CC BY
29
УДК 573.088.1
ЦИФРОВАЯ МОДЕЛЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЪЕМА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ В БИОРЕАКТОРЕ
В.Ю. Сидорова, доктор с.-х. наук Е.Б. Петров, кандидат с.-х. наук ИМЖ - филиал ФГБНУ ФНАЦ ВИМ E-mail: vniimzh@mail.ru
Аннотация. Одним из видов культивирования стволовых клеток является метод матриксов-носителей или монослойного выращивания. Объемные носители с клеточной массой в зависимости от технологии культивируются либо с перемешиванием посредством барботера, эрлифтера, мешалки и т.д., либо без перемешивания. Для мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) применяется метод культивирования без перемешивания. На одной частице объемного носителя диаметром 16,0-23,0 мм помещается 350-630 (в среднем 460) клеток. Полный цикл культивирования между заменами истощенной культуральной жидкости составляет 4 суток. За это время проходит 3,5-4 митотических цикла, то есть количество биомассы стволовых клеток увеличивается в 5 раз, так как из одной материнской клетки образуются две дочерних. Поэтому для успешного проведения эксперимента необходимо точно рассчитать количество клеточной массы для заселения, полученный урожай, объем матриксов-носите-лей и культуральной жидкости. Посев клеток в культуральные флаконы с площадью поверхности 25 см2 осуществляется в концентрации 1x103 с учетом урожая 1106 на этой же площади поверхности или на 1 см2 матрикса это составит 40 000 клеток. Объем культурального флакона - 500 см3 или 20 см3 культуральной жидкости на 1 см2 матрикса. То есть для культивирования 5 млн клеток (5106) потребуется 25 см2 матрикса и не менее 500 см3 питательной среды на 1 цикл выращивания, равный 4 суткам при температурном режиме 37°С, избыточном давлении 0,18-0,20 бар и рН 7,0-7,2.
Ключевые слова: монослойное выращивание, питательная среда, объемные носители, матрикс, цикл выращивания, площади поверхности.
Введение. Культивирование стволовых клеток животных (СК) в настоящее время широко распространено у нас в стране и за рубежом. Получение клеточного материала необходимо для проведения научных исследований и практических работ в медицине, ветеринарии, иммунологии, генной инженерии, клеточной биотехнологии, биохимии и т.д. [6,7]. Одним из видов культивирования СК является метод матриксов-носителей или монослойного выращивания [1,2,4]. Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных частиц - объемных носителей, которые представляют собой шарики, бусины, скаф-фолды, гели и т.д.: инокулированные клетки прикрепляются к поверхности частиц носителя и, размножаясь, образуют сплошной монослой. Объемные носители с клеточной массой в зависимости от используемой технологии культивируются либо с перемешиванием, посредством барботера, эрлифтера,
мешалки и т.д., либо без перемешивания. На одной частице носителя диаметром 16,0-23,0 мм помещается 350-630 (или в среднем 460) клеток.
Основными преимуществами культивирования на матриксах-носителях являются:
- создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.);
- получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн клеток в 1 мл;
- ведение постоянного контроля за динамикой роста клеток;
- снижение рисков контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культурального сосуда;
- значительная экономия питательной среды;
- возможность регулировать различные концентрации объемных носителей с выросшими на них клетками;
- возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах;
- возможность добавления свежих порций носителя [9].
При отработанной технологической схеме адгезии стволовых клеток на объемных носителях через 2,5-3,0 ч после заселения с заданной посевной концентрацией количество клеток, прикрепившихся к носителю, составляло около 95%. Теоретически рассчитанный при данной посевной концентрации индекс пролиферации достигает 6-8, практический 4,2. Использование системы с объемными носителями включает положительные стороны суспензионного культивирования: использование носителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур. Концентрация матриксов варьирует от 0,5 до 5 мг/мл конечного объема. При культивировании применяют концентрацию, не превышающую 1 мг/мл: повышение концентрации до 3 мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и ее заменой, что осложняет технологический процесс.
Важное значение для культивирования клеток на объемных носителях имеет питательная среда. Правильный подбор среды способствует оптимизации процесса пролиферации и повышению качества клеток. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Доказано, что линия клеток Vero на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла-Дюльбеко ДМЕМ с посадочной концентрацией клеток 105 кл/мл по сравнению со средой 199. Если же количество клеток снизить до 104, то лучшие результаты даст среда 199 [8]. В определенном объеме среды можно культивировать несколько тысяч объемных носителей, общая площадь которых достигает 10 см2/мл и более и занимает до 1-10% объема среды.
Целью работы являлось определение полезного объема питательной среды для культивирования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток животных на матриксе-
носителе в рабочей камере экспериментального двухкамерного биореактора.
