CC BY
64
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616-002-022.7-053.2-078.33
С.Ю. Веселов1, Ю.М. Махмутьева1, Е.В. Гиматдинова1, Р.М. Хайруллина2
циркулирующие иммунные комплексы, включающие продукты гена calc-1, у детей с бактериальными воспалительными процессами разной тяжести
1Кафедра биохимии и биотехнологии биологического факультета ГОУ ВПО Башкирский государственный университет, 450074, РФ, Республика Башкортостан, г Уфа, e-mail: biodekanat@yandex.ru; Иммунологическая лаборатория с отделением клинической иммунологии, ГБУЗ Республиканская детская клиническая больница, 450106, РФ, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Степана Кувыкина, 98; тел. 347 229-08-39, e-mail: imun-lab@ mail.ru
Прокальцитонин (ПКТ) является полипептидом - продуктом трансляции гена CALC-1, который состоит из 116 аминокислотных остатков. После ферментативного нарезания пептида образуется гормон кальцитонин, N-концевой пептид и С-концевой пептид ССР-1. Авторы в сыворотке крови детей с бактериальной инфекцией разной тяжести обнаружили циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), содержащие ПКТ и другие пептиды-предшественники кальцитонина. В наиболее высоких титрах выявляли комплексы, которые включали IgG и ПКТ и/или N-концевой пептид у больных с сепсисом и тяжелой бактериальной инфекцией. Такого типа ЦИК регистрировали у 80% детей этой группы. Результаты исследования сывороток крови у здоровых детей также показали присутствие комплексов аутоантител с низкомолекулярными пептидами-предшественниками кальцитонина. Обсуждается значение ЦИК в прогнозе септических состояний и их роль в патогенезе инфекции.
Ключевые слова: прокальцитонин; циркулирующие иммунные комплексы; бактериальная инфекция
S.Yu. Veselov1, Yu.M.Makhmut’eva1, E.V Gimatdinova1, R.M. Khayrullina2
CIRCULTING IMMUNE COMPLEXES INCLUDING CALC-1 GENE PRODUCTS IN THE CHILDREN WITH BACTERIAL IMFLAMATION OF DIFFERENT SEVERITY
Procalcitonin is a polypeptide product of CALC-1 gene consisting of 116 amino acids. After enzyme processing of this peptide hormone calcitonin, N-terminal peptide and C-terminal peptide CCP-1 are produced. Circulating immune complexes containing procalcitonin and other peptide calcitonin precursors were detected in the serum of children with bacterial infections of different severity. The highest titers of complexes including IgG and procalcitonin and/or N-terminal peptide were detected in patients with sepses and severe bacterial infection. This kind of circulating immune complexes were registered in 80 % of children of this group. The study of the serum of healthy children also showed the presence of complexes of auto-antibodies with low-molecular weight peptide calcitonin precursors. The important of circulating immune complexes for sepsis prediction and its role for infection pathogenesis are discussed.
Key words: procalcitonin; circuiting immune complexes; bacterial infection
Прокальцитонин (ПКТ) - это продукт трансляции гена CALC-1, который в основном синтезируется в нейроэндокринных С-клетках щитовидной железы и К-клетках легких [1]. Этот прогормон, состоящий из 116 аминокислотных остатков (а.к.о.), является предшественником кальцитонина, который участвует в регуляции уровня кальция в организме [2]. При ферментативном нарезании ПКТ помимо кальцитонина, включающего 33 а.к.о., образуются также N-концевой пептид, или N-ПКТ (57 а.к.о.), и С-концевой пептид ССР-1, или катакальцин (21 а.к.о.). ПКТ, N-ПКТ и ССР-1 относят к так называемым предшественникам кальцитонина [3]. При нормальных условиях они находятся в крови в низкой концентрации. При сепсисе и других тяжелых бактериальных инфекциях уровень ПКТ в крови возрастает в десятки и даже тысячи раз
Веселов Станислав Юрьевич, e-mail: veselov.stanislav5@ yandex.ru
[4] за счет его избыточной продукции тканями паренхиматозных органов [5]. Поэтому в настоящее время ПКТ широко используют как биологический маркер воспаления [6, 7]. Наряду с теми особенностями ПКТ, что уже известны, в последнее время появилось сообщение о том, что ПКТ является не только свидетелем вторжения патогенных бактерий, но и медиатором развития септического процесса и причиной дальнейших тяжелых осложнений заболевания. Обнаружено значительное сокращение случаев смерти при экспериментальном сепсисе у грызунов [8] и свиней [9] при введении им антител (АТ) к различным участкам ПКТ. Установлено присутствие АТ к ПКТ в препарате иммуноглобулина человека для внутривенного использования [10]. С присутствием этих аутоантител авторы связывают положительное влияние препаратов иммуноглобулина на исход септических процессов за счет возможного образования комплексов с ПКТ и его последующей нейтрализации.
