CC BY
18
Два последующих года методика активного надзора была апробирована во всех субъектах Российской Федерации с использованием критерия выборки - 2 больных на 100 тыс. населения (см. табл. 4). В результате доля выявляемых случаев кори составила 2,2% в 2006 году и 0,5% - в 2007, что совпадало с данными пилотного проекта. При этом диапазон первичных клинических диагнозов у больных с экзантемой и лихорадкой оставался достаточно широким. В целом по стране чаще обследуются больные с диагнозом «краснуха», «аллергическая сыпь», «токсикодермия», «псевдотуберкулез», «скарлатина».
Таким образом, проведенные исследования показали, что тактика активного надзора за корью поддерживает внимание врачей к этой инфекции, благодаря чему среди больных с экзантемой и лихорадкой активно выявляются дополнительные случаи кори на территории Российской Федерации.
Выводы
1. Результаты пилотного проекта подтвердили спорадический уровень заболеваемости на территориях, участвовавших в проекте1.
2. Показана результативность тактики активного надзора за корью в период ее элиминации: ежегодно на каждой территории выявляется дополнительно в среднем 0,3% случая кори.
3. Среди первичных диагнозов превалировали краснуха, аллергическая сыпь и крапивница, токсикодермия и псевдотуберкулез.
4. Активно выявленные случаи заболевания корью характеризуются легким течением болезни, сла-бовыраженными катаральными явлениями или их отсутствием.
5. Определено оптимальное для настоящего вре-
мени минимальное число лиц с экзантемой и лихорадкой, подлежащих лабораторному обследованию на каждой территории страны, - 2 на 100 тыс. населения. ш
Циркуляция на территории Томской области M. tuberculosis генетического семейства Beijing
С.И. Татьков1, О.В. Воронкова2, О.И. Уразова2, А.Ю. Сивков1, Р. Р. Хасанова2,
В.В. Новицкий2, А.К. Стрелис2, С.П. Мишустин3, В.Е. Павлова3,
И.О. Наследникова2, Е.Л. Никулина2
1 ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, лаборатория разработки новых методов диагностики заболеваний человека отдела иммунотерапевтических препаратов,
пос. Кольцово, Новосибирская область
2 ГОУ «ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», кафедры патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии, г. Томск
3 ОГУЗ «Томский областной противотуберкулезный диспансер»
Введение
Современные направления эпидемиологии туберкулеза связаны с изучением гетерогенности популяции M. tuberculosis, определением ареалов распространения возбудителя, путей передачи и механизмов формирования эпидемических и поли-резистентных штаммов [6, 12, 13, 18, 20]. Основой этому послужили расшифровка группой ученых из Великобритании, Франции, США и Дании в 1998 году генома М. tuberculosis, а также открытие у микобактерий туберкулезного комплекса (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. canettii). Кроме того, идентификация целого ряда повторяю-
щихся последовательностей в составе хромосомной ДНК привела к разработке новых эффективных методов маркирования штаммов [15]. В зависимости от применяемого метода для генотипирова-ния штаммов можно получить разные генетические профили М. tuberculosis. В ходе работ по геноти-пированию были определены несколько семейств М. tuberculosis: Beijing (пекинские штаммы); штаммы группы W, также относящиеся к пекинским; штаммы семейства Haarlem; LAM; Africa и др. [8]. Во всем мире широкое распространение получил генотип Beijing. Наиболее часто он встречается в странах Азии: Китае (провинция Beijing - отсюда название
1 Региональные центры (10) - это ТУ Роспотребнадзора по городу Москве, Нижегородской, Ростовской, Новосибирской, Амурской областям, Красноярскому и Пермскому краям и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Республике Башкортостан и Приморском крае, а также ФГУН «НИИЭМ им. Пастера», на которые возложены функции надзора за корью в период реализации Программы ликвидации кори в России.
13
epid 4 (41).indd 13 Ф 9/1/GB 11:52:24 AM
штамма), Монголии, Таиланде, Южной Корее, Вьетнаме, Гонконге. Генотип Beijing был описан в Южной Африке, Колумбии, на Канарских островах [1, 4, 5, 8, 16, 17]. В России также исследуются распространение и характерные особенности М. tuberculosis данного генотипа [3, 10, 11, 14]. Установлено, что у 65,4% больных туберкулезом в Северо-Западном регионе страны поражающим штаммом были микобактерии пекинского семейства [2, 4].
