CC BY
49Циано-бактериальные сообщества в биодеградации нефтяных углеводородов в почвах
Сопрунова О.Б. fsoprunova@mail.ru)
Астраханский государственный технический университет
В настоящее время наиболее перспективными и эффективными методами очистки почв и водоемов от широкого круга загрязняющих веществ являются приемы биоремедиации, основанные на биостимуляции in situ или in vitro и биоаугментации ("биоулучшении") [1]. Однако, как правило, традиционно разрабатываемые и применяемые технологии, базируются на использовании моно- или поликультур бактерий, грибов и дрожжей. Несмотря на колоссальную роль микроорганизмов в трансформации органических веществ, способы биоремедиации, базирующиеся на их использовании, не лишены недостатков, так как селектированные культуры гетеротрофных микроорганизмов, применяемые в экологической биотехнологии, обладают относительно узким спектром биогеохимических функций. Природные сообщества, включающие в себя представителей нескольких трофических уровней, в том числе и фотосинтетиков: эукариотических водорослей, цианобактерий, осуществляют круговорот биогенных элементов и трансформацию органических веществ, обладая более широким набором этих функций. Особую группу в отношении устойчивости к различного рода загрязняющим веществам, в том числе и нефтяным углеводородам, представляют собой цианобактерии. Исследования, посвященные физиологии и экологии цианобактерий, затрагивали вопросы их адаптации к нефти и нефтепродуктам [9], возможности перехода к фотогетеротрофному образу жизни [6], способности увеличения количества углеводородокисляющих микроорганизмов в ассоциациях [3]. Использование потенциальных возможностей не только микробных, но и циано-бактериальных сообществ является перспективным направлением совершенствования технологии очистки водных и почвенных экосистем, что рассматривалось в немногочисленных исследованиях [4, 11, 14].
Объектами исследований являлась нефтезагрязненная почва, отобранная на буровой площадке месторождения Баирское Республики Калмыкия. Образцы отбирались из горизонта А^х с глубины 0-20см. Химические показатели нефтезагрязненной почвы, используемой в экспериментальных исследованиях, представлены в таблице 1.
Таблица 1. Химические показатели почвы, используемой в экспериментальных исследованиях.
Показатель, ед.изм. (погрешность) Содержание
рН солевой, ед. рН (±0,2 ед.) 7,4
Сумма обменных оснований, мг-экв/100г (±10%) 0,7
Емкость поглощения, мг-экв/100г (±10%) 34,9
Кобщ., мг/100г 1,8
N03, мг/100г 740,0
Калий обменный, мг/100г 67,0
Фосфор подвижный (Р), мг/100г 4,7
Фосфор подвижный (Р205), мг/100г 100,8
Суммарные нефтяные углеводороды, % (±10%) 11,0
Углерод органический (Сорг), % 10,3
Сорг/.Кобщ. 5,7
Сумма н-алканов С10-С36, г/кг 58,6
Средние н-алканы С10-С17, г/кг 21,8
Высшие н-алканы С18-С36, г/кг 36,8
Сумма ПАУ, мкг/кг 376,3
2-х ядерные ПАУ, мкг/кг 302,2
3-х ядерные ПАУ, мкг/кг 59,6
4-х ядерные ПАУ, мкг/кг 10,3
5-ти ядерные ПАУ, мкг/кг 4,2
Для изучения роли циано-бактериальных сообществ (ЦБС) в деградации углеводородов, входящих в состав нефтезагрязненных почв, использовали сообщество, выделенное из очистных сооружений газо-химического комплекса и культивируемое в лабораторных условиях [11]. Эдификаторами сообщества являются нитчатые Phormidium tenuissimum и одноклеточные цианобактерии Synehocystis minuseula и Synechococcus elongates, формирующие плотные образования в виде пленки (тяжей) [12]. В составе ассоциативной микрофлоры с цианобактериями присутствуют различные физиологические группы бактерий, грибов, микроводоросли. Сообщество использовалось в виде влажной и высушенной биомассы. Для постановки экспериментальных экосистем использовали стеклянные цилиндры, масса почвы, предварительно просеянной через сито 3 мм, составила в каждом из них по 5 кг, высота слоя - 15-20 см. Варианты экспериментальных экосистем: 1 -контроль (нефтезагрязненная почва); 2 - нефтезагрязненная почва и азотно-фосфорно-калийные удобрения (азофоска бесхлорная ТУ 113-03-0206486-12-99) из расчета C:N:P=10:1:1; 3 - нефтезагрязненная почва и сухая биомасса ЦБС из расчета 5г/кг почвы; 4 -
нефтезагрязненная почва и сухая биомасса ЦБС (5г/кг почвы) в комплексе с азотно-фосфорно-калийными удобрениями (азофоска бесхлорная из расчета С:№Р=10:1:1); 5 -нефтезагрязненная почва и влажная биомасса ЦБС из расчета 50г/кг почвы; 6 -нефтезагрязненная почва и влажная биомасса ЦБС (50 г/кг почвы) в комплексе с азотно-фосфорно-калийными удобрениями (азофоска бесхлорная из расчета С:№Р=10:1:1). В ходе исследований экспериментальные сосуды выдерживались при комнатной температуре, периодическом рыхлении и увлажнении (до 60% полевой влагоемкости). Наблюдение продолжалось в течение 12 месяцев.
