CC BY
254
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ТРЕБОВАНИЯ К КЛЕТОЧНЫМ КУЛЬТУРАМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Н.В. Шалунова, В.А. Меркулов, А.В. Комратов, Е.М. Петручук,
И.С. Семенова, А.Р. Волгин, Г.А. Трусов
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Shalunova@bk.ru
Резюме: В статье описываются требования и методы аттестации первичных и перевиваемых клеточных культур, применяемых в качестве субстратов производства и контроля иммунобиологических лекарственных препаратов. Определены задачи по развитию системы создания и аттестации клеточных банков диплоидных и гетероплоидных линий, а также по развитию фондов коллекции клеточных культур.
Ключевые слова: клеточные культуры, диплоидные и гетероплоидные клетки, клеточные банки, иммунобиологические лекарственные препараты.
REQUIREMENTSFOR CELL CULTURES, USED FOR MANUFACTURE AND QUALITYCONTROL OFIMMUNOBIOLOGICAL MEDICINES
N.V. Shalunova, V.A. Merkulov, A.V. Comratov, E.M. Petruchuk, I.S. Semenova, A.R. Volgin, G.A. Trousov
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Abstract: The present article describes the requirements and methods of certification for primary and continuous cell cultures used as substrates for manufacture and control of immunobiological medicines. The main objectives which include developing the system for elaborating and certifying diploid and heteroploid lines cell banks as well as developing cell culture collection funds have been stated.
Key words: cell cultures, diploid and heteroploid cells, cell banks, immunobiological medicines
Клеточные культуры, культивируемые in vitro, начиная с конца 50-х годов прошлого столетия нашли широкое применение в различных областях биологии и медицины. Для производства и контроля иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) применяются первичные и перевиваемые (диплоидные и гетероплоидные) клеточные линии.
Первые требования к оценке качества первичных культур клеток (ПКК), полученных из почек африканских мартышек, были опубликованы ВОЗ при разработке и внедрении инактивированной по-лиомиелитной вакцины [1, 8]. Дальнейшие успехи в борьбе с вирусными заболеваниями, такими как корь, паротит, краснуха, грипп и другие, стали возможными благодаря использованию вакцин, приготовленных в ПКК, полученных из куриных эмбрионов, а также почек и других органов собак, кроликов, хомяков. ПКК легко культивируются в питательных средах и обладают высокой чувствительностью к различным вирусам. Однако они могут быть контаминированы посторонними инфекционными агентами, присущими донору. Контаминация может быть уменьшена предварительным скринингом животных на присутствие вирусов и антител и созданием хозяйств, свободных от патогенной флоры (SPF).
Уже в шестидесятые годы прошлого столетия в качестве альтернативы ПКК в качестве субстратов были предложены диплоидные клеточные линии (ДКЛ) человека и животных (например, WI-38, MRC-5, FRhL-2 и др.) [2]. Последние представляют собой однородную популяцию перевиваемых клеток с ограниченным сроком жизни и сохраняющую in vitro диплоидный кариотип, идентичный донору. Они, как правило, не туморогенны, но более требовательны к составу питательных сред, трудно адаптируются к бессыворо-точной питательной среде.
Начиная с 80-х годов прошлого столетия наибольшей популярностью стали пользоваться гетероплоидные клеточные линии (ГКЛ), серийно субкуль-тивируемые вследствие спонтанной трансформации первичных клеток. Они легко культивируются в синтетических питательных средах с добавлением сыворотки крупного рогатого скота, могут размножаться в бессывороточной среде, в биореакторах, на микроносителях. ГКЛ имеют неограниченный срок жизни и типичную морфологию, обладают высокой чувствительностью к заражению специфическими агентами, сохраняют стабильность биологических свойств в течение срока, рекомендуемого для производства ИЛП.
Перевиваемые ГКЛ имеют ряд преимуществ перед первичными. Со времени принятия ВОЗ [3]
рекомендаций о безопасности гетероплоидных линий клеток, используемых в качестве субстратов ИЛП, разработаны и внедрены высокочувствительные методы определения различных качественных характеристик клеток по сравнению с первичными клетками, полученными от животных из хозяйств, свободных от патогенной флоры. Более низкая стоимость таких клеток, отсутствие необходимости использования первичных клеток приматов (как, например, при производстве живой полио-миелитной вакцины), простота приготовления и культивирования суспензионных культур в большом объеме, чувствительность к репликации многих инфекционных возбудителей, относительная простота трансфекции плазмидами, содержащими рекомбинантную ДНК, высокая способность к производству рекомбинантных белков, секреция вирусов в культуральную среду делают эти клетки весьма привлекательным объектом при производстве широкого круга ИЛП.
