CC BY
24
УДК 631.466:579.22
В. П. Патика
доктор бюл. наук, професор 1нститут мшробюлогм i вiрусолопT iM. Д.К. Заболотного НАН УкраТни secretar@serv.imv.kiev.ua
£. П. Копилов
доктор бiол. наук, професор 1нституту альськогосподарськоТ мшробюлогп та агропромислового виробництва НААН
О. В. Скуловатов
астрант
1нституту альськогосподарськоТ мшробюлогм та агропромислового виробництва НААН
ЦЕЛЮЛОЗОЛ1ТИЧНА АКТИВН1СТЬ ГРУНТОВОГО ГРИБА СИ.AETOMIUM GLOBOSUM I
Анотащя. Показано, що природн/й штам фунтового гриба Chaetomium globosum Kunze ex Fr. 377 e активним целюлозолтичним м/кроорган/змом. Максимально показники целюлазноi активност гриба були заф/ксован/ на 1418 добу культивування. Загальна целюлозолтична активность С. globosum 377 складае 0,223, ендоглюканазна -0,281, екзоглюканазна - 0,252 IU/ml (при культивуваннi на середовищi з фльтрувальним папером), в-глюкозидазна активность була вища при культивуваннi на пшеничной солом'о i становила 0,192 IU/ml. Температура 25-30°С i рН 5,0 поживного середовища е оптимальними для продукування целюлозолтичних ферментв.
Ключов'1 слова: загальна целюлозолтична активность, ендоглюканазна актив^сть, екзоглюканазна актив^сть, в-глюкозидазна актив^сть, Chaetomium globosum.
В. Ф. Патыка
доктор биологических наук, профессор
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины Е. П. Копылов
доктор биологических наук, профессор
Институт сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН О.В. Скуловатов
аспирант
Институт сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН ЦЕЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЕНОГО ГРИБА CHAETOMIUM GLOBOSUM
Аннотация. Показано, что естественный штамм почвенного гриба Chaetomium globosum Kunze ex Fr. 377 является активным целлюлозолитическим микроорганизмом. Максимальные показатели целюлазнои активности гриба были зафиксированы на 14-18 сутки культивирования. Общая целлюлозолитическая активность С. globosum 377 составляет 0,223, ендоглюканазная - 0,281, екзоглюканазная - 0,252 IU/ml (при культивировании на среде с фильтровальной бумагой), в-глюкозидазная активность была выше при культивировании на пшеничной соломе и составила 0,192 IU/ml. Температура 25-30 °С и рН 5,0 питательной среды являются оптимальными для выработки целлюлозолитических ферментов.
Ключевые слова: общая целлюлозолитическая активность, ендоглюканазная активность, екзоглюканазная активность, в-глюкозидазная активность, Chaetomium globosum.
V. F. Patyka
Doctor of Biological Sciences
D.K. Zabolotny Institute of Microbiology and Viriology of NAS of Ukraine
E. P. Kopylov
Doctor of Biological Sciences
Institute of Agricultural Microbiology and Agroindustrial Production NAAS of Ukraine О. V. Skulovatov
Postgraduate Student
Institute of Agricultural Microbiology and Agroindustrial Production NAAS of Ukraine CELLULOLYTIC ACTIVITY OF SOIL FUNGI CHAETOMIUM GLOBOSUM
Abstract. The maximum total cellulolytic activity of soil fungi Chaetomium globosum Kunze ex Fr. 377 was 0.223 IU/ml, endoglucanase 0.281 IU/ml, exoglucanase 0.252 IU/ml (when cultivated in an environment with filter paper), р-glucosidase activity was higher when cultivated on wheat straw and amounted to 0.192 IU/ml. Maximum cellulase activity was observed at 14-18 days of cultivation. A temperature of 25-30°C and a pH of 5.0 is an optimal nutrient environment to produce cellulolytic enzymes.
Keywords: total cellulolytic activity, endoglucanase activity, exoglucanase activity, р-glucosidase activity, Chaetomium globosum.