Оценку процесса деструкции нефтяных углеводородов осуществляли по содержанию суммарных нефтепродуктов флуорометрическим методом [7] и содержанию алифатических (н-алканов) и полиароматических (ПАУ) углеводородов, концентрацию которых определяли на газовом хроматографе ОС-17Л 8НГМЛВ2и и масс-спектрометре ОР-5000 8Н1МЛБ2и [5]. Численность микроорганизмов (сапротрофных, углеводородокисляющих) определяли методом высева почвенной суспензии на агаризованные питательные среды. Разнообразие организмов в почвах экспериментальных экосистем оценивали, учитывая общее число микроскопических водорослей, число бактерий, общую длину грибного мицелия методом прямой люминесцентной микроскопии [8].
В составе н-алканов в используемой для постановки экспериментальных экосистем почве превалировали высшие члены гомологического ряда - С18-С36 (36,8 г/кг), что составило 62% от суммы определяемых н-алканов (С10-С36). Суммарное содержание полиаренов превышало ПДК для почв (0,02 мг/кг) практически в 20 раз. Преобладающе положение в составе полиаренов составляли 2-х ядерные (80,31%): 2-метил-нафтен (160,2 мкг/кг) и нафталин (112,2 мкг/кг).
Интродукция ЦБС способствовала активизации процессов биодеградации нефтяных углеводородов, о чем свидетельствовали данные по остаточному содержанию суммарных нефтяных углеводородов (СНУ) (табл.2). Максимальная убыль по истечении 12-ти месячной экспозиции отмечена в вариантах с внесением комплекса влажной биомассы ЦБС и удобрений (93,5%), а также при внесении сухой биомассы ЦБС с удобрениями (91,1%).
Убыль алифатических углеводородов в ходе 6-ти месячной экспозиции при внесении сухой и влажной биомассы ЦБС составила -98,5% и 90,9% соответственно. При внесении ЦБС в комплексе с минеральными удобрениями отмечено увеличение содержания н-алканов на 21,1% при внесении сухой биомассы ЦБС и на 5,2% - при внесении влажной биомассы ЦБС.
Таблица 2. Содержание остаточных нефтяных углеводородов (%) в ходе экспериментальных исследований: 1-контроль; 2-удобрения; 3-сухая биомасса ЦБС; 4-сухая биомасса ЦБС, удобрения; 5-влажная биомасса ЦБС; 6-влажная биомасса ЦБС, удобрения.
Вариант Продолжительность эксперимента, сутки
60 90 150 180 365
1 9,99 9,83 9,16 6,11 3,91
2 7,90 7,70 7,27 5,73 3,14
3 8,64 7,62 7,46 6,32 3,61
4 9,01 6,81 6,70 6,33 0,98
5 9,34 7,65 7,32 5,26 1,44
6 6,80 6,07 6,00 4,23 0,72
Убыль ПАУ по окончании экспериментальных исследований в модельных экосистемах во всех вариантах составила 99,63-97,29%. При этом, максимальный эффект (99,63%) отмечен в варианте с внесением влажной биомассы ЦБС и минеральных удобрений, где наблюдается убыль всех индивидуальных ПАУ.
