CC BY
7ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2000, том 42, М 8, с. 1419-1423
УДК 541.64:532.72
ТРАНСПОРТНЫЕ ФУНКЦИИ СИСТЕМЫ БЕЛОК-ПОЛИДИЭТИЛАКРИЛАМИД
© 2000 г. И. JI. Валуев, А. А. Антипов, И. В. Обыденнова, И. М. Шаназарова, М. А. Розенфельд, JI. И. Валуев, Н. А. Платэ
Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева Российской академии наук
117912 Москва, Ленинский пр., 29
Поступила в редакцию 09.09.1999 г. Принята в печать 28.02.2000 г.
Изучена зависимость НКТС и биологической активности сополимера белка с ИДЯ-диэтилакрилами-дом от его состава. Показано, что при увеличении доли белка в сополимере до 33 мае. % происходит повышение НКТС. Сополимеры с более высоким содержанием белка вообще не имеют НКТС. Биологическая активность иммобилизованного белка уменьшается с увеличением содержания звеньев Ы,Ы-диэтилакриламида в сополимере.
В последние десятилетия широко изучается проблема создания систем для направленного транспорта лекарственных препаратов в живом организме. Эта проблема весьма актуальна, так как в обычных условиях в пораженный орган попадает не более 10% лекарственного вещества, введенного в организм, и ее решение позволит ввести в обращение многие высокоактивные препараты, не используемые из-за высокой токсичности.
Метод получения таких систем основан на связывании молекул лекарственного вещества с мо-лекулами-векторами, способными транспортировать его в тот или иной орган-мишень. В качестве таких молекул-векторов можно использовать вещества двух различных типов. Во-первых, соединения, обладающие повышенным сродством к пораженному органу: гормоны [1], лектины [2], белки и ферменты [3], гликопротеины [4] и другие олигомерные и макромолекулярные соединения. Во-вторых, вещества, способные избирательно концентрироваться в определенном месте под действием различных внешних факторов, таких как действие магнитного поля [5], изменение рН [6] или температуры [7] и т.д.
В работах [8, 9] нами был предложен новый подход к решению проблемы направленного транспорта лекарственных препаратов белковой природы, который заключается в иммобилизации белков на водорастворимых полимерах с НКТС вблизи 37°С с последующим нагреванием
нужного места в организме до температуры выше НКТС. Полимер выделяется в этом месте в отдельную фазу, концентрируя химически связанный с ним белок. Движущей силой направленного транспорта (диффузии) является градиент химического потенциала, возникающий при изменении температуры.
Естественно, что использование такой "термоактивации", возможно только при соблюдении двух условий. Во-первых, после иммобилизации белка полимер-носитель должен сохранять способность к фазовому переходу при температурах выше НКТС, т.е. осуществлять транспортную функцию. Во-вторых, полимер-носитель не должен оказывать денатурирующее воздействие на молекулу белка при температурах выше НКТС. Так, в работе [9] нами было показано, что если активность трипсина, иммобилизованного на сополимере И-изопропил акрил амида, при температурах выше НКТС практически не отличается от активности нативного фермента, то активность иммобилизованной на том же сополимере, но более склонной к гидрофобной инактивации перок-сидазы хрена резко уменьшается после фазового перехода полимера-носителя.
Вопрос о транспортных возможностях полимера-носителя, т.е. о том, какое количество белка может переносить определенное количество полимера, до сих пор оставался открытым. В связи с этим целью работы является изучение зависимости транспортных функций системы белок-полимер от
Таблица 1. Зависимость состава продуктов сополиме-ризации НПОМ и ДЭАА от состава исходной мономерной смеси
Состав мономерной смеси, НПОМ: ДЭАА, моль/моль ОМ в сополимере, % (±3%) ОМ в геле, % (±3%)
1 :2500 17 19
1 :600 22 6
1 :400 25 2
1 :200 26 -
ее состава. В качестве белка в работе использован овомукоид из белка утиных яиц - гликопротеин, основная биологическая функция которого заключается во взаимодействии с протеолитическими ферментами с ингибированием их активности, а в качестве полимера-носителя - полидиэтилакри-ламид.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Овомукоид из белка утиных яиц (ОМ), выделяли и очищали по методике [10], Ы.М-диэтилакрил-амид (ДЭАА) фирмы "Sigma" (США) использовали без дополнительной очистки.
Сополимеры ОМ и ДЭАА синтезировали радикальной сополимеризацией ДЭАА и ненасыщенного производного овомукоида (НПОМ) в водном растворе. В качестве инициатора использовали окислительно-восстановительную систему персульфат аммония - 1Ч,М,Ы',ГЧ'-тетраметилэтилен-диамин.
Рис. 1. Хроматограмма водорастворимых продуктов сополимеризации ДЭАА с НПОМ.
НПОМ получали путем взаимодействия овомукоида с хлорангидридом акриловой кислоты [11].
