CC BY
14
© Маракушин Д.1.
УДК 577.27:543.395:616-099-092.9
ТРИВАЛИЙ ВПЛИВ ОКСИЕТИЛЬОВАНИХ НОН1ЛФЕНОЛ1В
ТА IX ПОХ1ДНИХ НА ВМ1СТ 1МУНОГЛОБУЛ1Н1В ТА ЦИТОК1Н1В
*
У СИРОВАТЦ1 КРОВ1 ЩУР1В
Маракушин Д.1.
Харювський нацiональний медичний унiверситет, м. Харив
Изучено влияние оксиэтилированных нонилфенолов и их производных на содержание иммуноглобулинов и цито-кинов в сыворотке крови крыс в условиях подострого эксперимента. Исследуемые детергенты в дозах 1/10 и 1/100 ДЛ50 приводят к супрессии антителообразования в организме крыс, снижению в сыворотке крови уровня иммуноглобулинов А, М и в и снижению секреции ИЛ-1/3, 2, 4, 6, 8, 10 и ФНО-а. Эти изменения могут служить дополнительными прогностическими тестами, которые характеризуют неблагоприятное влияние оксиэтилирован-ных нонилфенолов и их производных на организм теплокровных животных.
Ключевые слова: оксиэтилированные нонилфенолы, иммуноглобулины, цитокины, иммунная система.
Порушення механ1зм1в регулювання гомеостазу за умов ¡нтоксикаци ксенобютиками останшм часом роз-глядають як «токсичний стрес», при якому в процес втручаються не ттьки нервова та ендокринна, але й 1мунна система [1, 2]. Кр1м того, 1мунна система, вико-нуючи важливу роль в адаптацшних та захисних реа-кц1ях оргаызму, одшею з перших пщдаеться зовнш-ньому впливу, а виникаюче в и д1яльност1 напруження призводить до порушення функцюнування 1нших систем та виникнення патологи [3]. Дослщження мехашз-м1в д1Т ксеноб1отик1в, розробка науково обфунтованих д1агностичних програм I виявлення об'ективних про-гностичних критерив переб1гу патолог1чних процес1в стае одшею з прюритетних задач сучасноТ медицини. Гостра необхщнють ТТ вир1шення пов'язана з прогре-суючим забрудненням довюлля, пог1ршенням здо-ров'я людини та базуеться на науковому обфунту-ванш критерив, що визначають початок стану деком-пенсац1Т функц1й орган1зму [4]. До прюритетних забру-днювач1в навколишнього середовища вщносяться ок-сиетильован1 ношлфеноли (ОЕНФ) та Тх пох1дн1 - на-тр1ев1 сол1 карбоксиметилат1в оксиетильованих ¡зоно-н1лфенол1в (КМ-ОЕНФ), як1 за ф1зико-х1м1чними влас-тивостями та особливостями будови молекул належать до ¡оногенних детергент1в. Ц1 сполуки характеризуются досить значними об'емами синтезу, широким використанням у р1зних галузях народного господарс-тва (як основа промислового випуску пластмас, поль уреташв, миючих засоб1в, емульгатор1в, антикорозй них препарат1в, г1дравл1чних та охолоджуючих речо-вин тощо), надходженням до джерел питного водопо-стачання та завдяки цьому можливим впливом на ор-ган1зм людини [5, 6]. Мехашзми дм ОЕНФ та Тх похщ-них з урахуванням динам1ки показнигав захисно-компенсаторних зсув1в в орган1зм1 вивчено недостат-ньо, а саме Тх розкриття е п1дставою для об^рунту-вання заход1в з охорони довктля та здоров'я насе-лення.
Метою даного дослщження було вивчення в сиро-ватц1 кров1 щур1в вмюту 1муноглобул1н1в I циток1н1в за
умов тривалого перорального впливу ОЕНФ та Тх по-хщних у дозах 1/10, 1/100 i 1/1000 ДЛ50.