Материалы и методы. Материалом мат-рикса-носителя для культивирования мульти-потентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) животных были гели с 4; 5; 7,4% сыворотки крови животных (рис. 1). В качестве культуральной жидкости использовалась питательная среда ДМЕМ с Ь-глутами-ном и солями Эрла, представляющая собой прозрачный раствор, окрашенный феноловым красным, рН 7,3, осмолярность 297 ш08 /кг, концентрация глюкозы 0,9 г/л (рис. 2).
Исследования проводились с использованием методов анализа литературных данных, математического и статистического анализа имеющегося экспериментального материала, имитационного моделирования [3,5].
Рис. 1. Матрикс-носитель для культивирования ММСК
Рис. 2. Культуральная среда ДМЕМ
Результаты и обсуждение. Полный цикл культивирования между заменами истощен-
ной культуральной жидкости составляет 4 суток. За это время проходит 3,5-4 митоти-ческих цикла, т.е. количество биомассы стволовых клеток увеличивается в 5 раз, т.к. из одной материнской клетки образуются две дочерних. Поэтому для успешного проведения эксперимента необходимо точно рассчитать количество клеточной массы для заселения, полученный урожай, объем матриксов-носителей и культуральной жидкости. На сохранение химического состава питательной среды ДМЕМ влияют продолжительность периода культивирования клеточной биомассы и пенообразование. Пенообразо-вание при проведении процесса культивирования следует отнести к вредным явлениям, осложняющим процесс культивирования. Питательные среды являются классическим примером хорошо пенящихся жидкостей (таблица).
Как видно из таблицы, химические свойства среды ДМЕМ близки по составу крови, сыворотке и плазме крови животных (данные по крупному рогатому скоту), в том числе по таким физическим показателям, как плотность (1,1; 1,055; 1,029; 1,031 г/см3 соответственно) и вязкость, что свидетельствует об их близкой биохимической природе. В ходе экспериментальных исследований была поставлена цель изучить пенообразование среды ДМЕМ в рабочих камерах экспери-
ментального двухкамерного биореактора при использовании термостатирующего и барботирующего устройств. При поддержании основных контролируемых параметров в рабочих камерах со стабилизацией температурного режима до 40°С было установлено, что пенообразование при термостатировании культуральной жидкости ДМЕМ и барботи-ровании практически не наблюдается.
Дальнейшие исследования показали, что гелевые матриксы-носители не увеличились в объеме: при культивировании при температуре 37°С в течение 8 часов их физические свойства остались неизменными. То есть при расчете полезного объема питательной жидкости такие параметры, как увеличение мат-риксов-носителей и пенообразование, можно не учитывать. Учитываемые основные физические параметры: наполняемость объема рабочей камеры; плотность роста биомассы; клоногенная активность (эффективность клонообразования); митотический индекс.
Плотность роста биомассы составляет: 3-104 на 1 см2 матрикса - низкая плотность; 2-105 - средняя плотность посева; 4-105 - высокая плотность; 1-106 - очень высокая плотность. Следовательно, можно создать цифровую модель (формула) с изменяемыми параметрами плотности посева (заселения стволовых клеток на матрикс) и объема питательной среды, если остальные переменные, определяющие период культивирования, полезный объем рабочей камеры биореактора и митотический индекс - величины постоянные:
Ь = р- тй,
где р - плотность объема; т - объем матрикса; й - наполняемость рабочей камеры; Ь - объем среды.
Все параметры сопряженно-заменяемые. Посев клеток в культуральные флаконы с площадью поверхности 25 см2 осуществляется в концентрации 1x10 с учетом урожая 1-106 на этой же площади поверхности, или на 1 см2 матрикса это составит 40 000 клеток. Объем культурального флакона - 500 см3 или 20 см3 культуральной жидкости на 1 см2 матрикса. То есть для культивирования 5 млн клеток (р) (5-106) потребуется 25 см2
Таблица. Химический ^ состав среды ДМЕМ, %
Показатель Культураль-ная среда ДМЕМ Состав крови
кровь сыворотка крови плазма крови
рН 7,0 7,5 7,5 7,2-7,4
Массовая 15,6 8,0 7,4 10,0
доля СВ
в т.ч.:
молочный - - - -
жир
липиды - 0,8 0,4 0,16
(общие)
белки 8,0 7,8-9,1 7,4-8,1 6,4- 8,2
лактоза - - - -
глюкоза 0,003 0,006 0,037 0,005-
0,007
мине- 0,003 0,009 0,009- 0,009
ральные 0,015
вещества
3
матрикса (m) и не менее (¿=25-20) 500 см питательной среды на 1 цикл выращивания, равный 4 суткам при температурном режиме 37°С, избыточном давлении 0,18 бар и рН 7,0-7,2 при d=0,75 .
Заключение. Цифровая модель определения объема питательной среды в зависимости от матрикса-носителя с изменяемыми параметрами включает основные и дополнительные (ограничивающие) переменные. Основными переменными являются: плотность посева (p), объем биореактора (b), заполняе-мость биореактора (d). Дополнительные переменные - полезный объем рабочей камеры биореактора, митотический индекс, эффективность клонообразования. Для культивирования 5 млн клеток (5-106) потребуется: 25 см2 матрикса и не менее (25-20=) 500 см3 питательной среды на 1 цикл выращивания, равный 4 суткам при определенном температурном режиме 37°С, избыточном давлении
0.18.бар и рН 7,0-7,2.