В Западно-Сибирском регионе эпидемиологические показатели заболеваемости туберкулезом провышают средние значения по России [7]. Циркуляция М. tuberculosis Beijing-генотипа, в частности, подтверждена для Новосибирской области. Так, по данным ислледований, проведенных в 2005 году, из 37 клинических изолятов, выделенных от 12 больных, 31 был отнесен к клональному варианту Beijing, то есть наблюдалось абсолютное преобладание штамма данного семейства [9]. Примечательно, что в большинстве случаев генотип Beijing характеризуется наличием резистентности (часто множественной) к лекарственным препаратам.
Геномная ДНК М. tuberculosis генотипа Beijing содержит большое количество (от 15 до 20) инсер-ционных элементов IS6110. При сполиготипи-ровании такие М. tuberculosis характеризуются отсутствием спейсеров с 1-го по 34-й и наличием 9-ти последних спейсеров (с 35-го по 43-й). По-видимому, причины широкого распространения и доминирования генотипа Beijing - повышенная способность М. tuberculosis к накоплению мутаций, обусловливающих развитие лекарственной устойчивости, высокая вирулентность и способность к усиленной трансмиссии [8, 10, 11, 19, 21].
Цель исследования: оценить генетичес-
кую гетерогенность клинических изолятов М. tuberculosis и выявить распространенность генотипа Beijing в Томской области.
Материал и методы
Было исследовано 42 клинических изолята М. tuberculosis, полученных от больных в возрасте от 20 до 70 лет с первично диагностированным инфильтративным туберкулезом легких, проживающих на территории Томской области. Диагноз туберкулеза легких устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Для видовой идентификации M. tuberculosis и определения чувствительности возбудителя к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производили посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2.
MIRU-генотипирование осуществляли используя 12 пар праймеров для амплификации локусов микобактериального генома: MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40. ПЦР проводили в объеме
10 мкл, содержащем 5 - 50 нг ДНК и буфер следующего состава: 60 мМ трис-HCl, рН 8,5, 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон X-100, 10 мМ меркапто-этанол; 0,2 мМ дНТФ, 0,2 мкМ растворы праймеров и 0,5 ед. акт. Taq-полимеразы, на амплификаторе «БИС-110» (без масла) с начальной денатурацией при 94 °С 4 мин, далее - 34 цикла с денатурацией при 94 °С 30 с, отжигом праймеров при 55 °С 20 с, элонгацией при 72 °С 1,5 мин и заключительной элонгацией при 72 °С 5 мин. Аликвоты амплифи-катов фракционировали в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в трис-ацетатном буферном растворе в течение 45 мин при 100 В. Полученную электрофореграмму фотографировали в УФ, число прямых повторов в локусах определяли с помощью программы Quantity one (версия 4.3.1, BioRad). Кластерный анализ М. tuberculosis проводили с помощью программы BioNumerics (Applied Math, США). Дендрограмму рассчитывали с применением категориального коэффициента подобия методом UPGMA-невзвешенного попарного арифметического среднего.
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 представлены дендрограмма кластеризации, отражающая степень генетического родства штаммов (слева), и схематическое изображение VNTR-паттернов (справа) с указанием номера клинического изолята по лабораторному журналу. Доля лекарственно-устойчивых изолятов в этой выборке составляла 36% (с моно- и полирезистентностью - пять штаммов, с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) - десять изолятов), лекарственно-чувствительных - 64% (табл. 1).
Как следует из рисунка, выборка штаммов представлена двумя ветвями А и В. Ветвь В - малочисленная, неоднородная, на ее долю приходится 17% штаммов. Средняя степень гомологии в ней равняется 70%, три штамма идентичны по MIRU и образуют кластер. Ветвь А доминирует в выборке, на ее долю приходится 83% всех изолятов. Однако она также неоднородна: 94% всех штаммов составляют две группы - А1.1 и А1.2; на долю группы А1.1 приходится 74% штаммов ветви А, на долю группы А1.2 - 20%.