№1, 2016 В1СНИК УМАНСЬКОГО НАЦЮНАЛЬНОГО УН1ВЕРСИТЕТУ САД1ВНИЦТВА
Постановка проблеми. Пошук eK0H0Mi4H0 виправ-даних та ефективних методiв ут/^зацп рослинних решток з високим вмютом целюлози - актуальна наукова проблема. Одним з перспективних шляхiв 'i'i вирiшення е використання мiкроорганiзмiв з високою целюлозолiтич-ною актившстю.
Аналiз ocTaHHix дослiджень i публшацш. За до-помогою сучасних бiотехнологiчних методiв, таких як генна iнженерiя та цiлеспрямований мутагенез, вдалось отримати продуценти дуже активних целюлазних фер-ментних комплексiв [5]. Штами, що видiленi з природних субстратiв, як правило, характеризуются меншою целю-лозолiтичною активнiстю, але е бiльш адаптованими до юнування в навколишньому середовищ^ потенцiйно екологiчно-безпечними i конкурентоспроможними щодо аборигенно''' мiкрофлори. Вони можуть культивуватися безпосередньо на субстрат^ що е технолопчно простiшим, а отже - економiчно дешевшим процесом. Тому пошук нових природних мiкроорганiзмiв деструкторiв рослинних решток, залишаеться актуальним.
Ключова роль у перетворенш целюлози у Грунт нале-жить мiкроскопiчним грибам. Особливе м^це займають представники роду Chaetomium Kunze завдяки 'х здат-носп активно продукувати целюлозолiтичнi ферменти та високш конкурентоспроможнiстю по вiдношенню до шших мiкроорганiзмiв. Нами видiлено природнш штам Chaetomium globosum Kunze ex Fr. 377, який швидко розвиваеться i активно спороносить на пшеничнш соломi [11], а також характеризуеться стшюстю до зимогенно' мiкрофлори грунту [7].
Метою дослiджень представлено' роботи е оцшка целюлозолiтичноí активностi зазначеного штаму.
Методика дослiджень. Об'ектом дослщження був штам С. globosum 377 з колекцп корисних Грунтових мiкроорганiзмiв 1нституту сiльськогосподарськоí мкро-бiологií та агропромислового виробництва НААН.
Збер^аеться культура C. globosum 377 на середовищi сусловий агар (4-5% сухих речовин) [4].
Культивували гриб за 26°С на рщкому середовищi Гетчiнсона (K2HPO4 - 1,0, MgSO4^7H2O - 0,3, CaCl2 - 0,1, FeSO4 - 0,01, NaCl - 0,1, (NH4)2HPO4 - 2,0 г/л), де единим джерелом вуглецю був фшьтрувальний патр (Фiльтрак. ГДР) 8,0 г/л або подрiбнена (0,3-1,0 см) солома пшениц яро' 25,0 г/л (що за вм^ом целюлози еквiвалентно 8,0 г/л фшьтрувального паперу). Розчином 10% HCl доводили значення pH до 7,0 [4, 11]. Супернатант отри-мували шляхом центрифугування культурально' рщини (5000 g) 25 хв.
Вимiрювання целюлозолiтичноí активностi проводили з штервалом в чотири днi протягом 3-х тижшв культи-вування.
Для визначення загально' целюлозолiтичноí активностi до 50 мг фшьтрувального паперу («Фшьтрак») додавали 1 мл супернатанту, 1 мл 0,05 М натрiй-цитратного буфера та шкубували протягом 1 год (Т = 40°С).
Для визначення екзоглюканазно' активнiстi до 50 мг авщелу (мiкрокристалiчна целюлоза, «Евалар») додавали 1 мл супернатанту, 1 мл 0,05 М натрш-цитратного буфера та шкубували протягом 1 год (Т=40°С).
Ендоглюканазу актившсть визначали дiею фермента на Na-карбокисметилцелюлазу («Sigma»): 1 мл 0,5%-го розчину Na-КМЦ в 0,05 М натрш-цитратному буферi та 1 мл супернатанту шкубували протягом 30 хв (Т = 40°С).