Состав продуктов сополимеризации находили с помощью ГПХ на колонке (1.5 х 60 см) с БерЬа-ёех в-100, уравновешенной бидистиллированной водой, предварительно удалив образующиеся в процессе полимеризации гелеобразные продукты. Детектирование осуществляли на спектрофотометре "НкасЫ-4010" (Япония) при длине волны 220 нм.
Антитриптическую активность ОМ определяли по подавлению амидазной активности трипсина по методу Какадэ [12], используя в качестве субстрата и-нитроанилид Ы,а-бензоил-0,¿-аргинина.
НКТС определяли по помутнению 1%-ных растворов сополимеров, регистрируемом на спектрофотометре "НкасЫ-4010" (Япония) при длине волны 500 нм.
ММ сополимеров измеряли методом светорассеяния на приборе "Ма1уегп-4400" (Великобритания) в бидистиллированной воде. В качестве стандарта использовали дважды перегнанный бензол.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Иммобилизованные производные ОМ получали сополимеризацией НПОМ с ДЭАА. Используемое НПОМ содержало четыре-пять связей С=С на молекулу ОМ. При использовании НПОМ с меньшим количеством ненасыщенных связей его конверсия в процессе сополимеризации не превышает 10% [13], а введение в молекулу ОМ большего количества связей С=С приводит к существенному уменьшению его антитриптической активности [10].
Поскольку НПОМ содержит более одной двойной связи, то оно может выступать одновременно и в качестве сшивающего агента. По этой причине наряду с образованием водорастворимых продуктов реакции в процессе сополимеризации происходило образование сшитого геля. При этом чем больше количество НПОМ в исходной мономерной смеси, тем больше образуется сшитого продукта (табл. 1).
Хроматограммы водорастворимых продуктов реакции представлены на рис. 1. Видно, что сопо-лимеризация приводит к образованию как сополимеров ОМ с ДЭАА (пик I), так и гомополимера ДЭАА (пик П1). Последнее обусловлено большим мольным избытком ДЭАА и особенностями протекания сополимеризации макромономеров с низкомолекулярными мономерами в присутствии
Таблица 2. Зависимость состава сополимера ОМ и ДЭАА и его ММ от состава исходной мономерной смеси
Состав мономерной смеси НПОМ: ДЭАА, моль/моль Состав сополимера НПОМ: ДЭАА, моль/моль ^и-исх х Т < НКТС (±5%) ппед. х «Г*, Т> НКТС (±5%)
1 :2500 1 :2500 45.5 1000.0
1 : 1250 1 : 1000 - -
1 :600 1 :510 18.5 140.0
1 :400 1 :280 13.3 57.0
1 :200 1: 130 10.2 370.0
больших количеств инициатора [13]. Пик П соответствует непрореагировавшему ОМ. Молекулярная масса синтезированных сополимеров составляет (1.0-4.5) х 105 (табл. 2). Зная ММ и состав сополимеров, легко убедиться, что каждая макромолекула сополимера содержит в среднем одну-две молекулы ОМ.
Зависимость НКТС от состава синтезированных сополимеров представлена в табл. 3. Видно, что при увеличении доли ОМ в сополимере до 0.2 мол. % (33 мае. %) (НПОМ : ДЭАА = 1 : 500) происходит повышение НКТС. Сополимеры с более высоким содержанием ОМ вообще не имеют НКТС и полностью растворимы в воде в широком температурном интервале. Аналогичная зависимость была обнаружена в работе [8] для сополимеров М-изопропилакриламида с акриламидом.
Оценка методом светорассеяния эффективной ММ сополимеров при различных температурах показала (рис. 2), что с повышением температуры ММ сначала не изменяется, а затем в некотором температурном интервале из-за взаимодействия макромолекул сополимера между собой измеряемая ММ нарастает до определенного предельного значения, величина которого приведена в табл. 2.
Наблюдаемое явление скорее всего объясняется "дифильностью" сополимеров при температурах выше НКТС. Полидиэтилакриламидные фрагменты при расслоении гидрофобны и стремятся сформировать новую фазу, в то же время ОМ сохраняет высокое сродство к воде при температурах как ниже, так и выше НКТС полиди-этилакриламида. В этом случае хорошо просматривается наличие двух противодействующих сил,
одна из которых способствует слипанию макромолекул сополимера с конформационно измененными ПДЭАА-фрагментами, а другая предотвращает процесс ассоциации за счет солюбилизирую-щего эффекта. Для изученной системы визуально наблюдаемое расслаивание раствора сополимера происходит в случае образования ассоциатов из более, чем четырех макромолекул (табл. 2,
пред/^и' исх)-
Антитриптическую активность входящего в состав сополимера ОМ оценивали путем измерения остаточной активности трипсина после его взаимодействия с сополимерами. Результаты изучения представлены в табл. 4. Видно, что с увеличением содержания звеньев ДЭАА в сополимере удельная активность ОМ уменьшается, и при содержании ОМ 0.04 мол. % его активность составляет около 55% от активности исходного НПОМ.