В группе А1.1 выделены две достаточно однородные подгруппы, обозначенные А1.1.1 и А1.1.2. В подгруппе А1.1.1 выявлено два немногочисленных кластера идентичных изолятов. Из них первый (изоляты 863 и 877) представлен одинаковым штаммом M. tuberculosis, выделенным от одного и того же больного с интервалом в месяц. Второй кластер (изоляты 853 и 871) также образован изо-лятами, выделенными от одного и того же больного, но с промежутком в три месяца.
Наиболее многочисленной и однородной оказалась подгруппа А1.1.2. На ее долю приходилась половина всех штаммов в выборке, а средняя степень гомологии по подгруппе составила 83,7%. В этой же подгруппе были выделены три кластера,
— 14
epid 4 (41).indd 14 Ф 9/1/08 11:52:25 AM
Рисунок 1.
Дендрограмма кластеризации M. tuberculosis (по результатам MIRU-VNTR-типирования 42 клинических изолятов). Штаммы семейства Beijing выделены темным цветом
Таблица 1.
Распределение 42-х клинических изолятов М. tuberculosis по лекарственной чувствительности/устойчивости
Лекарственно-чувствительные М. tuberculosis Лекарственно-устойчивые М. tuberculosis
спектр устойчивости
HRSKE HRSK HRS HS S H
Номера изолятов на дендрограмме 863, 877, 853, 871, 855, 897, 868, 854, 866, 873, 876, 890, 852, 878, 891, 864, 870, 861, 865, 850, 851, 875, 893, 899, 862, 856, 857 874, 892, 894, 860 879, 869 900, 901, 896, 859 858, 898 867, 872 895
Всего изолятов 27 4 2 4 2 2 1
Примечание: Н - изониазид, Я - рифампицин, S - стрептомицин, К - канамицин, Е - этамбутол
идентичных по М^и-профилю штаммов. Первый генетический профиль изолятов 900 и 901, выде-
был образован пятью изолятами, два из которых ленных от женщин, культуру возбудителя которых
были выделены от одного и того же больного с высевали в один и тот же день. Не исключено,
интервалом в месяц. Обращал на себя внимание что данные изоляты представляют собой случай
15
ер1и 4 (41).1^ 15 9/1/GB 11:52:25 AM
со
о
о
внутрилабораторной кросс-контаминации. Косвенным указанием на это является также и полное совпадение у них спектров лекарственной устойчивости - HRS. В этом же кластере были представлены M. tuberculosis, выделенные в разное время из мокроты двух больных мужского пола. Штаммы оказались идентичными по генотипу и спектру лекарственной устойчивости. Идентичность генотипов штаммов и наличие у них редкой множественной устойчивости сразу к пяти противотуберкулезным препаратам позволяет предположить наличие между больными эпидемиологической связи.
Второй кластер из подгруппы А1.1.2 был представлен девятью изолятами, шесть из которых были выделены при повторных посевах культуры от трех больных с интервалом соответственно в два дня, один месяц и два месяца. Спектры лекарственной устойчивости M. tuberculosis за истекший период не изменились. Остальные три изолята были выделены от разных больных и в разные дни. Все три изолята относились к МЛУ-штаммам, хотя спектр устойчивости у них и был разный: HRS, HRSK и HRSKE. Различие изолятов по спектру лекарственной устойчивости служит аргументом в пользу отрицания внутрилаборатор-ной кросс-контаминации.
И, наконец, третий кластер из подгруппы А1.1.2 образован тремя изолятами, которые были выделены в лаборатории в разное время, что полностью исключает вероятность кросс-контаминации. Все изоляты обладали множественной лекарственной устойчивостью, а один являлся МЛУ-штаммом (устойчивость к HRS).
Для оценки степени распространения штаммов генетического семейства Beijing в Томской области были сопоставлены MIRU-коды штаммов из анализируемой выборки с кодами штаммов, относящихся к пекинскому семейству. Как следует из дендрограммы, пекинские штаммы представлены исключительно ветвью А, группами А1.1 и А1.2 (см. рис. 1). Доля штаммов Beijing в этой выборке велика - не менее 48%. Вместе с тем пекинские штаммы образуют достаточно неоднородную груп-
пу со средней степенью гомологии 75%, в которой выделяется группа очень похожих по MIRU-профилю штаммов со степенью гомологии 92%. Данная группа пекинских штаммов наиболее велика - 70% всех штаммов семейства.
