CC BY
40
■■■ ■ I I I I I I I -ф- I ■ ■ HI
Новости клеточных технологий
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток и генная терапия в лечении пациентов, инфицированных ВИЧ
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) проникает в Т-хелперы, связываясь сначала с рецептором CD4, а затем с одним из хемокиновых рецепторов, CCR5 либо CXCR4. Люди, гомозиготные по аллели с делецией 32-Ьр (так называемая делеция delta32/delta32) гена CCR5, имеют рецептор CCR5 с нарушенной конформацией и обладают естественной резистентностью к инфицированию ВИЧ-1 [1]. Логично предположить, что трансплантация гемопоэтических клеток с delta32/delta32-re-нотипом пациенту, инфицированному ВИЧ, способна привести если не к полному излечению, то, по крайней мере, к стойкому восстановлению иммунного статуса за счет появления в организме невосприимчивых к ВИЧ Т-лимфоцитов. Тем не менее, подобных трансплантаций до настоящего времени практически не проводилось [2], а трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пациентам с ВИЧ без учета генотипа рецептора CCR5 не приводили к изменению состояния больных [3]. Недавно в журнале The New England Journal of Medicine было опубликовано сообщение группы G. Huetter об аналогичной трансплантации ГСК, с аллелями delta32/delta32, пациенту с ВИЧ.
Помимо ВИЧ у 40-летнего пациента был диагностирован острый миелобластный лейкоз (ОМЛ). Пациент проходил курс HAART-терапии (highly active antiretroviral therapy), которая включает сильнодействующие противовирусные препараты и зачастую имеет серьезные побочные эффекты [4], а также со временем может приводить к развитию у вируса лекарственной устойчивости. На фоне противовирусной терапии РНК ВИЧ в периферической крови пациента не обнаруживалась, однако в связи с токсическими эффектами химиотерапии протокол HAART пришлось приостановить, в результате чего содержание РНК вируса в крови возросло до 6,9хЮ8 копий/мл.
После курса миелоаблативной химиотерапии пациенту была проведена трансплантация CD34+ клеток от неродственного HLA-совместимого донора, гомозиготного по аллели гена CCR5 delta32/delta32. Количество
х
[5]. Через 13 сут. у пациента было отмечено приживление трансплантата и восстановление показателей крови до нормы. Однако спустя 11 мес. был диагностирован рецидив ОМЛ, и количество донорских клеток в крови снизилось до 15%. После этого был проведен повторный курс химиотерапии и радиотерапии с миело-аблацией, а также трансплантация ГСК от того же донора.
х
процедура привела к ремиссии, которая продолжалась в течение 20 мес.
После трансплантации в периферической крови пациента перестали определяться антитела к полимеразе и к белкам капсида ВИЧ-1, хотя антитела к вирусным
гликопротеинам др120 и гликопротеинам др41 продолжали выявляться. Тем не менее, исследование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) не выявило в крови РНК ВИЧ-1. Клиницисты также исследовали био-птаты слизистой оболочки прямой кишки больного, полученные на 5 мес. после трансфузии. CD4+ лимфоциты слизистой оболочки кишечника несли на плазмалемме дефектный рецептор CCR5, не способный связывать вирус. Нормальный рецептор CCR5 сохранялся на макрофагах, однако, следует заметить, что некоторые макрофаги являются долгоживущими клетками, которые могут оставаться резервуаром инфекции в течение длительного времени.
Авторы работы не выявили ухудшения состояния пациента в течение всего срока наблюдения, а также появления в организме детектируемой РНК вируса. Это более чем обнадеживающий результат, однако, приходится констатировать, что практика подобных трансплантаций вряд ли может стать рутинным клиническим методом. Подбор HLA-совместимого донора сам по себе — сложная процедура, которая в данном случае дополнительно усложняется поиском донора, гомозиготного по аллели гена CCR5 delta32/delta32. Авторы работы указывают, что из 62 совместимых доноров, зарегистрированных в Немецком Центре Доноров Костного Мозга (German Bone Marrow Donor Center), только один оказался носителем искомой мутации. Помимо этого, сам вирус иммунодефицита не всегда использует для проникновения в клетку рецептор CCR5, и существует менее часто встречающийся тип вируса (Х4), использующий в качестве корецептора молекулу CXCR4. Более того, обычно в крови пациентов с ВИЧ обнаруживаются одновременно разные штаммы вирусов [6]. В данном случае у пациента в сыворотке крови были выявлены следовые количества РНК ВИЧ-1 типа Х4, однако они, по-видимому, не повлияли на исход лечения, и пациент смог отказаться от высокотоксичной HAART-терапии.
Помимо единичных попыток трансплантации ГСК с целью восстановления нормального лимфопоэза, в настоящее время проводятся полноценные клинические исследования, основанные на том же принципе — создание в организме пациента пула невосприимчивых к ВИЧ-1 Т-лимфоцитов.
Практически одновременно с результатами описанного клинического случая в журнале Nature Medicine были опубликованы результаты второй фазы клинических испытаний трансплантации генетически модифицированных аутогенных ГСК пациентам с ВИЧ. Данная работа была проведена группой R.T. Mitsuyasu и является первым рандомизированным, двойным слепым, плацебо-контролируемым клиническим исследованием, в которое были включены 74 пациента (38 пациентов в исследуемой и 36 пациентов в контрольной группах).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
I I I I I I
Новости клеточных технологий
У пациентов из исследуемой группы после курса терапии HAART была проведена мобилизация ГСК из костного мозга, после чего CD34+ клетки были собраны из периферической крови и трансдуцированы геном ри-бозима OZ1, специфически расщепляющего РНК ВИЧ. После было выполнено обратное введение клеток в кровоток. Пациенты из контрольной группы получили трансфузию аутогенных CD34+ клеток, не трансдуцированных геном рибозима.