Матерiали та методи дослiдження
У робот використано зразки речовин з регламен-тованими фiзико-хiмiчними характеристиками: ОЕНФ з числом оксиетильованих груп 10 (ОЕНФ10) та КМ-ОЕНФ з числом оксиетильованих груп 5, 6, 10 (КМ-ОЕНФ5-10). Експерименти проведено на статевозртих щурах-самцях лiнiТ WAG, масою (180-220) г. Прове-дення процедур з експериментальними тваринами здмснено згщно з вимогами СвропейськоТ конвенцп з бiоетики. Тх пiддавали пероральшй затравцi за допо-могою зонда водними розчинами речовин щоденно одноразово протягом 45 дiб у дозах 1/10, 1/100 i 1/1000 ДЛ50. Середньолетальш дози (ДЛ50) складали для ОЕНФ10 - 4,3 г/кг; КМ-ОЕНФ5 - 2,8 г/кг; КМ-ОЕНФб - 2,2 г/кг; КМ-ОЕНФ10 - 3,2 г/кг маси тта. Тваринам контрольно!' групи вводили вщповщш об'еми питноТ води. Дослiдження вмiсту iмуноглобулiнiв i цитокiнiв здiйснювали через 45 дiб пiсля початку експерименту. У кожшй групi було по 15 тварин. Забм проводили шляхом декапiтацiТ, попередньо анестезуючи тюпен-талом натрiю. Вмют iмуноглобулiнiв (Ig) А, М, G у си-роватцi кровi визначали методом радiальноТ iмуно-дифузiТ в гелi за допомогою моноспецифiчних сирова-ток проти iмуноглобулiнiв виробництва ФГУП «НПО Микроген» (Росiя). Рiвень цитогашв визначали iмуно-ферментним методом з використанням наборiв реа-гентiв «ProCon IL-1ß», «ProCon IL-2», «ProCon IL-4», «ProCon IL-6», «ProCon IL-10», «ProCon TNF-a» («Протеиновый контур», Росiя), «Интерлейкин-8-ИФА-БЕСт» («Вектор-Бест», Росiя) i аналiзатора iмунофе-рментного Stat Fax 303 Plus. Статистичний аналiз да-них проводили з використанням комп'ютерного пакета прикладних програм для обробки статистичноТ Ыфор-маци Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., США). Первинне ста-тистичне опрацювання даних починали з перевiрки припущення про вiдповiднiсть вибiрок закону гауавсь-кого розподiлу, застосовуючи критерм Шапiро-Вiлка. Додатково правильнiсть позитивного висновку щодо
* Цитування при атестаци кадрiв: Маракушин Д.1. Тривалий вплив оксиетильованих нонлфенолв та Тх поздних на вмст ¡муноалобул1Н1в та цитокнв у сироватц кровi щур1в // Проблеми екологп i медицини. - 2013. - Т. 17, № 5-6. - С. 38 -41
нормальностi розподту вибiрок контролювали за до-помогою коефiцieнтiв асиметрií та ексцесу. Ктькюш ознаки, що мали нормальний розподт, описували па-раметричними характеристиками - середым значен-ням показника (М) та середшм квадратичним вщхи-ленням (б); у разi вiдсутностi нормального розподту непараметричними - медiаною (Ме) та Ытерквартиль-ним розмахом. Для порiвняння двох нормальних роз-подов застосовували t-критерiй Стьюдента. Якщо принаймн один з розподiлiв не був нормальним, то для порiвняння незалежних вибiрок застосовували критерiй Манна-Уíтнi. За критичний рiвень значущостi при перевiрцi статистичних гiпотез приймали р<0,05.