Анализ индивидуального состава ПАУ показал, что в ходе экспериментальных исследований происходит изменение абсолютного и относительного содержания полиаренов. Наиболее интенсивно в ходе 6-ти месячной экспозиции отмечено уменьшение доли 2-х и 3-х ядерных полиаренов в варианте с внесением влажной биомассы ЦБС (2-х ядерных на - 99,63%; 3-х ядерных - 98,78%), 4-х и 5-ти ядерных - при внесении сухой биомассы ЦБС (на 34,30 и 29,21% соответственно). Кроме того, что 4-х и 5-ти ядерные медленнее подвергаются биодеградации, отмечено также увеличение доли 4-х и 5-ти ядерных в варианте с применением влажной биомассы ЦБС и удобрений, 5-ти ядерных - в варианте контрольном (табл. 3). В ходе дальнейшей экспозиции максимальный эффект снижения суммы ПАУ отмечается для варианта с внесением влажной биомассы ЦБС и удобрений (99,63%) (табл. 3). Следует отметить, что для этого варианта отмечается минимальное содержание 4-х и 5-ти ядерных в сумме ПАУ - 33,40%. Для варианта с внесением сухой биомассы ЦБС в комплексе с минеральными удобрениями данный показатель составляет 38,17%. В целом отмечено уменьшение содержания низкомолекулярных 2-х ядерных и увеличение относительного содержания 3-х, 4-х и, в меньшей степени, 5-ти ядерных полиаренов в сравнении с исходной почвой, что выражает общую тенденцию трансформации ПАУ [10].
Таблица 3. Убыль ПАУ (%) при интродукции циано-бактериальных сообществ в модельные экосистемы.
Вариант экспериментальных экосистем
ПАУ 1 2 3 4 5 6
6 мес. 12 мес 6 мес. 12 мес 6 мес. 12 мес 6 мес. 12 мес 6 мес. 12 мес 6 мес. 12 мес
2-х 99,39 99,75 98,76 99,56 99,29 99,71 96,98 99,47 99,63 99,53 96,23 99,42
ядерные
3-х 98,34 99,83 99,28 99,16 98,00 99,60 76,75 92,11 98,78 99,16 74,95 86,76
ядерные
4-х 5,58 78,51 31,05 75,48 34,30 74,63 10,45 64,81 18,41 65,01 +5,71 56,87
ядерные
5- ти +3,51 95,56 12,53 93,81 29,21 92,60 11,91 93,12 15,00 89,40 +1,38 90,05
ядерные
Сумма 95,52 99,14 96,03 97,51 96,53 98,93 90,46 97,29 96,33 98,41 88,99 99,63
В ходе исследований в течение первых шести месяцев отмечено (табл. 3) накопление 5-ти ядерных в контрольном варианте (3,5%) и 4-х (5,7%) и 5-ти (1,4%) ядерных в варианте с внесением комплекса ЦБС и удобрений, что связано, вероятно, с перераспределением веществ между компонентами смеси полиаренов в процессе микробной переработки и меньшей скоростью деструкции многоядерных ПАУ. Кроме того, полиарены, имеющие голоядерную структуру, сорбируются гумусовыми веществами почвы [2], что снижает скорость их деградации в почвах.
Численность микроорганизмов в образцах почвы, используемой при постановке эксперимента, составила: сапротрофные - 3,0х107 КОЕ/1г асв почвы,
углеводородокисляющие - 1,4х106 КОЕ/1г асв почвы (табл. 4).
Таблица 4. Динамика численности физиологических групп микроорганизмов в ходе экспериментальных исследований (КОЕ/1 г асв почвы).
Вариант Продолжительность эксперимента, сутки
1 15 30 60 90 180 365
Сапротрофные, 106 (30,0)
1 34,0 12,0 46,0 1,5 1,6 1,4 1,1
2 280,0 5,0 2,1 1,9 1,7 0,1 0,1
3 25,0 25,0 18,8 10,9 10,5 5,0 3,0
4 19,0 16,0 34,0 10,8 10,6 6,0 4,0
5 21,0 110,0 50,0 33,0 22,4 10,0 9,0
6 500,0 40,0 30,6 26,0 21,4 10,0 9,0
Углеводородокисляющие, 106 (14,0)
1 84,0 3,5 2,8 1,7 14,0 0,1 0,1
2 58,0 17,0 16,0 14,0 6,0 5,0 5,0
3 96,0 10,6 16,0 10,0 20,0 10,0 10,0
4 140,0 16,8 20,0 11,0 15,0 12,0 11,0
5 12,0 12,0 11,0 10,0 20,0 15,0 14,0
6 35,0 50,0 20,0 15,0 22,0 18,0 15,0
В ходе экспериментальных исследований установлено, что максимальная численность всех индикаторных групп микроорганизмов отмечается в вариантах с внесением как биомассы циано-бактериального сообщества, так и при внесении ЦБС в комплексе с минеральными удобрениями. Это связано с тем, что цианобактерии снабжают почву органическим веществом и усиливают микробиологическую активность почвы, оказываясь начальным звеном многих микробиологических цепей. Кроме того, цианобактерии в комплексе с бактериями становятся основой природного азотфиксирующего комплекса [13].
