = AF317203, AY278442, AY277252, JX041633, r=i KUNCG, GQ851605, JX041632, DQ256376, ^ GQ851604, DQ176636, EF429198, EF429197, == DQ116961, EF429200, EF429199, FJ265700, ^ FJ265701, FJ265702, FJ265699, FJ425729, FJ265703, FJ425721, AY765264, FJ159130, FJ159129, F159131, AY277251. Анализ проводился с помощью программы MEGA 5.05 по методу объединения ближайших соседей на основе матриц генетических расстояний, рассчитанных по модели Jukes-Cantor, индексы поддержки ветвей определяли перестановочным тестом (bootstep) для 1 000 повторов.
Результаты исследования. Мониторинг за ВЗН на территории СК в указанный период показал, что в биоценозах имеет место циркуляция возбудителя ЛЗН. В эпидемиологический процесс вовлекаются такие резервуарные хозяева, как птицы и грызуны, а также иксодовые клещи, являющиеся неосновными векторными видами. Ранее на территории СК также выявлялось присутствие маркеров ВЗН в полевом материале и материале из окружающей среды, были получены положительные результаты при изучении иммунной прослойки населения [1].
Нами методом ИФА на антиген ВЗН выявлено 8 положительных пулов H. marginatum (1,3 % от общего количества исследованных пулов данного вида) в 5 районах; 1 проба мозга (0,4 %) и 5 проб печени (1,9 %) птиц в 4 районах; 4 пробы мозга (0,5 %) и 16 проб печени (2,2 %) грызунов в 7 районах (рис. 1). Всего циркуляция ВЗН методом ИФА подтверждена на территории 12 муниципальных районов края.
Видовой состав резервуарных хозяев был представлен следующими видами птиц и млекопитающих: голубь сизый (Columba livia), синица большая (Parus major), грач (Corvus fru-gilegus), крачка речная (Sterna hirundo), крачка чайконосая (Gelochelidon nilotica), ворона серая (Corvus cornix), полевка обыкновенная (Micro-tus arvalis), мышь домовая (Mus musculus), мышь лесная (Sylvaemus sp.).
Исследовались пулы H. marginatum, собранные с крупного и мелкого рогатого скота, птиц и грызунов. 25 % положительных пулов было собрано с грача. Присутствие антигена ВЗН в пулах H. marginatum, собранных с птиц, говорит о том, что резервуарные для данной инфекции виды, являясь прокормителями не только орнитофильных комаров, но и преимагиналь-ных фаз клещей, вовлекают их в эпидемический процесс как неосновных переносчиков (основное эпидемиологическое значение вектора передачи имеют комары Diptera, Culicidae [4]). Таким образом, ВЗН проявляет экологическую пластичность.
РНК ВЗН методом ПЦР выявлена в трех пробах: 1 пуле (77 особей на стадии нимфы) H. marginatum (0,3 %), 1 пробе мозга птицы (чернолобый сорокопут (Lanius minor)) (0,5 %), 1 пробе печени птицы (большой баклан (Phalacrocorax carbo)) (0,5 %) из Апанасенков-ского района (рис. 1).
декабрь №12 (297) ЗНивО
49
Л л L" гнкощ' kii li
Крас могшим с и екни
ТрУНЛйСк'НЙ
1(№фя,1(к(я11,1р«ескш1
I [ iOUI1.ll. НСПГКИ»
Грнчгвгкнм
l>.IJ1[4>|J<|tll<'ll4'hlMI
Л|НГ1фГк'НЙ
.IriigMMthHi
Нгфтщ-учскмй ,
(irnHDBtKIIH
Условные обозначения: ф - заболеваемость JI3H; Щ - выявление АГ ВЗН; if - выявление РМК ВЗН
КЧ рек и;
160 Км
Рис. 1. Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по ЛЗН в Ставропольском крае в 2011-2015 гг.
—t—
Из 169 исследованных в 2013 г. методом ИФА сывороток донорской крови обнаружено 4 серопозитивных (2,4 %) (титры IgG от 1 : 1600 до 1 : 51200), по одной положительной пробе в г. Железноводске, пос. Иноземцево городского округа Железноводска, г. Георгиевске и г. Пятигорске.
Для генетической идентификации двух изо-лятов ВЗН, выявленных в образцах суспензий головного мозга чернолобого сорокопута (изо-лят № 20 bird Stavropol 2015) и печени большого баклана (изолят № 15 bird Stavropol 2015), выполнено секвенирование фрагмента гена нуклеокапсида (белка С) размером 217 п.н. и для изолята РНК № 15 bird Stavropol 2015 сек-венирование гена Е (728 н.о).
На основании результатов молекулярно-генетического анализа установлена принадлежность исследуемых изолятов РНК ВЗН к генотипу Ia. Штаммы данного генотипа также распространены на территории Астраханской области. Сравнение расшифрованной нуклео-тидной последовательности гена нуклеокапси-да с данными GenBank c использованием алгоритма BLAST показало ее абсолютную идентичность (100 %) с последовательностями изо-лятов ВЗН, циркулировавших в Астраханской области в 1999-2012 гг.