Результати та IX обговорення
На 45-ту добу дií ОЕНФ та 1'х похiдних у дозi 1/10 ДЛ50 спостерiгалося статистично значуще (р<0,001), порiвняно з контролем, зменшення вмiсту !дА в сиро-ватцi кровi щурiв: для ОЕНФ10 i КМ-ОЕНФ5 в серед-ньому в 2 рази, а для КМ-ОЕНФ6 i КМ-ОЕНФ10 - майже в 3 рази (табл. 1). Така ж динамка змЫ вмюту 1дА ви-значалася й для дози 1/100 ДЛ50, але менш виразна
Вмiст iмуноглобулiну А у сирова
(зменшення в середньому в 1,5 раза). Доза 1/1000 ДЛ50 виявилася нед^чою. Зниження вмюту 1д А свщ-чить про недостатнють гуморального та мюцевого iмунiтету. Показник рiвня 1дМ також достг^рно значуще (р<0,001), порiвняно з контролем, знижувався на 45-ту добу перорального введення речовин у 1/10 i 1/100 ДЛ50 в середньому вщповщно в 2,0 i 1,5 раза (табл. 2). Максимально високим цей рiвень був зарее-стрований у випадку дií КМ-ОЕНФ5, мiнiмально низь-ким - у випадку дм ОЕНФ10. Слiд вщзначити, що три-валий вплив КМ-ОЕНФ5 i КМ-ОЕНФ10 у дозi 1/1000 ДЛ50 також супроводжувався статистично значущим (р=0,003 i р=0,032 вiдповiдно) зниженням вмюту 1дМ, тодi як ОЕНФ10 i КМ-ОЕНФб у цiй дозi не впливали на рiвень цього показника (р=0,163 i р=0,087). Осктьки 1дМ з'являються на першому етап iмунноí вiдповiдi та в основному знаходяться у судинному русл^ вони вщь грають важливу захисну роль на раных стадiях ток-семп. Виявлене зниження вмiсту 1дМ також свщчить про недостатнiсть гуморального iмунiтету, порушення 1х синтезу або посилення катаболiзму.
Таблиця 1
1 кровi шурiв на 45-добу впливу оксиетильованих ноншфенолв та Гх похдних (г/л; п=15; Ме [25%; 75%] або М±б)
Речовина Доза, ДЛ50
1/10 1/100 1/1000
ОЕНФ10 0,29±0,057 0,39 [0,36; 0,41] 0,53 [0,48; 0,55]
р<0,001 р<0,001 р=0,237
км-оенф5 0,22±0,039 0,33 [0,29; 0,37] 0,51±0,031
р<0,001 р<0,001 р=0,69
КМ-ОЕНФб 0,19 [0,17; 0,20] 0,35 [0,28; 0,37] 0,49±0,028
р<0,001 р<0,001 р=0,384
КМ-ОЕНФ10 0,18 [0,15; 0,22] 0,29±0,037 0,46 [0,43; 0,48]
р<0,001 р<0,001 р=0,019
Контроль 0,50±0,053
Прим/'тка: р - р/'вень значущост/' порiвняно з контролем
Таблиця 2
Вмiст iмуноглобулiну М у сироватц кровi шурiв на 45-добу впливу оксиетильованих ноншфенолв
та Гх похдних (г/л; п=15; Ме [25%; 75%] або М±б)
Речовина Доза, ДЛ50
1/10 1/100 1/1000
ОЕНФ10 0,52±0,094 0,63±0,069 0,82±0,062
р<0,001 р<0,001 р=0,163
КМ-ОЕНФ5 0,38±0,043 0,47±0,065 0,7 [0,69; 0,79]
р<0,001 р<0,001 р=0,003
КМ-ОЕНФ6 0,42 [0,38; 0,44] 0,52 [0,49; 0,56] 0,76±0,037
р<0,001 р<0,001 р=0,087
КМ-ОЕНФ10 0,46±0,041 0,56±0,046 0,83±0,044
р<0,001 р<0,001 р=0,032
Контроль 0,81 ±0,028
Прим/'тка: р - р/'вень значущост/' порiвняно з контролем
Вмют !дО у сироватц кровi щурiв на 45-добу дм ОЕНФ та 1х похщних у дозi 1/10 ДЛ50 також був досто-вiрно нижчим (р<0,001) порiвняно з даними групи контролю (табл. 3). У даному випадку найбтьш суттевим зниження цього показника характерно для КМ-ОЕНФб (майже в 2 рази), найменш - для ОЕНФ-ю (в 1,4 раза). Тривалий вплив речовин у дючм дозi 1/100 ДЛ50 та-
кож призводив до статистично значущого, порiвняно з контролем, зниження рiвня !дО у сироватцi кровi щу-рiв, але воно було менш виразним (в середньому в 1,3 раза; р<0,006), шж у випадку дм 1/10 ДЛ50. Дiя речовин у дозi 1/1000 ДЛ50 не викликала достовiрно зна-чущих змiн з боку !дО. Стiйке зниження рiвня !дО свщчить про виснаження 1х захисноí ролi.
