CC BY
87
СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 32008 (выпуск 1)
ЛАБОРАТОРНЫЕ И
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 612.017.1:616-022 А.В. Дубов
E-mail: [email protected]
ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРИ ТРАНСМИССИВНЫХ ПАНТРОПНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ
Гу нии медицинских проблем севера сО рАМн, г красноярск
ВВЕДЕНИЕ
Доказан пантропный характер репродукции вирусов семейства Todaviridae, передающихся человеку при нападении на него инфицированных клещей и комаров [1]. Установлено две фазы репродукции вирусов: экстраневральная, т.е. до проникновения в органы и ткани центральной нервной системы (ЦНС) и цереброспинальная после преодоления гематоэн-цефалического барьера. Эпизоотическая цепь трансмиссивных вирусных инфекций поддерживается длительностью и напряженностью вирусемии [2]. Эффективность вакцинопрофилактики заболеваний, вызываемых вирусом желтой лихорадки, обеспечивается высокоэффективными живыми вакцинами. Показана также достаточно высокая эпидемическая эффективность инактивированных культуральных вакцин клещевого энцефалита (КЭ), особенно в западных очагах ареала распространения инфекции [3-7]. Однако среди привитых регистрируются заболевания КЭ в основном с более легким клиническим течением, что свидетельствует о проникновении вируса в органы ЦНС через гематоэнцефалический барьер. в отдельных случаях у вакцинированных людей, которые перенесли апаралитическую форму КЭ или вовсе не болели через полгода, год и более после инфицирования вирусом КЭ, выявляются хронические формы КЭ с медленным течением: полиомие-литическая, кожевниковская эпилепсия, синдром амиотрофического бокового склероза [1, 8, 9].
Нами выдвинута и развивается концепция об общем, барьерном (гематоэнцефалический, плацентар-44
ный, последовый и др. барьеры) и забарьерном (в частности, цереброспинальном) специфическом иммунитете при пантропных вирусных инфекциях [2, 10, 11]. Общий иммунитет формируется при естественной иммунизации или вакцинации вне ЦНС и препятствует распространению возбудителей инфекционных заболеваний до гистогематического (гемато-энцефалического) барьера, но не защищает органы-мишени. Цереброспинальный иммунитет развивается только после проникновения вируса или вирусного антигена в органы и ткани ЦНС.
Эффективность специфической профилактики КЭ базируется на антигенной и иммуногенной активности специфических противовирусных вакцин, способности распространения популяций дикого вируса от места внедрения до органов ЦНС, интенсивности его репродукции в экстраневральной системе, проникновении через гематоэнцефалический барьер, тропности к нервной ткани [12, 13].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
в опытах использованы белые мыши BALB/C с весом 8-10 г, полученные из питомника Раполово Ленинградской области, взрослые обезьяны Macacus rhesus, доставленные самолетом из индии и прошедшие карантин и адаптацию в условиях вивария лаборатории вирусологии не менее 30 дней. индикацию и титрование вируса проводили на мышах при интраце-ребральном заражении. использовали высоковирулентные штаммы вируса КЭ (Софьин, Пан и Абсетта-ров) и естественно ослабленный штамм Еланцев (клон 15-20/3). иммунизация осуществлялась инактиви-рованной вакциной производства института полиомиелитов и вирусных энцефалитов им.М.П.чумако-ва РАМН и/или естественно ослабленным штаммом Еланцев (клон 15-20/3), который вводили в концентрации 4,0-4,4 lg LDS0 обезьянам или подкожно, или в головной мозг (левый зрительный бугор). через 1-2 месяца после иммунизации животным вводили вновь в левый зрительный бугор вирулентные штаммы или Софьин (5,7-7,8 lg LDS0), или Пан (6,7-7,7 lg LD50), или Абсеттаров (3,9-8,0 lg LD50).
РЕЗУЛЬТАТЫ
в экспериментах на мышах линии BALB/C с высоковирулентными штаммами вируса КЭ (Софьин, Пан, Абсеттаров и др.) нами получены результаты, совпадающие с характеристикой подобных штаммов [2]. Так, при подкожном заражении мышей уже на третьи сутки количество вируса в мозгу животных достигало 3,5 lg LD50/0,0. Первые трое суток количество вируса во внутренних органах было выше, чем в мозгу. Наибольшая концентрация вируса во внутренних органах крови наблюдалась к моменту развития клинических симптомов у мышей (5-е сутки после заражения). К моменту гибели животных (7-е сутки после заражения) происходило заметное снижение концентрации вируса во внутренних органах и кро-
ви, а в головном мозге его количество резко возрастало с 5,5 до 7,2 ^ LD50/0,03 мл (табл. 1). во все сроки наблюдения виремия оставалась напряженной. Кривая содержания вируса в крови соответствовала таковой в органах, богатых рети-кулоэндотелиальными клетками.