Разработка системы оценки качества клеточных культур при производстве и внедрении новых ИЛП обусловлена необходимостью обеспечения безопасности субстратов, которые, в первую очередь, должны быль исследованы при доклиническом изучении препаратов.
В научной литературе описан ряд факторов, влияющих на безопасность клеток.
1. Выбор источника клеток — органы и ткани животных и птиц для производства клеточной культуры должны быть получены из хозяйств, свободных от патогенной флоры, в том числе от заболеваний, вызываемых прионами.
2. Условия культивирования.
3. Генетические аномалии донора (в случае, если клеточные линии изначально были получены из тканей человека).
4. Уровень дифференциации клеток и вследствие этого возникающая туморогенность (способность перевиваемых клеточных линий при введении чувствительным животным образовывать опухоли, состоящие из инокулированных клеток) или онкогенность (образование опухолей у чувствительных животных, обусловленных онкоген-ными компонентами, присутствующими во введенных клетках: ДНК, РНК, трансформирующие белки).
Комитет экспертов ВОЗ определил необходимость представлять подробную характеристику любой перевиваемой линии клеток, аттестованной для производства и контроля биологического продукта [4]. В первую очередь должны быть изложены сведения об ее происхождении, получении, количестве пассажей или удвоений, о ростовых и морфологических свойствах, об отсутствии посторонних агентов. Кроме того, должны быть указаны отличительные признаки, такие как биохимические, ци-
тогенетические, иммунологические свойства, которые бы четко позволяли отличать описываемые клетки от других линий, а также их туморогенную и онкогенную активность, если эти свойства еще не были описаны.
Подобное качество оценки и поддержания клеточных линий обеспечивает система создания клеточных банков, состоящих из однородных клеток, полученных на одном пассажном уровне, в одних и тех же условиях и сохраняемых в емкостях при температуре жидкого азота.
Следующая схема отражает систему создания банков культур клеток:
• выбранная клеточная культура;
• создание мастер-банка посевных клеток;
• создание рабочего банка производителя;
• подготовка и использование производственной культуры.
Характеристика банков клеток должна быть одобрена и зарегистрирована Национальным органом контроля, несущим полную ответственность за их утверждение [3].
При аттестации культур клеток, заложенных в банках, должны быть исследованы:
• история и генеалогия (при получении клеток от эмбриона человека);
• жизнеспособность, культуральные свойства;
• наличие посторонних агентов;
• видовая идентичность клеточной линии;
• туморогенность и / или онкогенность.
При описании истории и генеалогии необходимо представлять Национальным контрольным органам данные, кем и когда получена культура клеток, состояние здоровья донора с указанием перенесенных заболеваний, об источнике ткани. Клеточные культуры должны быть свободны от контаминирующих агентов, исследованы на отсутствие туморогенности и онкогенности методами in vivo (гетеротрансплантация клеток иммуносупрес-сированным животным) или in vitro (инвазивность клеток в органные культуры или формирование очагов трансформации в жидком агаре), показана их видовая специфичность. С этой целью суспензию клеток исследуют на микробиологическую стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов наиболее чувствительными методами, одобренными регулирующими органами. Наиболее информативной и достоверной в последние годы при изучении туморогенности и онкогенности клеток признается подкожная имплантация клеточного материала 6—8-недельным иммунодефицитным мышам линии Balb/c nude массой от 19 до 22 граммов, которых содержат в специализированных условиях с соблюдением требований GLP.
Непрерывное пассирование клеточных линий может приводить к контаминации их агентами различной этиологии. Основными источниками кон-
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
таминации являются ткани донора, питательные среды, сыворотка, трипсин и другие ингредиенты, используемые при культивировании клеток. Особую проблему представляет контаминация субстратов клетками других видов, поэтому при работе с определенной линией не допускается работа с другими клетками в одних и тех же помещениях в одно время. Нарушение этих требований нередко приводит к тому, что в одной и той же коллекции сохраняются одинаково обозначенные линии клеток, значительно различающиеся по своим свойствам, модальному классу хромосом.
Большая степень риска возникает при наличии в препарате примесей и, главным образом, клеточной инфекционной и неинфекционной ДНК, эндогенных вирусов. Препараты, субстратом которых являются перевиваемые клеточные культуры, должны быть исследованы на отсутствие остаточной ДНК. Рекомендации ВОЗ 2010 г. устанавливают верхний предел определяемого наличия клеточной ДНК в 10 нг на парентеральную дозу. Риск присутствия клеточной ДНК в препарате связан с наличием инфекционного вирусного генома и с онкогенностью. Вирусный геном ДНК, независимо от его интеграции в геном клетки, нередко может быть активным в опытах in vitro и in vivo. Онкоген-ная способность клеточной ДНК может индуцировать клетки к трансформации, превращая их в туморогенные.