Оценка биомассы бактерий, грибов и микроводорослей в почвах экспериментальных экосистем на основании данных люминесцентной микроскопии (табл. 5) показывает, что добавление минеральных удобрений увеличивает численность и биомассу всех групп микроорганизмов, особенно интенсивно этот процесс проявляется в варианте с внесением ЦБС и минеральных удобрений. Кроме того, в целом, варианты модельных экосистем с применением различных приемов стимуляции характеризуются большим биологическим разнообразием в сравнении с контролем.
Таблица 5. Оценка биологического разнообразия почвенных образцов по окончании экспериментальных исследований методом люминесцентной микроскопии.
Показатель Вариант экспериментальных экосистем
1 2 3 4 5 6
Длина мицелия в 1 г почвы, м 10,00 15,00 35,0 45,0 37,0 55,0
Масса мицелия в 1 г почвы, х10-6 г 39,00 58,5 136,5 175,5 144,3 214,5
Численность бактерий в 1 1 г>10 1г почвы, х10 0,9 3,1 1,9 2,2 2,1 2,6
Масса бактерий в 1 г почвы, х10-4 г 1,8 6,1 3,2 3,7 3,5 4,9
Численность водорослей в 1 г почвы, х105 1,90 4,90 2,2 3,3 3,5 5,7
Масса водорослей в 1 г почвы, х10-6 г 11,22 28,91 13,0 19,5 20,7 33,65
Таким образом, на основании данных экспериментальных исследований установлено, что внесение циано-бактериальных сообществ в комплексе с минеральными удобрениями в нефтезагрязненные почвы способствует формированию в них наиболее сбалансированных микробиоценозов, обладающих расширенным набором биогеохимических функций и активизирующих деградацию нефтяных углеводородов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. №3-4.С.20-27.
2. Геннадиев А.Н., Козин И.С., Шурубор Е.И., Теплицкая Т.А. Динамика загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами и индикация состояния почвенных эосистем // Почвоведение. 1990. №10. С.1277-1279.
3. Гусев М.В., Линькова М.А., Коронелли Т.В. Влияние нефтяных углеводородов на жизнеспособность цианобактерий в ассоциации с нефтеокисляющими бактериями // Микробиология. 1982. Т.51. Вып.6. С.932-936.
4. Дзержинская И.С. Альго-бактериальные аспекты интенсификации биогидрохимического круговорота в техногенных экосистемах. - Автореф. дис... докт. биолог. наук. - М.: Изд-во МГУ. 1993.
5. Другов Ю.С., Родин А.А. Газохроматографическая идентификация загрязнений воздуха, воды и почвы. Практическое руководство. С-Пб.: Теза, 1999.
6. Кабиров Р.Р., Минибаев Р.Г. Влияние нефти на почвенные водоросли // Почвоведение. 1982. №1.С.86-91.
7. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах флюориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». ПНД Ф 16.1.21-98. Госкомитет РФ по охране окружающей среды. М. 1998.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред.Звягинцева Д.Г. М.: Изд-во МГУ. 1991.304с.
9. Миронов О.Г. Развитие планктонных водорослей в условиях нефтяного загрязнения // Человек и биосфера. М.: Изд-во МГУ. 1980. №5.
10. Немировская И.А. Углеводороды в океане (снег-лед-вода-взвесь-донные осадки). Автореферат дисс.....докт. биол. наук. М. 2000. 40с.
11. Сопрунова О.Б. Альгобактериальные сообщества водной техногенной системы (на примере очистных сооружений АГПЗ) Автореф. дис.......к.б.н. -Астрахань, 1997.
12. Сопрунова О.Б. Циано-бактериальные консорциумы в очистке сточных вод // Электронный журнал "Исследовано в России".2005. №11. с.113-120. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2005/011.pdf.
13. Штина Э.А., Неганова Л.Б., Третьякова А.Н. Роль азотфиксирующих водорослей в зарастании промышленных отвалов / В кн.: Рекультивация в Сибири и на Урале. Новосибирск: Наука 1970. С.117-124.
14. Янкевич М.И. Формирование ремедиационных биоценозов для снижения антропогенной нагрузки на водные и почвенные экосистемы. - Автореф. дис.. ..д.б.н.-Щелково, 2002. 48с.