При детальном анализе дендрограммы кластеризации установлено, что лекарственно-устойчивые штаммы M. tuberculosis чаще встречаются среди клинических изолятов, принадлежащих к семейству Beijing. Согласно критерию %-квадрат с высокой степенью достоверности (р < 0,0002) шансы возникновения лекарственной устойчивости среди пекинских штаммов в 18,6 раза выше, чем среди изолятов, не относящихся к этому семейству. Среди пекинских штаммов выделяется кластер (изоляты 874, 892, 894, 900, 901), общий генотип которого статистически достоверно (р < 0,03) ассоциируется с возникновением множественной лекарственной устойчивости.
Выводы
Штаммы, циркулирующие на территории Томской области, оказались генетически неоднородными, доминировали M. tuberculosis, относящиеся к семейству Beijing. Среди штаммов этого семейства в 18,6 раза чаще регистрировалась лекарственная устойчивость возбудителя.
Среди пекинских штаммов выделялась высокооднородная, высокогомологичная группа, для которой было характерно статистически достоверное превышение доли штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.
Исследования поддержаны Федеральным агентством по науке и инновациям в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы» (государственные контракты № 02.512.11.2040, № 02.512.11.2112, № 02.512.12.0013; руководитель - академик РАМН, профессор В.В. Новицкий) и Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ России (НШ-2334.2008.7; руководитель - академик РАМН, профессор В.В. Новицкий).
Summary
For estimating genetic heterogeneity and occurrence of Beijing family strains there were randomly sampled 42 clinical isolates of M. tuberculosis from TB patients with age from 20 to 70 with primary infiltrative pulmonary TB, being living in Tomsk oblast. MIRU-typings were carried out by using 12 loci: MIRU
2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39 and 40. Dendrogram were calculated by UPGMA and categorical coefficient of similarity.
By results of research, the share of drug-resistant isolates of M. tuberculosis in sampling was 36% (MDR-resistant strains were 24%), drug-sensitive isolates were 64%. The sampling of strains were presented by two heterogeneous branches: a branch A - dominant, uniting 83% all isolates, in structure 94% strains
— 16
epid 4 (41).indd 16 Ф 9/1/08 11:52:26 AM
formed groups A1.1 (74% isolates) and A1.2 (20% isolates); a branch B-small, including 17% strains with medium degree homology 70%, 3 strains from which formed cluster and were identical.
For estimation of degree of prevalence of strains M. tuberculosis of genetic family Beijing in Tomsk oblast MIRU-codes strains from analyzed sample with strains codes of Beijing family were compared. It is established, that Beijing strains concern to isolates of groups A1.1 and A1.2 branches A, among which their share made not less than 48% with medium degree homology 75%. Directly in structure of strains of Beijing family it is allocated numerous (70% from the general number of Beijing strains) homogeneous subgroup with degree homology 92%. It is revealed, that drug-resistant variants of M. tuberculosis among Beijing strains meet in 18,6 times more often, than among not Beijing strains. Cluster of Beijing strains, common genotype of which strongly associated with multiple drug resistance (p < 0,03), was revealed on UPGMA dendrogram.
Литература
1. Вишневский Б.И. Фтизиобактериология сегодня и завтра // БЦЖ. 1999. № 3. С. 14, 15.
2. Марьяндышев А.О., Тунгусова О.С., Кауган Д. и др. Молекулярная эпидемиология микобактерий туберкулеза в Баренцевом регионе России и Норвегии // Проблемы туберкулеза. 2001. № 6. С. 17 - 19.
3. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Попова А.Г. и др. Генетический полиморфизм клинических штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории Новосибирской области // Вестник РАМН. 2005. № 1. С. 20 - 23.
4. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф. и др. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных на Северо-Западе России // Проблемы туберкулеза. 1999. № 3. С. 39 - 41.
5. Нарвская О.В, Мокроусов И. В., Лимещенко Е.В. Молекулярная эпидемиология туберкулеза // БЦЖ. 2000. № 3. С. 4 - 6.