В этих случаях большое значение приобретают методы и способы очистки конечного продукта с учетом условий пользы и риска. Производитель должен представлять в Национальные органы контроля экспериментальные материалы об отсутствии посторонней микрофлоры в источнике сырья и питательных средах, чтобы оценить возможность их применения для закладки банков клеток. Кроме того, должна быть представлена документация о валидации производственного процесса в соответствии с требованиями GMP. Рекомендуется исключение из процесса приготовления препарата сырья человеческого происхождения.
Внешняя среда также является источником микробиологического загрязнения (особенно микоплазмами) и должна контролироваться для предотвращения контаминации клеток. Методы, используемые для тестирования контаминации, должны быть одобрены Национальными органами контроля. Для скрининга показателей качества культур клеток используют тесты на выявление инфекционных агентов, такие как пассирование клеточного лизата в наиболее чувствительных индикаторных клеточных культурах с последующим применением реакции гемагглютинации (при 4 и 20—25 °С) и гемадсорбции, заражение новорожденных и взрослых животных, куриных эмбрионов. В настоящее время рекомендуется использо-
вание метода амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР).
Подлинность заложенных в банк клеточных линий должна быть подтверждена с помощью методов, одобренных Национальными органами контроля. Это изоферментный и кариологический анализы, ПЦР, которые позволяют идентифицировать вид источника клеточной линии (человек, обезьяна, мышь, хомяк и т.д.).
Кариологический анализ клеток подтверждает безопасность и пригодность клеточных линий в качестве субстратов ИЛП, при этом должны быть идентифицированы маркерные хромосомы [9, 10]. Эти данные могут быть полезны также при оценке генетической стабильности линии клеток на протяжении ее использования от посевного банка, рабочего банка производителя и производственной культуры. Должно быть подсчитано точное количество хромосом, определены их повреждения и структурные отклонения. Эти данные должны сохраняться на протяжении всего времени работы с аттестованным банком производителя для подтверждения генетической стабильности клеточной линии. В настоящее время разрабатываются новые методы, такие как спектральное кариотипирование с применением флюоресцирующих меток, анализ коротких концевых повторов ДНК методом ПЦР и другие [6].
Сохранение свойств аттестованных клеточных линий возможно только при хранении клеточной культуры при низких температурах [5]. Высокий уровень жизнеспособности клеток при криоконсервации важен для эффективного и надежного производства ИЛП. Существует ряд тестов определения жизнеспособности: исследование целостности мембран, метаболической активности, репликации ДНК. Для исключения завышения определения жизнеспособности клеток должны быть изучены дополнительные маркеры, такие как индикаторы апоптоза, уровни лактатдегидрогеназы. При получении новых штаммов перевиваемых клеточных линий необходимо описывать их биохимические и цитогенетические маркеры.
Пригодность клеточного запаса определяется стабильностью свойств клеточной культуры в процессе хранения, которая должна периодически подтверждаться.
При производстве продукции разрешенный уровень пассажей клеток должен быть определен действующей нормативной документацией, одобренной регулирующими органами. При масштабировании процесса изученное количество пассажей не должно изменяться.
Если возникает необходимость превысить ранее рекомендованный предел уровня пассажей аттестованной культуры, следует провести повторное исследование клеточной линии до нужного производителю пассажа.
Для обеспечения процесса производства ИЛП необходимы условия приготовления и изучения клеточного субстрата в соответствии с требованиями GMP [11]. Процессы проведения контрольных испытаний должны быть валидированы и, только после установления соответствия национальным и международным требованиям, клеточные банки могут быть признаны пригодными для производства ИЛП. Национальные контрольные органы несут ответственность за стабильность клеточного субстрата для производства препаратов. С этой целью пригодность клеточных банков должна подтверждаться ежегодными инспекционными проверками.
В связи с появлением новых более информативных методов оценки клеточных линий ВОЗ приступила к пересмотру требований, применяемых ко всем типам клеточных культур, которые используются в производстве ИЛП. Были обновлены разделы, касающиеся снижения рисков посторонней контаминации, туморогенности, онкогенности, обнаружения остаточной ДНК и другие.
Перед специалистами ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России принципиально возникают две задачи:
• аттестация клеточных банков диплоидных и гетероплоидных линий производителей ИЛП с целью их пригодности в качестве субстратов производства профилактических, лечебных и диагностических препаратов;
• создание, аттестация клеточных банков различных клеточных линий и последующее обеспечение работ подразделений учреждения по контролю специфической активности и других показателей препаратов, определяемых при сертификации ИЛП.