Для визначення ß-глюкозидазно' (целобiазноí) актив-ностi до 1 мл 0,025%-го розчину целобюзи («Merck») в 0,05 М натрш-цитратному буферi додавали 1 мл супернатанту та шкубували протягом 30 хв (Т = 40°С).
Дослщження проводилось вщповщно до методик та рекомендацш IUPAC [6, 10]. Кiлькiсть редукуючих цу^в визначали за методом ШомодЬНельсона в перерахунку на глюкозу [4]. Кшьюсть глюкози для встановлення ß-глюкозидазно' активностi встановлювали глюкозо-пероксидазиним методом.
Актившсть целюлозолiтичних ферментiв виражали в мiжнародних одиницях (IU), якi вщповщають такiй
кiлькостi ферменту, що каталiзуe утворення 1 мкмоль редукуючих цу^в (або 1 мкмоль глюкози для визначення |3-глюкозидазно''' активностi) за 1хв iнкубування.
Питома целюлозолiтична актившсть (IU/mg) вказуе на загальну целюлозолiтичну активнiсть такого об'ему культурально''' рщини, де мiститься 1 мг протешу [6, 10]. Концентраця бiлку в культуральному фшьтрак визначалась спектрофотометричним методом (СФ-46, Росiя) [8]. Водневий показник живильного середовища визначались за допомогою аналiзатора iонiв А1-123 (Укра'на).
Визначали вплив реакцп середовища на загальну целюлозолiтичну активнiсть в дiапазонi вщ 4 до 8 рН, з кроком 0,5, за використання 10%-х розчишв HCl або NaOH.
Для визначення впливу температури на загальну целюлозолiтичну актившсть гриб культивували в термостат протягом 6 дiб за температурi вiд 15 °С до 35 °С з кроком 5 °С, початкова реакцiя середовища була нейтральна.
Дослщи проводились в 3-кратнш повторностi, ста-тистичну обробку отриманих результатв здiйснювали вiдповiдно до загальноприйнятих методiв [2], з вико-ристанням програми Microsoft Excel [3].
Основш результати дослiдження. Як вiдомо, ак-тивнiсть целюлазного ферментного комплексу м^ро-органiзму значною мiрою залежить вщ целюлозовмiсного субстрату, перiоду культивування та фiзiологiчних особ-ливостей штаму [14].
Найвищi показники екзоглюканазно' активностi (рис. 1) спостер^ались на 18 добу при культивуванш як на фшьтрувальному паперi, так i на пшеничнш соло-мi, i складали 0,252 та 0,223 IU/ml вiдповiдно.
Можливють активно продукувати екзоглюканазу вказуе на високий целюлозолiтичний потенцiал C. globosum 377 i його здатшсгь гiдролiзувати кристалiчнi форми целюлози, хоча для бшьшост грибiв характерною е здатшсгь розкладати лише аморфну целюлозу [1].
В бшьшосп випадюв ендоглюканаза е найактивнiшою складовою ферментного комплексу, вона забезпечуе розклад аморфних форм целюлози до целобюзи [1]. При культивуванш C. globosum 377 на середовищi з фшьтрувальним папером максимальна екзоглюканазна актившсть спостер^алась на 14 добу культивування i становила 0,281 IU/ml, максимум ендоглюконазноТ активност на пшеничнш соломi вщзначали на 18 добу -0,233 IU/ml.
Ендоглюканаза i екзоглюканаза забезпечують пер-винний етап розкладу целюлози. Одним з продукпв ÏÏ деградацiï е целобiоза, яка тд дiею ферменту р-глю-козидази гiдролiзуеться до глюкози. На вiдмiну вщ ендо- i екзоглюканазноï активностi, р-глюкозидазна активнiсть C. globosum 377 була вища при культивуваннi на середо-вищi з пшеничною соломою, шж на фiльтрувальному паперi. Максимальне значення р-глюкозидазно' актив-ностi C. globosum 377 спостер^алось на 18 добу i ста-новило 0,192 IU/ml. Як вщомо з лiтературних джерел, це явище притаманне для багатьох штамiв мiкроорганiзмiв [12].