Филогенетический анализ изолята ВЗН № 15 bird Stavropol 2015 проведен по нуклео-тидной последовательности гена Е и представлен на дендрограмме (рис. 2).
Филогенетическое дерево вируса составляют пять основных известных на сегодняшний день генотипов. Доминирующим является первый генотип, состоящий из двух ветвей: 1 а (представлен космополитными штаммами) и 1b (эндемичные для Австралии штаммы). Второй генотип менее распространен и встречается в Африке, Европе и Волгоградской области Рос-
сийской Федерации. Третий генотип представлен единственным европейским штаммом Ra-bensburg. Представители четвертого генотипа были выделены только на юге Европейской части России, и об их распространении за пределами этой территории на сегодняшний день данных не имеется. Пятый генотип представлен штаммами, циркулирующими наряду со штаммами первого генотипа на территории Индии [7].
Исследованный изолят РНК ВЗН кластеризуется с ранее описанным штаммом из Астраханской области, принадлежащим к генотипу 1 а астраханскому геноварианту. Процент нук-леотидных различий между образцом Ast99-901 и образцом ВЗН № 15 bird Stavropol 2015 составил 0,1 %, выявлена одна нуклеотидная замена (297 С/Т).
Выводы. Результаты проведенной работы показали, что на территории СК имеет место циркуляция ВЗН в природных биоценозах.
Впервые выполненное генетическое типиро-вание изолятов ВЗН с территории СК показало их принадлежность к генотипу 1a (по гену C). Типирование по гену Е изолята № 15 bird Stavropol 2015 показало его принадлежность к астраханскому геноварианту генотипа Ia и 99,9 % сходство с ранее описанным штаммом из Астраханской области, что вписывается в общую картину доминирования первого генотипа ВЗН.
Благоприятные климатические и орографические условия, наличие векторных и резерву-арных видов на сопредельных с эндемичными по ЛЗН территориях создают предпосылки расширения границ очага ЛЗН. В связи с этим необходимо повышение настороженности медицинского персонала по данной инфекции, готовность лабораторной базы для подтверждения как манифестных, так и стертых случаев заболевания ЛЗН.
50
ЗНиСО 4Ш){|>4 №12 (297)
80
100
100
ээ
1аА
r DQ080060 WNVCc Mexico 2004 I- DQ431702 04-216CO USA 2004 DQ431701 04-214CO USA 2004 L AF196835 NY99-flamingo382-99 USA 1999
-KC601756 1048813(human) India 2011
♦ 15 bird Stavropol 2015 {¿o"1 AY278441 Ast99-901 — DQ786572 405/04 France 2004 r AF260969 R097-50 Romania 1996 AF317203 VLG-4 1999 AY278442 LEIV-VlgOO-27924 Russia 2000 AY277252 LEIV-Vlg99-27889 Russia 1999 - JX041633 Hp94 USSR Astrakhan 1963 KUNCG Australia 1960 ]lb
9Э
ЭЭ 92
1ав
1a
100 L
- GQ851605 G161146 India 1957
- JXQ41632 Ig2266 India 1955
- DQ256376 804994 India 1980 ■ GQ851604 G15578 India 1957
5 генотип
au I—
84TL ¡8 f~l_
100
100 76
- DQ176636 Madagascar-AnMg798 "
EF429198 SA93/01 Africa 2001 EF429197 SPU116/89 Africa 1989 DQ116961 Goshawk-Hungary/04
— E F429200 H442 Africa 1958
— EF429199 SA381/00 Africa 2000 FJ265700 V L G -2007-26428 FJ265701 VLG-2007-26571
г FJ265702 VLG-2007-26298 L FJ265699 VLG-2007-26574 FJ425729 57-VLG-07-M FJ265703VLG-2007-26304 FJ425721 Reb-VLG-07-H -AY765264 Rabensburg97-103 ] 3 г
2 ГВНОТИП
100 L
- FJ159130 5 50-05-Uu Russia 2005
- FJ159129 101 5-06-Uu Russia 2006 FJ159131 8 1-05-Uu Russia 2005
- AY277251 LEIV-Krnd88-190 Russia 1998
4 генотип
h
0.05
Рис. 2. Филогенетическое дерево штаммов ВЗН, построенное на основе фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Е. Скобками выделены генотипы и геноварианты
ЛИТЕРАТУРА (п. 9 см. References)
Афанасьева Е.Е. Лихорадка Западного Нила на юге России: современные эпидемиологические проявления и совершенствование методов выявления возбудителя: Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. 2010. 23 с. Иоанниди Е.А. и др. Клинико-эпидемиологические аспекты и вопросы лечения лихорадки Западного Нила / Е.А. Иоанниди, В.Г. Божко, В.П. Смелянский [и др.] // Лекарственный вестник. 2015. № 3 (59). С. 3-7.