Для выполнения этих задач планируется создание подразделения, обеспечивающего работу с клеточными культурами в соответствии с GMP:
• наличие чистых помещений (отдельных боксовых помещений с приточно-вытяжной вентиляцией по классу А/В) для перевиваемых, диплоидных и первичных клеток;
• организация вспомогательных зон по классу С/Д;
• оборудование отдельного помещения для криоконсервации клеток (создание криобанка штаммов и линий клеток и коллекций клеточных культур);
• обучение специалистов для работы с клеточными культурами;
• приобретение приборов и оборудования для работы с клеточными линиями (термостатов, микроскопов, лабораторного оборудования);
• оборудование вивария для изучения вирусной контаминации клеточных линий;
• оборудование для работы с куриными эмбрионами для выявления контаминации клеточных линий;
• обеспечение питательными средами, растворами и сыворотками крупного рогатого скота (в том числе эмбриональной) для культивирования клеточных линий, проверки стерильности и присутствия микоплазм.
В настоящее время в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России проведен анализ, и составлен перечень клеточных линий, необходимых для обеспечения выполнения заданий Минздрава России при регистрации препаратов и проведения сертификационного контроля ИЛП, который включает более 30 клеточных линий, из которых 11 заложены на хранение в криохранилище «Locator 4 Plus». Проводятся исследования по созданию посевных банков 2-х линий, их оценка в отношении бактериологической контаминации и присутствия микоплазм.
В дальнейшем необходимо выполнение научных исследований по следующим основным направлениям:
• создание, непрерывное поддержание и развитие фондов коллекции клеточных культур путем сбора, паспортизации и хранения клеточных линий человека, животных и растений, имеющих значение для производства и контроля ИЛП;
• разработка единых требований к качеству коллекционного клеточного материала, единых паспортов, методов анализа, хранения и контроля клеточных линий;
• совершенствование методов поддержания коллекции на основе проведения научных исследований, посвященных изучению влияния условий культивирования, криоконсервации, присутствия экзогенной или эндогенной контаминации на генетическую изменчивость клеточных линий;
• создание новых клеточных линий и гибридом, на основе которых возможно формирование банков диагностических моноклональных антител для дифференциации клеточных линий, контаминированных посторонними агентами, в том числе клеточными линиями другого происхождения;
• разработка новых методов криоконсервации, селекции клеточных линий, имеющих промышленное значение;
• создание и поддержание посевных (мастер-) и рабочих банков клеточных культур, используемых для производства и контроля ИЛП;
• депонирование уникальных клеточных линий, в том числе и гибридом, патентуемых в связи с их практической ценностью;
• создание информационной базы данных по клеточным культурам путем мониторинга ре-
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
гулярных издании и постоянно действующей службы информации;
обеспечение клеточным материалом соответствующих подразделений для проведения лабораторного контроля ИЛП; аттестация банков клеток, предназначенных для производства и контроля ИЛП, представленных учреждениями-разработчиками новых вакцинных препаратов;
участие в подготовке и представлении заключений комиссий по результатам экспертизы нормативной документации и качества ИЛП в целях их государственной регистрации. Формирование и ведение архивных материалов по вопросам, связанным с экспертизой ИЛП, про-
изводство которых осуществляется с применением клеточных культур;
• обеспечение образцами стандартного и надежно охарактеризованного клеточного материала для проведения медицинских и биотехнологических исследований;
• обеспечение научно-исследовательской, производственной, диагностической, контрольной деятельности производственных и научных учреждений.
Таким образом, показана необходимость создания подразделения для работы с клеточными культурами, приведены требования к оборудованию и персоналу. Определены перспективные направления проведения научных исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Серия технических докладов ВОЗ. 1962.
№ 237.
2. Серия технических докладов ВОЗ. 1988.
№ 745.
3. Серия технических докладов ВОЗ. 1990.
№ 760.
4. Экспертный комитет по биологической стандартизации ВОЗ, серия технических докладов. 2010. 10.2132.
5. Миронова Л.Л. Разные аспекты применения культур клеток в вакцинологии // Фундаментальные исследования. 2009. № 9. С. 60-62.
6. Животная клетка в культуре (методы и применение в биотехнологии). М. 2009.
651 с.
7. Кулешов К.В. Разработка молекулярно-генетических методов видовой идентификации клеточных культур // Цитология. 2008. Т. 50. № 9. С. 812-813.
8. Salk J.E., Ward E.N. Some characteristics of a continuosli propagating cell derived from monkey heart tissue // Science. 1957. Vol. 126. № 3287. C.1338-1339.
9. Новохатский А.С., Царева А.А.,
Михайлова Г.Р., Жданов В.М. Контами-
нация клеток перевиваемых линий // Вопросы вирусологии. 1979. № 8.
С. 432-439.
10. Полянская Г.Г. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах
при длительном культивировании в разных условиях.
Автореф. дис... д. биол. н.
СПб. 38 с.
11. Аттестация перевиваемых клеточных культур. Методические рекомендации. М.2011.