1нтегральною оцiнкою целюлазного комплексу е за-гальна целюлазна актившсть. Вона визначаеться за здат-шстю ферментного комплексу розкладати фшьтрувальний патр. Даш експерименту свщчать, що найвища загальна целюлазна актившсть C. globosum 377 реестру-валась на 14 i 18 добу культивування на фшьтрувальному папер^ що складало 0,223 i 0,219 IU/ml вщповщно, а максимальне значення при вирощуванш на пшеничнш соломi становило 0,199 IU/ml.
Питома целюлозолiтична актившсть характеризуе загальну целюлозолiтичну актившсть такого об'ему культурально''' рщини в якiй мiститься 1 мг бшку. Даний показник C. globosum 377 при культивуванш на фшьтрувальному паперi був вищий, шж на пшеничнiй соломi протягом всього перюду росту гриба (рис. 2).
№1, 2016
В1СНИК УМАНСЬКОГО НАЦ1ОНАЛЬНОГО УН1ВЕРСИТЕТУ САД1ВНИЦТВА 28
б 10 14 18
Час кульшвування, доба
0.4
— 0.3
б 10 14 18
Час кульшвування, доба
0,3
S 0,2
Л.........
0,3
= 0,2
■ фшырувальний па nip
I'
30,1
0
2 б 10 14 18 22 2 6 10 14 18 22
Час культавування, доба Час кульшвування, доба
Рис. 1. Динамша екзоглюканазнсн (а), ендоглюканазнсн (Ь), З-глюкозидазнсн (с) та загальноУ целюлазноУ активност (d) гриба С. globosum 377
10 14
Час кульшвування, доба Рис. 2. Динамка питомоУ целюлазноУ активностi С. globosum 377
Максимальне значення питомоТ целюлозол1тичноТ активност1 у вар1ант1 з ф1льтрувальним папером спосте-р1галось на 14 добу (1,10 IU/ml), а у вар1ант1 з пшеничною соломою - на 2 i 18 добу культивування.
Важливим критер1ем, що дозволяе оц1нити можлив1с-ть практичного застосування м1кроорган1зму, е вплив температури культивування i рН середовища на активн1сть б1осинтезу ним екзофермент1в. Ран1ше нами встановлено, що C. globosum 377 може рости на сусловому агар1 в температурному штервал1 в1д 14°C до 35°C та при водневому показнику 4,2-11,2 рН, опти-мальними значеннями е 25-28°C та 6,4-7,2 рН [11]. Целюлазна активн1сть C. globosum 377 зростае з1 збть-шенням температури в1д 15°С i досягае оптимуму за 25-30°С (рис. 3, a), що в1дпов1дае значенням оптимуму росту. Встановлено, що у лужному середовищ1 целюлазна актившсть проявляеться слабко i зростае з1 зб1льшенням кислотност1 (рис. 3, b). Максимальне значення досягаеться при рН 5,0, нижче значення рН живильного середовища пригшчуе дану актившсть.
Отже, при вирощуванш С. globosum 377 на середовищ1 з фшьтрувальним папером спостер1гаеться максимальна ендоглюканазна, екзоглюканазна, питома та загальна целюлазна активности але на пшеничнш солом1 вища в-глюкозидазна активн1сть. На обох середовищах максимум целюлазноТ активност1 спостер1гався на 14-18 добу
культивування.
Аналiзуючи лiтературнi данi можемо констатувати, що штам С. globosum 377 за целюлозол^ичною активнiстю мае певш переваги над вiдомими представниками роду Chaetomium Kunze [9, 11, 12] та може бути використаний як перспективний деструктор рослинних решток з високим вмятом целюлози.