Динамика накопления и распределения естественно ослабленного штамма Еланцев (клон 15-20/3) в организме подкожно зараженных белых мышей линии BALB/C имела свои особенности. через сутки после заражения вирус определился, кроме головного мозга, во всех исследуемых внутренних органах и тканях белых мышей. Наибольшее его количество удавалось изолировать из органов, богатых ретикулоэндотелиальными элементами: селезенка, лимфоузлы (табл. 2).
На третьи сутки после заражения вирус определялся во всех исследуемых органах и тканях. Причем в головном мозге его было гораздо меньше, чем во внутренних органах. Даже на 5-е сутки после заражения количество вируса в головном мозге было у штамма Еланцев в 100 раз меньше, чем в этот же период у штамма Абсеттаров. На 9-12 сутки у выживших мышей наблюдалось существенное снижение концентрации вируса как в ЦНС, так и в экстраневральных органах.
Проведено изучение динамики распространения и накопления вируса КЭ на мышах BALB/C, привитых инактивиро-ванной вакциной и естественно ослабленным штаммом Еланцев (клон 15-20/3) в различных схемах опытов.
а) Двукратная иммунизация инакти-вированной вакциной в/брюшинно с интервалом 7-8 дней, затем введение подкожно через 14-15 дней вирулентного штамма Софьин, Пан, Абсеттаров и др. (табл. 3).
Накопление вирулентного вируса у привитых 2-кратно инактивированной вакциной существенно отличалось от неиммунизиро-ванных. Однако вирулентный вирус проникал в головной мозг животных и длительно репродуцировался и персистировал.
б) Двукратная иммунизация мышей линии BALB/ C инактивированной вакциной внутрибрюшинно с интервалом 7-8 дней, затем через 14-15 дней заражение подкожно 10000 LD50/мл естественно ослабленным штаммом Еланцев (табл. 4).
Таблица 1
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в различных органах и тканях белых мышей линии BALB/C, зараженных подкожно высоковирулентными штаммами Абсеттаров вируса КЭ
Наименование органа, ткани Дни после заражения
1 3 5 7
Кол-во вируса в ^ LD50/0,03 мл
Мозг 1,0 3,5 5,5 7,2
Селезенка 2,5 4,5 4,0 2,5
Лимфоузлы 3,5 3,5 4,5 3,6
Печень 2,5 2,5 4,0 1,7
Кишечник 2,5 2,0 4,0 1,5
Подкожная клетчатка 2,5 3,5 2,3 3,2
Кровь 3,0 4,0 4,2 2,3
Таблица 2
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в различных органах и тканях белых мышей, зараженных подкожно штаммом Еланцев вируса КЭ
Наименова-ние органа, ткани Дни после заражения
13 5 7 9 12
Кол-во вируса в ^ LD50/0,03 мл
Мозг 0 0,7 3,0 5,3 3,8 2,2
Селезенка 1,6 1,2 2,3 1,5 1,0 0,7
Лимфоузлы 2,2 2,2 2,5 3,2 2,7 1,9
Печень 1,5 1,2 1,0 1,2 0,7 0
Кишечник 1,2 1,5 1,0 2,5 1,2 0,9
Подкожная клетчатка 0,7 1,7 1,2 0 0 0
Кровь 1,5 1,7 1,7 0,7 0,7 0,7
Таблица 3
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в различных органах и тканях белых мышей BALB/C, двукратно привитых инактивированной вакциной и зараженных подкожно 10000 LD50/мл вирулентным вирусом штамм Абсеттаров
Наименование Дни после заражения
органа, ткани 1 3 5 7 9 12 15 30
Количество вируса в ^ LD50/0,03 мл
Мозг 0 0 1,9 2,7 1,9 2,2 1,4 1,7
Селезенка 0,7 1,2 1,6 1,0 1,0 0 0,7 0
Лимфоузлы 1,9 2,2 2,0 1,6 0,7 0,7 0 0,7
Печень 1,0 0,7 0 0 0 0 0 0
Кишечник 0,7 1,2 0,7 0 0 0 0 0
Подкожная клетчатка 0,7 1,2 0,7 0 0 0 0 0
Кровь 1,1 1,4 0 0 0 0 0 0
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в различных органах и тканях белых мышей BALB/C, двукратно привитых инактивированной вакциной и зараженных подкожно естественно ослабленным штаммом Еланцев
Наименование органа, ткани Дни после заражения
1 3 5 7 9 12 15 30
Количество вируса в lg LD50/0,03 мл
Мозг 0 0 0 0 0,7 0 0 0
Селезенка 1,2 0,7 0 0,9 0 0 0 0
Лимфоузлы 1,7 1,9 1,7 0 0 0,7 0 0
Печень 1,2 0 0 0 0 0 0 0
Кишечник 1,2 0 0 0 0 0 0 0
Подкожная клетчатка 0 0,7 0,7 0 0 0 0 0
Кровь 0,7 0,9 0 0,7 0 0 0 0
При многократных постановках опыта весьма редко выявляли проникновение естественно ослабленного штамма Еланцев в мозг мышей преимущественно на 9-й день после введения его подкожно. Репродукции вируса не выявлено в течение 30 дней наблюдения.