Литература:
1. Тишин В.Б. Культивирование микроорганизмов: кинетика, гидродинамика, тепломассообмен. СПб., 2012.
2. Перспективы использования стволовых клеток сельскохозяйственных животных в АПК / Рогов И.А. и др. // Биотехнология. Казань, 2014. Т. 2. С. 72-79.
3. Моделирование выращивания мяса in vitro на плоских и объемных носителях / Рогов И.А. и др. // Прикладная математика и программирование. 2014. Т. 10.
4. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа / Серебрякова Е. и др. // Микробиология. 2002. Т. 71.
5. Интеллектуальная сельскохозяйственная техника нового поколения / Рогов И.А. и др. // Вестник ВНИ-ИМЖ. 2014. № 3(15). С. 3-65.
6. Cederberg C. Including carbon emissions from deforestation in the carbon footprint of Brazilian beef // Environmental Science&Technology. 2011. № 45. S. 1773.
7. Post M.J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects // Meat Science. 2012. Vol. 92. P. 297-301.
8. Shah R.K. Compact Heat Exchangers- Recuperators and Regenerators. Taylor&Francis Group, 2017. 1560 p.
9. Telugu B.P. The promise of stem cell research in pigs and other ungulate species // Stem Cell Reviews. 2010. № 6(1). S. 31-41.
Literatura:
1. Tishin V.B. Kul'tivirovanie mikroorganizmov: kineti-ka, gidrodinamika, teplomassoobmen. SPb., 2012.
2. Perspektivy ispol'zovaniya stvolovyh kletok sel'skoho-zyajstvennyh zhivotnyh v APK / Rogov I.A. i dr. // Bio-tekhnologiya. Kazan', 2014. T. 2. S. 72-79.
3. Modelirovanie vyrashchivaniya myasa in vitro na plos-kih i ob"emnyh nositelyah / Rogov I.A. i dr. // Priklad-naya matematika i programmirova-nie. 2014. T. 10.
4. Ocenka gidrofobnyh svojstv bakterial'nyh kletok po ad-sorbcii na poverhnosti kapel' hloroforma / Serebryakova E. i dr. // Mikrobiologiya. 2002. T. 71.
5. Intellektual'naya sel'skohozyajstvennaya tekhnika no-vogo pokoleniya / Rogov I.A. i dr. // Vestnik VNIIMZH. 2014. № 3(15). S. 3-65.
6. Cederberg C. Including carbon emissions from deforestation in the carbon footprint of Brazilian beef // Environmental Science&Technology. 2011. № 45. S. 1773.
7. Post M.J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects // Meat Science. 2012. Vol. 92. P. 297-301.
8. Shah R.K. Compact Heat Exchangers- Recuperators and Regenerators. Taylor&Francis Group, 2017. 1560 p.
9. Telugu B.P. The promise of stem cell research in pigs and other ungulate species // Stem Cell Reviews. 2010. № 6(1). S. 31-41.
THE DIGITAL MODEL OF NUTRIENT MEDIUM VOLUME, IN BIOREACTOR DETERMINING V.Y. Sidorova, doctor of agricultural sciences E.B. Petrov, candidate of agricultural sciences IMJ - filial FGBNY FNAC VIM
Abstract. One of the stem cells' cultivation types is the method of matrices-carrier or monolayer cultivation. Volumetric carriers with cells' mass, depending on the technology, are cultivated either with stirring, by means of a bubbler, an airlifter, a stirrer, etc., or without stirring. For MMSC cultivation method without mixing are applied: 350630 (or an average of460) cells are placed on one particle of matrices- carrier (MN) with a diameter of 16,0-23,0 mm. The complete cycle of cultivation between of exhausted culture substitutions duration is 4 days. During this time, 3,5-4 mitotic cycles pass, thus the stem biomass amount increases in 5 times, since two daughter cells are formed from one parent ones. Therefore, for a successful experiment it is necessary to accurately cal-culate the amount of cell biomass, the resulting crop, the volume of carrier matrices and cultured fluid. Sowing cells in cultured bottles with a surface area of 25 cm2 is carried out in a concentration of1x103 taking into account the yield of 1106 on the same surface area, or 1 cm2 of the matrix is 40 000 cells. The volume of the culture bottle is 500 cm3, or 20 cm3 of the culture liquid per 1 cm2 of the matrix. That is, the cultivation of 5 million cells (5106), 25 cm2 of the matrix will be required, or at least (2520=) 500 cm3 of the nutrient medium for 1 growing cycle equal to 4 days at a temperature of 37 °C, at over pressure of 0,18 bar and pH of 7,0-7,2.
Keywords: monolayer cultivation, nutrient medium, bulk carriers, matrix, cycle of growing, area of surface.