Висновки. Проведеними досшдженнями встановлено, що природнш штам Грунтового гриба С. globosum Kunze ex Fr. 377 е активним целюлозол^ичним мкрооргашзмом. Продукування екзоглюканази C. globosum 377 i здатшсть гiдролiзувати кристалiчнi форми целюлози вказуе на його високий целюлозол^ичний потенцiал. Найвища загальна целюлазна активнiсть C. globosum 377 спостер^алась на 14 i 18 добу i складала 0,223 i 0,219 IU/ml, максимальне значення при вирощуванш на пшеничшй соломi становило 0,199 IU/ml. Максимальне значення ß-глюкозидазноТ активной C. globosum 377 спостер^алось на 18 добу i становило 0,192 IU/ml. Встановлено, що у лужному середовищi целюлазна актившсть проявляеться слабко i зростае зi збтьшенням кислотностк Температура 25-30°С i рН 5,0 поживного середовища е оптимальними для продукування целюлозол^ичних фермен^в. Штам Грунтового гриба С. globosum 377 за целюлозол^ичною актившстю мае переваги над вiдомими представниками роду Chaetomium Kunze та може бути використаний як
№1, 2016
В1СНИК УМАНСЬКОГО НАЦ1ОНАЛЬНОГО УН1ВЕРСИТЕТУ САД1ВНИЦТВА
Ii 20 25 30 35 8 7,5 7 6,5 б 5,5 5 4,5
Темпаратура культивування, °С Реакщя поживного середовища, pH
Рис. 3. Вплив температури (a) та рН живильного середовища (b) на загальну целюлозолiтичну
активностi С. globosum 377
перспективний деструктор рослинних решток з високим вмютом целюлози.
Л1тература
1. Борзова Н.В., Варбанець Л.Д. Целюлозодеградую^ системи мкро-органiзмiв: бiосинтез, власгивостi та сгруктурно-функцiональнi особливосп // Бiотехнологiя. - 2009. - Т. 2, № 2. - С. 23-41.
2. Горбач А.Л., Курочкин В.Е., Кноп И.С. Методы статистической обработки экологической информации: дискриминантный, корреляционный и регрессионный анализ. - Санкт-Петербург: СПбГУАП. СПб; РАН. Ин-т аналитич. приб-я, 2005. - 48 с.
3. Коросов А.В., Горбач В.В. Компьютерная обработка биологических данных. - Петрозаводск: ПетрГУ, 2016. - 96 с.
4. Методы экспериментальной микологии : справочник / Под ред. В. И. Билай. - Ки'в.: Наук.думка, 1982. - 549 с.
5. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлозолитических ферментов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология - 1993. - Т. 25. - 152 с.
6. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллю-лозных материалов: учеб. пособие. - Москва : Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.
7. Скуловатов О.В. Особливосп формування мкробоценозу в ризосферi кукурудзи за впливу гриба-продуцента целюлозолп^ичних ферментв. // Мкробюлопя i сучасному стьськогосподарському виробництвк Матерiали Х нуково''' кокференцп молодих вчених (22-24 жовтня 2014 р., Чершпв): зб. тез доп. Свер-Друк. - 2014. - С. 36-42.
8. Шлейкин А.Г., Скворцова Н.Н., Бландов А.Н. Биохимия. Лабораторный практикум часть 2. Белки. Ферменты. Витамины. - Санкт-Петербург: университет ИТМО, 2015. - 107 с.
9. Eyini M., Babitha S., Min Woong Lee. Cellulose Utilization and Protein Productivity of Some Cellulolytic Fungal Cocultures // Mycobiology. - 2002. -№30. - С. 166-169.
10. Ghose T.K. Measurement of cellulase activity // Pure and Applied Chemistry - 1987. - Vol. 59, № 2. - P. 257 - 268.
11. Kopilov E.P., Skulovatov O.V. Physiological characteristics of mold producing Cellulolytic enzymes Chaetomium globosum 377 // Microbiological aspects of optimization of the production process of cultured crops: proceedings of the International Scientific and Practical Internet Conference (Chernihiv, June 1618, 2015). - Chernihiv - Nizhyn: Publisher PE Lysenko N.M., 2015. - Р. 12.