В опытах на обезьянах Macacus rhesus при экстра-невральном заражении (подкожно, внутривенно) как естественно ослабленным штаммом Еланцев, так и высоковирулентными Софьин или Пан, или Абсеттаров
Таблица 5
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в организме зараженных внутривенно обезьян штаммом Софьина вируса КЭ (в lg LD50)
Таблица 4 заболеваний зарегистрировано не было, однако высоковирулентные штаммы активно репродуцировались во внутренних органах, проникали в органы ЦНС, где отмечалась их длительная персистенция (табл. 5).
У обезьян, зараженных экстраневрально большими концентрациями естественно ослабленного штамма Еланцев (4,0-7,7 ^ LD50/мл), проникновения вируса в органы ЦНС не обнаружено (табл. 6).
Экстраневральное заражение (иммунизация) обезьян как высоковирулентными штаммами вируса КЭ, так и естественно ослабленным приводило к интенсивной продукции специфических вируснейтрализующих и антигемаг-глютинирующих антител. Однако повторное заражение обезьян в головной мозг вирулентными штаммами вируса КЭ не предохранило от развития смертельного энцефалита на 7-й-10-й день после заражения.
При первичном заражении животных в левый зрительный бугор штаммом Абсеттаров, Пан или Софьин развивался тяжелый панэн-цефалит с гибелью обезьян на 7-й-10-й день при интенсивной репродукции вируса в различных органах ЦНС (табл. 7).
У обезьян, вскрытых на 3, 8, 15 и 30-й дни после внутримозгового заражения штаммом Еланцев, установлена весьма слабая репродукция его в органах ЦНС (табл. 8).
Все обезьяны, однократно иммунизированные в левый зрительный бугор естественно ослабленным
Таблица 6
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в организме зараженных внутривенно обезьян штаммом Еланцев вируса КЭ (в ^ LD50)
Наименование органа, ткани Дни после заражения
1 8 15 30 60 90
Кора головного мозга 1,2 2,2 1,0 0,9 0 0,7
Подкорковые узлы 1,4 2,2 1,3 1,1 0,9 0,9
3-й желудочек 1,0 1,8 1,1 0,7 0 0
Варолиев мост 0 1,9 1,3 0 0 0
Шейный 1,1 1,9 0,7 0,9 0,7 0,7
Грудной 1,3 2,4 1,4 1,3 0,9 0,9
Поясничный 1,0 1,5 1,3 1,3 1,1 0,6
Печень 1,4 2,0 0,9 0 0 0
Кишечник 1,1 1,3 0,7 0 0 0
Селезенка 2,0 2,8 1,9 1,1 1,3 0,7
Лимфоузлы 1,5 2,2 1,6 1,1 0 0,5
Кровь 0,5 0,9 0,7 0 0,7 0
Наименование Дни после заражения
органа, ткани 1 8 15 30 60 90
Кора головного мозга 0 0 0 0 0 0
Подкорковые узлы 0 0 0 0 0 0
3-й желудочек 0 0 0 0 0 0
Варолиев мост 0 0 0 0 0 0
Шейный 0 0 0 0 0 0
Грудной 0 0 0 0 0 0
Поясничный 0 0 0 0 0 0
Печень 0,7 0,9 0,5 0 0 0
Кишечник 0 0,7 0 0 0 0
Селезенка 1,5 1,9 1,1 0 0 0
Лимфоузлы 1,2 1,6 0,7 0 0 0
Кровь 0,5 0,7 0,7 0,7 0 0
штаммом Еланцев и затем через 1-2 месяца и более зараженные в головной мозг большими концентрациями высоковирулентных вирусов КЭ, не заболевали в течение 30 дней наблюдения и более.