- 13 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
Цель настоящей работы - выявление комплексов аутоантител с пептидами - предшественниками каль-цитонина у детей с бактериальными инфекциями разной тяжести.
Материал и методы. Работа выполнена на базе биологического факультета Башкирского государственного университета и иммунологической лаборатории с отделением клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы г Уфы. В исследование включены 74 ребенка в возрасте от 2 дней жизни до 14 лет, которых на основании клинических симптомов и лабораторных данных разделили на три нозологические группы: 1-я группа - 30 детей с сепсисом и тяжелой бактериальной инфекцией (остеомиелит, гнойный менингит, деструктивная пневмония, перитонит, мастоидит); 2-я группа - 24 детей с локальной бактериальной инфекцией средней степени тяжести без системных проявлений (пневмония, бронхит, отит, синусит); 3-я группа - 20 практически здоровые дети и дети с заболеваниями не бактериальной природы (внутричерепная гипертензия, вегетососудистая дистония, гастродуоденит, гидроцефалия, аллергический ринит вне стадии обострения).
Исследования крови на ПКТ и наличие иммунных комплексов у детей с воспалительными процессами проводили до начала антибактериальной терапии. Содержание ПКТ в плазме у больных определяли иммунохемилюминесцентным методом на аппарате Ciba-Coming MagicR Lite II (Bayer) с использованием диагностического набора «Прокальцитонин-ЛюмиТест®» производства компании «БРАМС АГ», (Германия) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), включающих продукты гена CALC-I, определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. В часть лунок планшета (Costar, Нидерланды) вносили по 100 мкл моноклональных мышиных АТ PCC14 (к С-терминальному концу ПКТ) или PCF38 (к N-терминальному концу ПКТ) (“Bialexa”, Москва) в концентрации 1 мкг/мл. АТ разводили в 0,1 М фосфатносолевом буфере (ФСБ), рН 7,4. Сенсибилизацию определяли при 4°С в течение 16 ч. По окончании промывки в лунки с сорбированными мышиными АТ и без АТ вносили по 100 мкл исследуемых сывороток в разных разведениях, начиная с 1:32. После инкубирования планшетов при 37°С в течение 1 ч и последующей промывки вносили пероксидаз-ный конъюгат к IgG человека в разведении 1:48 000 (ООО «Сорбент Лтд.», Москва). Разведения сывороток и конъю-гантов готовили на ФСБ, который содержал 0,4% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% твина-20. Реакцию проявляли смесью тетраметилбензида с перекисью водорода (НВО «Иммунотех», Москва) и после добавления 1 М раствора серной кислоты оптическую плотность хромогена регистрировали на микроридере Uniskan (Финляндия) при 450 нм. Из значений оптической плотности продукта реакции в лунках, сенсибилизированных мышиными АТ, вычитали соответствующие показатели оптической плотности в лунках без АТ. За титр ЦИК принимали наибольшее разведение сыворотки, при котором хромофорный ответ в лунке двукратно превышал хромофорный ответ в контрольных лунках с мышиными АТ, в которые вместо исследуемых сывороток вносили смесь для разведения сывороток. При титрах менее 1:32 результат считали отрицательным, это означало, что специфические ЦИК отсутствуют. Для удобства изложения материала комплексы АТ с N-концевым пептидом и/или ПКТ, которые реагируют с мышиными АТ к N-концевой части прогормона, обозначили IgG ЦИКП. Таким образом, ЦИК, включающие катакальцин и/или ПКТ, реагирующие с мышиными АТ к С-концевому фрагменту ПКТ, получили аббревиатуру IgG ЦИКС. Вычисляли средние значения ПКТ и геометрических титров (СГТ) ЦИК. Вывод о достоверности различия показателей делали при p < 0,05. Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Statistica 6.0.
Количество лиц в группах, в сыворотках которых обнаружены разные виды ЦИК. Перекрестная штриховка - процент от общего числа людей в группе.
1 - 1-я группа, 2 - 2-я, 3 - 3-я.