6. Сибиряк С.В., Юсупова Р.Ш., Каюмова Э.Ю. и др. Экспрессия Apo-1 / FAs (CD95)-антигена на лимфоцитах периферической крови в норме, при туберкулезе легких и воздействии наркотоксикантов // Гематология и трансфузиология. 1999. Т. 4. № 2. С. 18 - 20.
7. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш. и др. Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции ри-фампицин- и/или изониазидустойчивых изолятов M. tuberculosis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2006. № 2. С. 20 - 24.
8. Скотникова О.И. Молекулярно-биологические методы во фтизиатрии // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005. № 8. С. 13 - 15.
9. Сурикова О.В., Войтих Д.В., Кузьмичева Г.А. и др. Дифференциация микобактерий туберкулеза семейства W-Beijing, распространенных на территории Российской Федерации, на основании VNTR-типирова-ния // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. № 3. С. 23 - 29.
10. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О., Бьюне Г. и др. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза легких генотипа Beijing в местах лишения свободы Архангельской области // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. № 8. С. 35 - 41.
11. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О., Каугант Д.А. и др. Влияние лекарственной устойчивости на фитнес микобактерий туберкулеза генотипа Beijing // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005. № 8. С. 46 - 50.
12. Урсов И.Г. Эпидемиология туберкулеза и диспансеризация населения. - Новосибирск, 2003. - 182 с.
13. Хоменко А.Г. Современные представления о патогенезе туберкулеза // РМЖ. 1998. Т. 6. № 17. С. 23 - 29.
14. Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г. и др. Генотипиро-вание микобактерий, выделенных от больных туберкулезом из пенитенциарного учреждения // Проблемы туберкулеза. 2001. № 7. С. 60 - 62.
15. Cole S.T., Parkhill J., Barrell B. Deciphering the biology of M. tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. 1998. V. 393. P. 537 - 544.
16. Escalante P., Ramaswamy S., Sanabria H. et al. Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru // Tuber. Lung Dis. 1998. V. 79. № 2. P 111 - 118.
17. Feng C.G., Bean A.G.D., Hooi H. et al. Increase in gamma interferon-secreting CD8 p, as well as CD4 p, T-cells in lungs following aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis // Inrfect. Immun. 1999. V. 67. P. 324 - 327.
18. Kapur V., Whittam T.S., Musser J.M. Is Mycobacterium tuberculosis 15,000 years old? // J. Infect. Dis. 1994. V. 170. № 5. Р. 1348, 1349.
19. Narvskaya O., Otten T., Limeschenco E. et al. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg, Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002. V. 21. № 8. Р. 596 - 602.
20. Raviglione M.C., Snider D.E. Jr., Koshi A. Global epidemiology of tuberculosis. Morbidity and mortality of worldwide epidemic // JAMA. 1995. V. 273. P 220 - 226.
21. Sharma S., Sharma M., Roy S. et al. Mycobacterium tuberculosis induces high production of nitric oxide in coordination with production of tumour necrosis factor-а in patients with fresh active tuberculosis but not in MDR tuberculosis // Immunology and Cell Biology. 2004. V. 82. P. 432 - 446.
Ф
Эпидемиологические особенности новой респираторной инфекции - бокавируса человека
Т.Ю. Кондратьева
ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»
В сентябре 2005 года был описан новый вирус, принадлежащий к семейству Parvoviridae и получивший название - бокавирус человека (human Bocavirus, hBoV) [3]. Впервые его обнаружили в назофарингеальных аспиратах (НФА) детей, страдающих острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ) [3].
Семейство Parvoviridae включает два подсемейства: Parvovirinae, поражающее позвоночных
животных, и Densovirinae - поражающее насекомых. Подсемейство Parvovirinae состоит из пяти родов: Parvovirus, Erythrovirus, Dependovirus, Amdovirus и Bocavirus. Наиболее хорошо изученным патогеном человека из подсемейства Parvovirinae является парвовирус В19, принадлежащий к роду Erythrovirus и вызывающий инфекционную эритему («пятую болезнь») у детей и артриты у взрослых,
17
epid 4 (41).indd 17 Ф 9/1/08 11:52:26 AM