Таблиця 3
Вмiсm iмуноглобулiну Э у сироватц кровi щурiв на 45-добу впливу оксиетильованих нонлфенолв
та Гх похдних (г/л; п=15; Ме [25%; 75%] або М±б)
Речовина Доза, ДЛ50
1/10 1/100 1/1000
ОЕНФ10 4,0±0,62 4,5±0,53 5,8 [4,9; 6,5]
р<0,001 р=0,006 р=0,455
КМ-ОЕНФ5 2,9±0,53 4,0±0,88 5,1±0,95
р<0,001 р<0,001 р=0,283
КМ-ОЕНФб 2,6 [2,4; 3,2] 3,9±0,71 5,0 [4,8; 6,4]
р<0,001 р<0,001 р=0,88
КМ-ОЕНФ10 3,3±0,65 4,3 [3,6; 5,0] 5,4±0,79
р<0,001 р=0,002 р=0,89
Контроль 5,5±1,05
Примотка; р - р'/вень значущост'/ пор'/вняно з контролем
Адекватна iмунна вщповщь базуеться на баланс к^тинно-опосередкованих i гуморальних iмунних реа-кцй розвиток яких пщтримуеться та регулюеться ци-токiнами [7-9]. Речовини призводили до порушень з боку цитокшового профiлю сироватки кровi щурiв (табл. 4). У разi 1'х тривалого перорального введення у дозi 1/100 ДЛ50 спостер^али, порiвняно з контролем, зниження (р<0,003) рiвня 1Л-1р: для КМ-ОЕНФ5 - май-же в 2 рази, КМ-ОЕНФб i КМ-ОЕНФ10 - в середньому в 1,8 раза, ОЕНФ10 - лише в 1,4 раза. Прозапальний цитоган 1Л-1р мае чисельнi загальнi ефекти i сприяе розвитку системного характеру патолопчного процесу шляхом формування аутоантитiл i пiдвищення конце-нтрац^ у кровi С-реактивного бiлка. Зниження цього
Вмiст цитоюнв у сироватц та Гх
показника е важливим дiагностичним критерiем хронь чного переб^у запального процесу в органiзмi щурiв за умов тривалого впливу ОЕНФ та 'х похiдних. На 45-добу в сироватц кровi щурiв вiдзначалося також зниження рiвня 1Л-2 майже в 2 рази за умов впливу КМ-ОЕНФ5 (р<0,001), в 1,8 раза - КМ-ОЕНФб (р<0,001), в 1,5 раза - КМ-ОЕНФ10 (р<0,001) та в 1,3 раза -ОЕНФ10 (р=0,003). 1Л-2 розглядаеться як регулятор-ний цитокiн, здатний компенсувати прояви iмунноí не-достатностi, вiдновлювати баланс Т-хелперiв, що призводить до регуляцп продукцií проти- та прозапа-льних цитоюшв. Зниження продукцií 1Л-2 е пщтвер-дженням виникнення Т-клiтинного iмунодефiциту.
Таблиця 4
кровi шурiв на 45-добу впливу оксиетильованих нонiлфенолiв похiдних у дозi 1/100 ДЛ50 (нг/л; п=15; Ме [25%; 75%] або М±б)
Показник ОЕНФ10 км-оенф5 КМ-ОЕНФ6 КМ-ОЕНФ10 Контроль
1Л-1 р 40,2 [30,7; 50,5] р<0,001 29,3±6,36 р<0,001 30,3±5,69 р=0,0018 32,5 [29,0; 46,0] р<0,001 56,9±7,05
1Л-2 48,3±8,53 р=0,003 30,6±6,12 р<0,001 36,5 [25,8; 40,1] р<0,001 43,9 [32,1; 50,0] р<0,001 64,7±17,1
1Л-4 29,5 [26,0; 39,4] р<0,001 20,3 [17,5; 29,0] р<0,001 26,3±8,37 р<0,001 32,0 [27,9; 39,0] р<0,001 40,9 [39,4;60,3]
1Л-6 24,4±6,04 р<0,001 18,9 [12,0; 28,5] р<0,001 28,9 [19,2; 30,2] р=0,0015 23,1±5,88 р<0,001 39,8 [35,0; 50,6]
1Л-8 31,8±6,58 р<0,001 20,1 [17,0; 27,0] р<0,001 25,1±6,27 р<0,001 30,5 [28,0; 44,5] р<0,001 48,4 [44,0; 59,0]
1Л-10 25,0 [19,3; 31,0] р<0,001 20,0 [15,1; 22,5] р<0,001 24,7 [17,0; 29,0] р<0,001 32,7±7,57 р=0,0013 43,9±9,66