Результаты и обсуждение. Среди двух вариантов ЦИК в более высоких титрах выявили IgG ЦИКП в сыворотках больных 1-й группы (см. таблицу). СГТ этих комплексов в указанной группе достоверно отличались от таковых IgG ЦИКС (р = 0,011). Внутри 2-й и 3-й групп достоверных различий между СГТ разных видов ЦИК не выявили. При сравнении уровня ЦИК в 1-й и 3-й группах обнаружили достоверную разницу между содержанием IgG ЦИКП (СГТ 6,58 ± 0,26 и 5,67 ± 0,22 соответственно; р = 0,029).
Титры IgG ЦИКП у детей с сепсисом и тяжелой бактериальной инфекцией также достоверно превышали титры IgG ЦИКС (р = 0,028) у здоровых детей и детей без инфекционно-воспалительных процессов. У детей с локальными инфекциями и в группе контроля достоверных различий не обнаружили. При сравнении уровня ЦИК в 1-й и 2-й группах у тяжелых больных отметили более высокие титры IgG ЦИКП по отношению к IgG ЦИКС (6,58 ± 0,26 и 5,60 ± 0,16 соответственно; р = 0,026) и IgG ЦИКП (6,58 ± 0,26 и 5,81 ± 0,25 соответственно; р = 0,049).
При определении частоты встречаемости разных ЦИК среди исследуемых групп выявили, что наибольшее (80%) количество детей с сепсисом и тяжелыми бактериальными инфекциями содержали в сыворотке IgG ЦИКП (см. рисунок). Эти же ЦИК наиболее часто встречали во 2-й и 3-й группах (73 и 60% соответственно). IgG ЦИКС определяли только у 40% детей 1-й и 2-й групп и 30% 3-й.
Интересно, что ЦИК с продуктами гена CACL-1
СГТ циркулирующих комплексов иммуноглобулинов с продуктами гена CALC-I и средний уровень ПКТ в разных группах обследуемых
Группа паци- ентов IgG ЦИКС IgG ЦИКп Средний уровень (медиана) и размах колебаний значений ПКТ, нг/мл
1-я 5,50±0,23a 6,58±0,26b 4,29 (1,00-257,50)
(n = 12/30) (n = 24/30) (n = 30)
5,60±0,16a 5,81±0,25a 0,35 (0,15-0,74)
2-я (n = 10/24) (n = 16/22) (n = 24)
5,33±0,21a 5,67±0,22a 0,13 (< 0,1-0,26)
3 я (n = 6/20) (n = 12/20) (n = 20)
Примечание. * - n (дробь) - отношение количества сывороток, содержащих специфические ЦИК, к общему количеству исследуемых сывороток; величина титров ЦИК, которые достоверно различаются между собой, обозначены разными буквами.
- 14 -
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
обнаружили не только в группах с бактериальной инфекцией, но и у здоровых детей и детей с не бактериальными процессами. Поскольку уровень ПКТ в 3-й группе был невысоким (см. таблицу), то, скорее всего, эти ЦИК образовались преимущественно при участии N-концевого пептида и катакальцина. Эти пептиды циркулируют в крови здоровых людей в концентрации, превышающей уровень ПКТ приблизительно в 20 раз [3]. У детей с бактериальными процессами, прежде всего с сепсисом и тяжелой инфекцией, наблюдали значительно более высокий уровень ПКТ. Поэтому ЦИК могут в этом случае формироваться с участием как ПКТ, так и n-концевого пептида и катакальцина. Ранее было показано, что концентрация двух последних пептидов, особенно N-ПКТ, также возрастает при инфекционновоспалительных процессах [11]. По нашему мнению, полученные результаты логически обусловлены, так как аутоАТ, в том числе к широкому кругу цитокинов, были обнаружены как у пациентов с различной патологией, так и у здоровых людей [12, 13]. В то же время аутоАТ к белку группы ядерных протеинов с высокой электрофоретической подвижностью (HMGB1), который также является участником развития септического процесса, защищают пациентов от смертельного исхода [14]. Можно предположить, что обнаруженный высокий уровень IgG ЦИКП у наблюдаемых нами детей с тяжелой инфекцией, которые были успешно выписаны из стационара, связан с дополнительной продукцией IgG к N-концу ПКТ. Эта защитная физиологическая реакция позволяет осуществлять нейтрализацию не только ПКТ, но и n-концевого пептида, который, вероятно, не в меньшей мере ответствен за неблагоприятные исходы тяжелой бактериальной инфекции [15].