У животных, иммунизированных в головной мозг
Таблица 7
Количество вируса в ^ LD5o/мл на высоте клинических проявлений на 7-й день после заражения обезьян в левый зрительный бугор штаммами (M±m)
штаммом Еланцев и затем повторно зараженных штаммами Софьин, Пан или Абсеттаров на 8, 15 и 30-й дни после заражения вирулентными штаммами, не были выделены из органов ЦНС и внутренних органов ни ослабленный, ни вирулентные вирусы КЭ.
У обезьян Macacus rhesus, иммунизированных в головной мозг (левый зрительный бугор) инактивиро-ванной вакциной против клещевого энцефалита или естественно ослабленным штаммом Еланцев, вокруг капилляров и прекапилляров возникает пролиферация перицитов с формированием периваскулярных муфт. Клетки располагаются в несколько рядов, образуя скопления, четко ограниченные от окружающей ткани мозга. В них отчетливо выступают фигуры митоза. В составе периваскулярных муфт, наряду с крупными клетками ретикулярного типа с рыхлой цитоплазмой, ядром и пироцитофильным ядрышком, встречаются клетки лимфогистоцитарного характера, плазмобласты и «зрелые» плазматические клетки.
Весьма сходные морфологические образования наблюдаются в лимфатических узлах уже в первые десять дней после экстраневральной иммунизации обезьян. Обнаруживаются плазматические клетки переходного типа, наблюдающиеся в макотных шнурах. Это крупные полигональные клетки с пиронинофиль-ной цитоплазмой, светлым ядром овальной формы с базофильным ядрышком, возникшие в результате трансформации ретикулярных клеток. В более поздние сроки наблюдений (30-е-54-е сутки после введения вируса клещевого энцефалита) в корковом и мозговом слоях лимфатических узлов, наряду с плаз-мобластами, обнаруживаются зрелые плазматические
Наименование органов, тканей Софьин Пан Абсетторов
Кора головного мозга 4,6±0,16 5,1±0,30 4,25±0,18
Подкорковые узлы 4,7±0,13 4,8±0,19 4,45±0,25
3-й желудочек 4,4±0,41 4,2±0,38 4,00±0,60
Варолиев мост 3,2±0,27 3,8±0,24 3,6±0,35
Шейный 4,2±0,25 3,7±0,21 3,9±0,40
Грудной 4,8±0,11 4,5±0,36 4,5±0,10
Поясничный 3,9±0,24 3,5±0,13 4,25±0,18
Печень 1,2±0,12 1,8±0,19 1,6±0,5
Селезенка 1,7±0,14 1,5±0,24 1,5±0,15
Кишечник 0,8±0,11 1,3±0,17 1,25±0,2
Лимфоузлы 1,2±0,13 1,4±0,13 1,1±0,25
Кровь 0,5±0,10 0,7±0,08 0,85±0,12
Таблица 8
Результаты многодневных наблюдений накопления вируса в организме зараженных в левый зрительный бугор обезьян штаммом Еланцев (клон 15-20/3) вируса КЭ (в lgLD5o)
Наименование органа, ткани Дни после заражения
3 8 15 30
Номер обезьяны (опыта)
11 12 15 16 17 18 41 45 46 47 58
Кора головного мозга 0 1,2 0 0,7 0,5 0 0 0 0 0 0
Подкорковые узлы 0 0 0 0 0 0,7 0 0,7 0,7 0 0
3-й желудочек 0 0 0 0,7 0,7 0 0 0 0 0 0
Варолиев мост 0 0 0 0 0 0 0 0 0,7 0 0
Оливы 0,7 0 0,7 0 0,5 0,7 0 0 0,7 0,7 0
Кора мозжечка 0,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0,7 0
Спинной мозг 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Шейный 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Грудной 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Поясничный 0 0 0,7 0 0 0,7 0 0 0 0 0
Печень 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Селезенка 0 0 0 0 0 0 0 0,7 0 0 0
Кишечник 0 0,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Лимфоузлы 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
клетки. Последние в отдельных случаях в большом количестве залегали в макотных шнурах, вытесняя лимфоидную ткань. В синусах и реактивных центрах фолликулов часто выявлялись свободные макрофаги [14].
Таким образом, нами показано, что морфология иммунитета в периферических лимфатических узлах весьма сходна с таковой в ЦНС в результате образования при инфекционном процессе периваскулярных муфт. Это дает основание предполагать, что перивас-кулярные муфты в ЦНС выполняют роль морфофунк-ционального лимфатического узла.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
выявлено два самостоятельных вида формирования иммунитета при нейротропной вирусной инфекции: общий (экстраневральный) и за гематоэн-цефалическим барьером (цереброспинальный). Оба иммунитета развиваются независимо и лишь после проникновения в органы-мишени вируса или вирусного антигена. Общий иммунитет лишь приводит к снижению репродуктивной активности вирулентных популяций вируса, но не обеспечивает его полную элиминацию в органах ЦНС, что создает условия для персистенции вируса, заканчивающейся в отдельных случаях развитием хронических или медленных форм заболевания.