Таблица 3. Зависимость НКТС сополимеров от их состава
Состав сополимера НПОМ: ДЭАА, моль/моль НКТС, °С (±0.5°)
Гомополимер ДЭАА 26
1 : 2500 28.5
1 : 1000 30.5
1 :510 32
1 :280 Отсутствует
1 : 130 »
Mw х 10"5
Рис. 2. Зависимость ММ сополимера НПОМ с ДЭАА (ДЭАА : НПОМ = 510 : 1) от температуры.
Причиной такой зависимости, вероятно, является экранирование активных центров ОМ с фрагментами ПДЭАА, которое приводит к затруднению образования комплекса ОМ-трипсин. При этом очевидно, что чем длиннее будут фрагменты ПДЭАА, тем большее влияние они будут оказывать. Отсюда следует, что для максимального сохранения активности НПОМ после его со-полимеризации с ДЭАА следует создавать короткие олигомерные фрагменты диэтилакриламида. Однако, как показано выше, такие низкомолекулярные цепи ПДЭАА не обладают способностью к фазовому переходу при повышении температуры и, следовательно, не могут обеспечить термонаправленного транспорта всей системы.
Таким образом, полученные в работе результаты наглядно демонстрируют, что для сохранения высокой активности иммобилизованного белкового препарата по отношению к высокомо-
Таблица 4. Зависимость активности ОМ, входящего в состав сополимера с ДЭАА, от его состава
Состав сополимера НПОМ: ДЭАА, моль/моль Антитриптическая активность ОМ, % от НПОМ (±5%)
1 :2500 55
1 :510 75
1 :280 81
1 : 130 84
лекулярным субстратам необходимо минимизировать количество полимера-носителя. В то же время следует иметь в виду, что для каждой системы направленного транспорта существуют предельные соотношения между обоими компонентами. Для изученной системы увеличение количества белка в сополимере выше 0.2 мол. % (33 мае. %) приводит к тому, что полученные системы теряют способность к транспорту при изменении температуры.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yoless S., Morton Т.F., Sartori MF. // J. Polym. Sei. 1979. V.17.N» 12. P. 4111.
2. Anderson R.G., Brown M.S. //J. Cell. Biol. 1981. V. 88. №3. P. 441.
3. Yamamoto K., Katsuda N., Kato K. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 92. № 5. P. 499.
4. Kopechek J„ Kopechkova-Reimanova P. // J. Chro-matogr. Biomed. Appl. 1986. V. 376. № 1. P. 221.
5. Плявинь Ю.А., Блум Э.Я. // Магнитная гидродинамика. 1983. № 4. С. 3.
6. Brannon-Peppas L., Peppas NA. HS. Contr. Release. 1989. V. 8. № 2. P. 267.
7. Li X., Bennet O B., Adams N.W., Kim S.W. // Polym. Prepr. 1990. V. 31. № 2. P. 198.
8. Валуев Л.И., Зефирова О.Н., Обыденова И.В., Платэ H.A. // Высокомолек. соед. А. 1993. Т. 35. № 1. С. 83.
9. Валуев JIM., Чупов В.В., Валуева Т.А., Ванчуго-ва Л.В., Синани В А., Ноа О.В., Платэ H.A. // Высокомолек. соед. А. 1991. Т. 33. № 1. С. 75
10. ВанчуговаЛ.В., Валуева Т.А., Валуев Л.И., Ромашкин В.И., Розенфельд М.А., Мосолов В.В., Платэ H.A. // Биохимия. 1988. Т. 22. № 8. С. 1455.
11. Платэ H.A., Валуев Л.И., Егоров Н.С., Аль-Ну-ри М.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 1977. Т. 13. № 5. С. 673.
12. Kakade ML., Simons М., Liener Y.E. // Cereal Chem. 1969. V. 46. № 5. P. 518.
13. Платэ H.A., ВалуевЛ.И., Чупов B.B. // Высокомолек. соед. А. 1980. Т. 22. № 9. С. 1963.
Transport Functions of an Albumin-Poly(diethylacrylamide) System
I. L. Valuev, A. A. Antipov, I. V. Obydennova, I. M. Shanazarova, M. A. Rozenfel'd, L. I. Valuev, and N. A. Plate
Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis, Russian Academy of Sciences, Leninskii pr. 29, Moscow, 117912 Russia
Abstract—The effects of composition of the albumin-N,N,-diethylacrylamide copolymer on its LCST and biological activity were studied. It was shown that as the fraction of albumin in the copolymer grows to 33 wt %, LCST increases. Copolymers with a higher content of albumin show no LCST. The biological activity of immobilized albumin decreases as the content of N,N-diethylacrylamide units in the copolymer grows.