ФНП-а 110,0 [90,6; 118,6] р<0,001 97,8 [80,5; 108,3] р<0,001 85,8±11,84 р=0,0016 118,0±9,39 р<0,001 136,8 [123,8; 148,4]
Прим/'тка; р - р'/вень значущост/' порiвняно з контролем
Як маркер аутоiмунних i алерпйних процеав роз-глядають 1Л-4, який обумовлюе активацiю гуморального ланцюга iмунноí системи, стимулюе пролiфера-цiю та диференцiювання В-к^тин, синтез загального 1дЕ, а також Ыпбуе моноцити й макрофаги, продукцю ФНП-а. У сировaтцi кровi щурiв на 45-ту добу впливу речовин у дозi 1/100 ДЛ50 виявлялося зниження (р<0,001), порiвняно з контролем, рiвня 1Л-4 всеред-ньому в 1,6 раза. Зниження секреци 1Л-4, у даному випадку, може супроводжуватися пригшченням анти-генно' стимуляци Т- i В-лiмфоцитiв, мaкрофaгiв, туч-них к^тин, бaзофiлiв, стромальних клiтин, гемопоети-чних попередникiв тощо.
Тривала дiя ОЕНФ та 'х похiдних призводила також до зниження (р<0,0015) в сироватц кровi тварин вмюту 1Л-6 в середньому в 1,7 раза. Бюлопчна роль 1Л-6, по-перше, полягае в iндукцií вiдновлювaльних мехaнiзмiв та aктивaцií iмунного захисту (актива^я i диференцiювaння Т-клiтин, визрiвaння В-к^тин, поси-лення гемопоезу). Поряд з цим також вщома гaльмiв-на дiя 1Л-6 на запальну реакцю шляхом гальмування синтезу ряду прозапальних субстанцм, в тому числi ФНП-а. Виявлене зниження рiвня 1Л-6 за умов трива-лоí д1Т речовин може призвести до пригшчення 1х фун-кцiонaльноí aктивностi та зниження гуморaльноí iмун-ноí вiдповiдi. Аналопчно спостерiгaлaся тенденцiя до
статистично значущого (р<0,001), пор1вняно з контролем, зниження вмюту 1Л-8. Найб1льш суттевим це ви-явилося для тривалоТ д1Т ОЕНФ10 у доз1 1/100 ДЛ50, а саме в 2,4 раза. 1нш1 речовини знижували вмют 1Л-8 в середньому в 1,7 раза. Цитоюн 11_-8 продукуеться моноцитами та макрофагами, виконуе роль ¡ндуктора гострих запальних реакцй викликаючи експрес1ю молекул м1жкл1тинноТ адгезп та посилюючи адгез1ю ней-троф1л1в до ендотел1альних кл1тин I субендотел1аль-них матричних б1лк1в, що свщчить про його основну роль в опосередкуванн запальноТ в1дпов1д1. Зниження його продукцп е одн1ею з причин пригнмення кл1тинно-го та гуморального ¡муштету.
До циток1н1в з виразним протизапальним ефектом в1дноситься 1Л-10, який продукуеться Т-кл1тинами й розглядаеться як антагонют ряду 1нших циток1н1в. 1Л-10 пригн1чуе продукц1ю прозапальних цитогашв, про-л1феративну в1дпов1дь Т-кл1тин на антигени й м1тоге-ни, а також зменшуе секрецю активованими моноцитами 1Л-1 р, ФНП-а, 1Л-6. Але одночасно 1Л-10 може стимулювати синтез 1дЕ. У результат! вш сприяе роз-витку гуморальноТ складовоТ 1мунноТ в1дпов1д1. ОЕНФю, КМ-ОЕНФ5, КМ-ОЕНФ6 у д1юч1й доз1 1/100 ДЛ50 на 45-добу д1Т призводили до зниження (р<0,001) р1вня 1Л-10 в середньому в 2 рази. Для КМ-ОЕНФ10 падшня (р<0,0013) р1вня 1Л-10 було менш виразним, лише в 1,3 раза. Ц1 змши також вказують на порушен-ня функцюнального стану захисних систем оргаызму щур1в.