Экстраневральный общий иммунитет, индуцированный инактивированной вакциной против КЭ, не обеспечивает надежную блокаду вирулентных популяций вируса в экстраневральной системе и не прерывает его распространение через гематоэнцефали-тический барьер, что приводит к развитию персис-тенции вируса в органах и тканях ЦНС с формированием в отдельных случаях хронического и медленно текущего КЭ.
В то же время иммунитет, индуцированный инак-тивированной вакциной, является достаточным для блокады пути распространения естественно ослабленных вирусов из экстраневральной системы в органы и ткани ЦНС. На фоне грундиммунитета, созданного инактивированной вакциной, при дальнейшем введении живой вакцины обеспечивается надежная защита от вирулентных популяций вируса КЭ. В связи с этим вновь возникает необходимость вернуться к сочетанной вакцинации с созданием грундиммуните-та инактивированной вакциной с заключительной иммунизацией безопасной, но высоко иммуногенной живой вакциной против КЭ, которая надежно защищает не только от западных и восточных генотипов вируса КЭ, но и от возбудителей комплекса КЭ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Смородинцев А.А., Дубов А.В. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. - М. - Л., 1986. - 231 с.
2. Dubov A.V. Common and cerebrospinal immunity in pantropic virus infections. - European Jornal of Natural History. -2008, № 1. - P. 5-11.
3. Воробьева М.С., Расщепкина М.Н. История создания и развития производства вакцины клещевого энцефалита в России и за рубежом // The Far Eastern Journal of Infections Pathology. - 2007. - № 11. - P. 21-27.
4. Злобин В.И. Эпидемическая обстановка и проблемы борьбы с клещевым энцефалитом в Российской Федерации // Бюл.сиб.мед. - 2006. - Т. 5. - Прил. 1. - С. 16-23.
5. Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Крылова Н.В. Вакцино-профилактика клещевого энцефалита. - владивосток, 2006. - 100 с.
6. Barret P.N., Schoba-Bendixen S., Erlich H.J. History of TBE vaccine // Vaccine 21. - 2003. - S1/41-S1/49.
7. Kunz C. TBE vaccination and Austrian experience // Vaccine 21. - 2003 - S1/50-S1/55.
8. Куимов Д.Т., Дубов А.В. Амиотрофический боковой склероз как синдром клещевого энцефалита // Журн. невропатол. и психиатрии. - 1958. - № 3. -С. 282-287.
9. Шаповал А.Н. Хронические формы клещевого энцефалита. - Ленинград: Медицина, 1978. - 176 с.
10. Дубов А.В. Иммунопрофилактика: общий и цереброспинальный иммунитет // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - № 2. - Т. 19. - С. 56-57.
11. Дубов А.В. Забарьерный цереброспинальный иммунитет при клещевом энцефалите / The Far Eastern Journal of Infections Pathology. - 2007. - № 11. - P. 132.
12. Дубов А.В. Общий и цереброспинальный иммунитет в генезе вакцинального процесса // Мат-лы конф. « Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири. - Красноярск, 2007. - Вып. 6. - С. 99-100.
13. Timofeev A.V., Karganova J.J. Tick-borne Encephalitis Vaccine: from Past to Future. - M., 2003.
14. Гирс Б.К., Григорьева Л.В., Кошуков С.Д., Дубов А.В. Патоморфологические изменения в сосудах центральной нервной системы обезьян при интрацеребральном введении различных штаммов вируса клещевого энцефалита. - Тюмень, 1971. - С. 102-107. ©
CEREBROSPINAL IMMUNITY IN TRANSMISSION PANTROPIC VIRAL INFECTIONS
A.V. Doubov
SUMMARY
We further developed the hypothesis concerning common and transbarrier (hystohematic barriers) ce-rebrospinal immunity in transmission pantropic viral infections. Common humoral and cellular immunity is establish not to exclude the possibility of penetrating virulent neurotrophic viruses such as tick-borne encephalitis pathogen through hematoencephalic barrier and developing acute viral infection or viral persistence with the formation of chronic or slow infection process. This fact should be taken into account while prevention of the tick-borne encephalitis by specific inactivated vaccines.
Key words: cerebrospinal immunity, transmissive pantrophic viral infections.