12. Lakshmikant, Kamal, Mathur S.N. Cellulolytic activities of Chaetomium globosum on different cellulosic substrates // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1990. - №6. - С. 23-26.
13. Soni R., Sandhu D.K., Soni S.K. Localisation and optimisation of cellulase production in Chaetomium erraticum // Journal of Biotechnology. - 1999. -№73. - С. 43-51.
14. Suto M. Induction and catabolite repression mechanisms of cellulase in fungi // J. Biosci. Bioeng. - 2001. - 92, N 4. - P. 305-311.
References
1. Borzov N.V., Varbanets L.D. Tselyulozodehraduyuchi system microorganisms, biosynthesis, properties and structural and functional features. Biotechnology, 2009, Vol 2, no 2, 23-41 pp. (in Ukrainian).
2. Gorbach A.L., Kurochkin V.E., Knoop I.S. Methods of statistical processing of environmental information: discriminant, correlation and regression analysis. St. Petersburg: SPbSUAI. St. Petersburg; Russian Academy of Sciences. Inst analytic. approx th, 2005. 48 p. (in Russian).
3. Korosov A.V., Gorbach V.V. Computer processing of biological data. Petrozavodsk: Petrozavodsk State University, 2016. 96 p. (in Russian).
4. Methods of Experimental Mycology: Handbook. Kyiv: Nauk.dumka, 1982. 549 p. (in Ukrainian).
5. Sinitsyn A.P., Chernoglazov V.M., Gusakov A.V. Methods of studying and properties of cellulolytic enzymes. Results of science and technology. Ser. Biotechnology, 1993, V. 25. pp. 152. (in Russian).
6. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V. Chernoglazov V.M. Bioconversion of lignocellulosic materials: Textbook. allowance. Moscow: Moscow University Press, 1995. 224 p. (in Russian).
7. Skulovatov A.V. Features mikrobotsenozu formation in the rhizosphere of maize under the influence of a mushroom-producer cellulolytic enzymes. Microbiology and modern agricultural production. Materials of X scientific conference of young scientists (22-24 October 2014, Chernihiv): Coll. abstract add. Siver-Print, 2014. pp. 36-42. (in Ukrainian).
8. Shleykyn A.G., Skvortsova N.N., Blandov A.N. Biochemistry. Laboratory equipment workshop part 2 protein. Enzymes. Vitamins. St. Petersburg: YTMO University, 2015. 107 p. (in Russian).
9. Eyini M., Babitha S., Min Woong Lee. Cellulose Utilization and Protein Productivity of Some Cellulolytic Fungal Cocultures. Mycobiology, 2002, no.30, pp. 166-169. (in Russian).
10. Ghose T.K. Measurement of cellulase activity. Pure and Applied Chemistry, 1987, Vol. 59, no. 2, pp. 257-268. (in Ukrainian).
11. Kopilov E.P., Skulovatov O.V. Physiological characteristics of mold producing Cellulolytic enzymes Chaetomium globosum 377. Microbiological aspects of optimization of the production process of cultured crops: proceedings of the International Scientific and Practical Internet Conference (Chernihiv, June 16-18, 2015). Chernihiv - Nizhyn: Publisher PE Lysenko N.M., 2015, pp. 12. (in Ukrainian).
12. Lakshmikant, Kamal, Mathur S.N. Cellulolytic activities of Chaetomium globosum on different cellulosic substrates. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1990, no. 6, pp. 23-26. (in Russian).
13. Soni R., Sandhu D.K., Soni S.K. Localisation and optimisation of cellulase production in Chaetomium erraticum. Journal of Biotechnology, 1999, no.73. pp. 43-51. (in Chile)
14. Suto M. Induction and catabolite repression mechanisms of cellulase in fungi. J. Biosci. Bioeng, 2001, 92, no. 4, pp. 305-311.
В1СНИК УМАНСЬКОГО НАЦ1ОНАЛЬНОГО УН1ВЕРСИТЕТУ САД1ВНИЦТВА
№1, 2016