Клиндухов В.П. и др. Клинико-эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила в Краснодарском крае / В.П. Клин-духов, Т.В. Шевырева, В.В. Пархоменко [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. 2011. № 2 (125). С. 80-84. Львов Д.К. и др. Флавивирусы (Flaviviridae): Руководство по медицинской вирусологии / Д.К. Львов, П.Г. Дерябин. Под ред. Д.К. Львова. М.: МИА, 2008. С. 226-235.
Львов Д.К. и др. Эпидемиологическая ситуация и прогноз заболеваемости лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации / Д.К. Львов, С.Т. Савченко, В.В. Алексеев [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. Вып. 95. С. 10-12. Монастырский М.В. и др. Эпидемиологическая ситуация по лихорадке Западного Нила в Волгоградской области / М.В. Монастырский, Н.В. Шестопалов, В.Г. Акимкин [и др.] // Электронное периодическое издание ЮФУ «Живые и биокосные системы». 2014. № 9. Режим доступа: http://jbks.ru/archive/issue-9/article-16. Субботина Е.Л. и др. Молекулярная эволюция вируса Западного Нила / Е.Л. Субботина, В.Б. Локтев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2014. № 1. С. 31-37. Шопенская Т.А. и др. Новый вариант вируса Западного Нила и его потенциальное эпизоотическое и эпидемиологическое значение / Т.А. Шопенская, М.В. Федорова, Л.С. Карань [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008. № 5. С. 38-34.
REFERENCES
Afanas'eva E.E. Lihoradka Zapadnogo Nila na juge Rossii: sovremennye epidemiologicheskie projavlenija I sovershenstvovanie metodov vyjavle-nija vozbuditelja [West Nile Fever in the South of Russia: modern epidemiological manifestations and improvement of methods to detect the pathogen]. Extended abstract of candidate's thesis. 2010, 23 p. (In Russian)
2. Ioannidi E.A., Bozhko V.G., Smeljanskij V.P. et al. Kliniko-jepidemio-logicheskie aspekty I voprosy lechenija lihoradki Zapadnogo Nila [Clinical and epidemiological aspects and treatment of West Nile fever]. Lekarstvennyj vestnik, 2015, № 3 (59), pp. 3-7. (In Russian)
3. Klinduhov V.P., Shevyreva T.V., Parhomenko V.V. et al. Kliniko-epi-demiologicheskaja charakteristika lichoradki Zapadnogo Nila v Kras-nodarskom krae [Clinical and epidemiological characteristics of West Nile fever in Krasnodar region]. Kubanskij nauchnyy meditsinskij vestnik, 2011, no. 2 (125), pp. 80-84. (In Russian)
4. L'vov D.K., Derjabin P.G. Flavivirusy (Flaviviridae). Rukovodstvo po meditsinskoj virusologii [Flavivirus (Flaviviridae). Medical Virology manual]. Edited by L'vov D.K. Moscow: MIA, Publ. 2008, pp. 226235. (In Russian)
5. L'vov D.K., Savchenko S.T., Alekseev V.V. et al. Epidemiologicheskaja situatsija I prognoz zabolevaemosti lihoradkoj Zapadnogo Nila na territorii Rossijskoj Federatsii [Epidemiological situation and forecast of the incidence of West Nile fever on the territory of the Russian Federation]. Prob-lemy osobo opasnyh infektsij, 2008, issue 95, pp. 10-12. (In Russian)
6. Monastyrskij M.V., Shestopalov N.V., Akimkin V.G. et al. Epidemiologi-cheskaja situatsija po lihoradke Zapadnogo Nila v Volgogradskoj oblasti [Epidemiological situation on West Nile fever in the Volgograd region] Elektronnoe periodicheskoe izdanie JuFU «Zhivye I biokosnye sistemy», 2014, no. 9. Available at: http://jbks.ru/archive/issue-9/article-16 (In Russian)
7. Subbotina E.L., Loktev V.B. Molekuljarnaja evoljutsija virusa Zapadnogo Nila [Molecular evolution of West Nile virus]. Molekuljarnaja gene-tika, mikrobiologija I virusologija, 2014, no. 1, pp. 31-37. (In Russian)
8. Shopenskaja T.A., Fedorova M.V., Karan' L.S. et al. Novyj variant virusa Zapadnogo Nila I ego potentsial'noe epizooticheskoe I epidemi-ologicheskoe znachenie [New variant of West Nile virus and its potential epizootic and epidemiological significance]. Epidemiologija I in-fektsionnye bolezni, 2008, no. 5, pp. 38-34. (in Russian)
9. Andriyan Grinev, Sylvester Daniel, Susan Stramer а.о. Genetic Variability of West Nile Virus in US Blood Donors, 2002-2005 // Emerging Infectious Diseases / www.cdc.gov/eid / Vol. 14, No. 3, March 2008: Р. 436-444.
Контактная информация:
Лисицкая Яна Владимировна, тел.: +7 (918) 787-34-38, e-mail: yanich.ka@mail.ru
Contact information: Lisitskaya Yana, рhone: +7 (918) 787-34-38, e-mail: yanich.ka@mail.ru