У 1мунометабол1чному план1 важливе значення мають результати щодо вмюту ФНП-а. Так, у сирова-тц1 кров1 щур1в на 45-ту добу введення речовин вмют цього показника статистично значуще (р<0,001) зни-жувався, в середньому в 1,4 раза, пор1вняно з контрольною групою. ФНП-а продукуеться як кл1тинами 1мунноТ системи, так й 1ншими типами кл1тин (астроци-тами, ф1бробластами, гл1альними кл1тинами, керати-ноцитами). Низьк1 р1вн1 ФНП-а за умов тривалого впливу дослщжуваних речовин можуть бути пов'язан з недостатньою стимуляц1ею макрофагального захис-ту орган1зму.
У ц1лому зниження цитогашв в кров1 щур1в за умов тривалоТ дм ППЕ е св1дченням глибоких порушень 1мун1тету, проявом розвитку вторинного 1мунноТ недо-статностк
Висновки
1. ОЕНФ та |'х похiднi за умов тривалоТ дiT у дозах 1/10 i 1/100 ДЛ50 призводять до супреси антитто-утворення в органiзмi u^ypiB, що пщтверджуеться зни-женням в сироватц кровi рiвня iмyноглобyлiнiв А, М i G. Доза 1/1000 ДЛ50 виявляеться недiючою на вмiст iмyноглобyлiнiв. 2. ОЕНФ та Тх похщы у разi тривалого перорального впливу у дючм дозi 1/100 ДЛ50 викли-кають сyттевi порушення у системi цитокiнiв - медiа-торiв контролю процесiв пролiферацiT, диференцю-вання, апоптозу та функционально' активностi штин-них елементiв у гомеостатичних системах оргаызму, що пiдтверджyеться зниженням у сироватц кровi щу-рiв секреци 1Л-1 р, 2, 4, 6, 8, 10 та ФНП-а. 3. ЗмЫи з боку iмyноглобyлiнiв та цитогаыв можуть слугувати додатковими прогностичними тестами, що характеризуюсь несприятливий вплив ОЕНФ та Тх похщних у дозах 1/10 i 1/100 ДЛ50 на органiзм теплокровних тва-рин.
Л^ература
1. Постанова М.В. Физиологические механизмы индивидуальной организации гомеостаза организма. - Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2011. - 356 с.
2. Забродский П. Ф. Иммунотоксикология ксенобиотиков / П. Ф. Забродский, В. Г. Мандыч. - Саратов: СВИБХБ,
2007. - 420 с.
3. Татаркин A.A. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия в системе межклеточной функциональной многоуровневой регуляции гомеостаза / A.A. Татаркин, Н.Д. Татаркина, Б.Г. Андрюков // Здоровье. Медицинская экология. Наука. - 2010. - Т. 43, № 3. - С. 13-17.
4. Аманжол И.А. Реакция организма на воздействие вредных производ-ственных факторов: оценка профессионального риска / И.А. Аманжол, З.Т. Мухаметжанова, Д.С. Абитаев. - Lambert Academic Publishing, 2013. -116 с.
5. Детергенти сучасностг технолопя виробництва, еколо-пя, економка використання / В.А. Бурлака, Г.Б. Руден-ко, 1.Г. Грабар, А.Д. Бiба. - Ж.: ЖДТУ, 2004. - 745 с.
6. Научные основы обоснования прогноза потенциальной опасности детергентов в связи с регламентацией в воде водоемов / [Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Евдокимов В.И. и др.]. - Белгород, 2001. - 442 с.
7. Кетлинский С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. - СПб.: ООО «Издательство Фолиант»,
2008. 552 с.
8. Чуклин С.Н. Интерлейкины / С.Н. Чуклин, А.А. Пере-яслов. - Львов: Лига-Пресс, 2005 .- 481 с.
9. Казмiрчyк В.е. Кл^чна iмyнологiя i алерголопя / В.е. Казмiрчyк, Л.В. Ковальчук. - ВЫниця: Нова книга, 2006. - 528 с.