Таким образом, мы впервые выявили ЦИК, включающие продукты гена CALC-1, у детей с бактериальными инфекциями разной степени тяжести, у детей с процессами, не связанными с инфекцией, и у здоровых детей. Наиболее высокие титры ЦИК, включающих IgG, ПКТ и N-ПКТ, определяли у детей с тяжелой бактериальной инфекцией и сепсисом, что, возможно, отражает степень тяжести инфекции и реакцию организма, направленную на ограничение возможных отрицательных последствий.
ЛИТЕРАТУРА
6. Гиматдинова Е.В., Хайруллина Р.М., Гарипова М.И., Сотникова Ю.М., Веселов С.Ю. Диагностические и прогностические возможности прокальцитонина и С-реактивного белка при различных инфекционно-воспалительных процессах у детей. Фундаментальные исследования. 2011; 10 (ч.2): 280-2.
7. Лыскина Г.А., Дронов И.А., Тугаринова Г.В., Фоменко Т.М. Определение уровня прокальцитонина крови в педиатрической практике. Педиатрия. 2006; 4: 32-44.
REFERENCES
1. Becker K.L., Snider R., Nylen E.S. Procalcitonin in sepsis and systemic inflammation: a harmful biomarker and a therapeutic target. Br. J. Pharmacol. 2010; 159: 253-64.
2. Rittel W., Maier R., BruggerM, Kamber B., RinikerB., Sieber P. Structure-activity relationship of human calcitonin. III. Biological activity of synthetic analogues with shortened or terminally modified peptide chains. Experientia. 1976; 32; 246-8.
3. Snider R.H., Nylen E.S., Becker K.L. Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemical characterization. J. Invest. Med. 1997; 45 (9): 552-60.
4. Assicot M., Gendrel D., Carsin H., Raymond J., Guilbaud J., Bohuon C. High serum procalcitonin concentration in patients with sepsis and infection. Lancet. 1993; 341: 515-8.
5. LinscheidP., SeboekD., Nylen E.S. In vitro and in vivo calcitonin I gene expression in parenchymal cells: a novel product of human adipose tissue. Endocrinology. 2003; 144: 5578-84.
6. Gimatdiniva E.V., Khyirullina R.M., Garipova M.I., Sotnikova Yu.M., Veselov S.Yu. The diagnostic and prognostic capabilities of procalcitonin and C-reactive protein at various infectious-inflammatory processes in children. Fundamental’nye issledovaniya. 2011; 10 (part 2): 280-2 (in Russian).
7. Lyskina G.A., Dronov I.A., Tugarinova G.V., Fomenko T.M. Determination of the level of procalcitonin blood in pediatric practice. Pediatriya. 2006; 4: 32-44 (in Russian).
8. Nylen E.S., Whang K.L., Steinwald P.M., Snider R.H., White J.C., Becker K.L. Procalcitonin increases mortality and procalcitoninrecognizing antiserum improves mortality in an experimental model of sepsis. crit. care Med. 1998; 26: 1001-6.
9. Martinez J.M., Wagner K.E., Snider R.H., Nylen E.S., B. Muller, Sarani B. Late immunoneutralization of procalcitonin arrests the progression of lethal porcine sepsis. Surg. Infect. 2001; 2: 193-201.
10. Murakami K., Suzuki C., Fujii A., Imada T. Intravenous immunoglobulin prevents release of proinflammatory cytokines in human monocytic cells stimulated with procalcitonin. Inflamm. Res. 2012; 61 (6): 617-22.
11. Whang K.T., Steinwald P.M., White J.C., Nyle E.S., Snider R.H., Simon G.L. Serum calcitonin precursors in sepsis and systemic infection. Clin. Endocrinol. Metab. 1998; 83: 3296-301.
12. Lutz H.U., Binder C.J., Kaveri S. Naturally occurring autoantibodies in homeostasis and disease. Trends Immunol. 2008; 30 (1): 43-51.
13. Watanabe M., Uchida K., Nakagaki K. Anti-cytokine are autoantibodies are ubiquitous in healthy individuals. FEBS Lett. 2007; 581: 2017-21.
14. Barnay-Verdier S., Fattoum L, Borde C., Kaveri S., Gibot S., Marechal V Emergence of autoantibodies are to HMGB1 is associated with survival in patients with septic shock. Intensive Care Med. 2011; 37: 957-62.
15. Tavares E., Minano F.J. Immunoneutralization of the aminopro-calcitonin peptide of procalcitonin protects rats from lethal endo-toxaemia: neuroendocrine and systemic studies. Clin. Sci. 2010; 119: 519-34.
Поступила 08.02.13
- 15 -