Ранее в нескольких исследованиях было показано, что OZ1 ингибирует репликацию ВИЧ-1 in vitro, причем при длительном культивировании у вируса не развивается резистентность к его действию [7-10]. В двух клинических испытаниях I фазы было продемонстрировано, что трансплантация аутогенных ГСК либо CD4+ лимфоцитов, трансдуцированных геном OZ1, является безопасной процедурой [11, 12]. После трансплантации у пациентов не наблюдалось негативных побочных эффектов как в раннем, так и в позднем посттранспланта-ционном периоде. Авторы клинического исследования предположили, что собственные ГСК, трансдуцирован-ные геном OZ1, дадут начало популяциям миелоидных
и лимфоидных клеток, в которых вирус не сможет реплицироваться [8].
Доля Сй34+ клеток, трансдуцированных геном 071, составляла 54% от общего количества трансплантированных пациентам из исследуемой группы ГСК. После трансплантации пациентов наблюдали в течение 46 мес., оценивая присутствие в их периферической крови про-вирусной ДНК ВИЧ, активной РНК-формы рибозима 071, абсолютное количество Сй4+ лимфоцитов в крови, а также функцию тимуса (ТРЕС-анализ).
Спустя 1 мес. после трансплантации у 94% пациентов исследуемой группы в крови обнаруживалась ДНК 071, однако со временем этот показатель сильно снижался (до 7% через 3 мес.). Через 1,5 мес. у этих пациентов отмечалось статистически недостоверное снижение титра вируса в крови в сравнении с пациентами из контрольной группы. Также была отмечена слабая корреляция между снижением количества РНК-копий ВИЧ-1 в крови и дозой трансплантированных клеток, и, хотя данные оказались статистически недостоверны, подобной корреляции в контрольной группе отмечено не было.
Схематичное изображение взаимодействия ВИЧ и Т-хепперов у людей с нормальным геном ССЯ5 и с делециями с!ека32/с1еИа32
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
35
На 3 мес. наблюдения различия между контрольной и исследуемой группами стали статистически значимыми. У пациентов, получивших инфузию 0Z1-трансдуцированных клеток, количество РНК-копий вируса в крови было существенно меньше, чем у пациентов, получивших инфузию нетрансдуцированных ГСК. После трансплантации к 3-му мес. 45% пациентов (17 человек) из исследуемой группы были вынуждены возобновить терапию HAART, однако в контрольной группе этот показатель оказался выше — 61% (22 человека). Пациенты из исследуемой группы вернулись к приему противо-ретровирусных препаратов позже, чем в контрольной группе — через 15 мес., в отличие от пациентов контрольной группы — примерно через 7,5 мес. Абсолютное количество CD4+ лимфоцитов в мкл крови у пациентов из OZ1 -группы было к 3 мес. также выше, чем у пациентов из группы контроля и составило 490 и 441 клеток соответственно (у здорового человека этот показатель составляет от 500 до 1600 клеток в мкл).
Более чем скромные результаты, возможно, были связаны с тем, что перед трансплантацией пациентам не была проведена миелоаблативная химиотерапия, и в результате в организме постоянно присутствовали клетки, служившие резервуаром инфекции. При этом не происходило замещение инфицированных клеток 071 -продуцирующими, поскольку ГСК, не экспрессирующие 071, оставались в костном мозге, и их процент, в сравнении с долей трансдуцированных ГСК, оставался значительно более высоким. В то же время о применении химиотерапии на фоне противоретровирусной терапии говорить сложно, поскольку это может повлечь за собой тяжелые побочные эффекты, угрожающие жизни пациента. Тем не менее, данное клиническое исследование показывает перспективность применения генной терапии для лечения пациентов с ВИЧ, а его результаты указывают на необходимость совершенствования данного метода, что также подтверждается уникальным результатом, о которых сообщает группа В. Ниейег.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Liu R., Paxton W.A., Choe S. et al. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiplyexposed individuals to HIV-1 infection. Cell 1996; 86: 367-77.
2. Ayash L.J., Ratanatharathorn V., Braun T. et al. Unrelated donor bone marrow transplantation using a chemotherapy-only preparative regimen for adults with high-risk acute myelogenous leukemia. Am. J. Hematol. 2007; 82: 6—14.
3. Huzicka I. Could bone marrow transplantation cure AIDS? Med. Hypotheses 1999; 52: 247—57.
4. Taylor B.S., Sobieszczyk M.E., McCutchan F.E., Hammer S.M. The challenge of HIV-1 subtype diversity. N. Engl. J. Med. 2DD8; 358: 1590—602.
5. Schmid C., Weisser М., Ledderose G. et al. Dosereduced conditioning before allogeneic stem cell transplantation: principles, clinical protocols and preliminary results. Dtsch. Med. Wochenschr. 2002; 127: 2186—92.
6. Skrabal K., Low A.J., Dong W. et al. Determining human immunodeficiency virus coreceptor use in a clinical setting: degree of correlation between two phenotypic assays and a bioinformatic model. J.
Clin. Microbiol. 2007; 45: 279-84.
7. Fanning G., Amado R., Symonds G. Gene therapy for HIV/AIDS: the potential for a new therapeutic regimen. J. Gene Med. 2003; 5: 645—53.
8. Macpherson J.L., Ely J.A., Sun L.Q., Symonds G.P. Ribozymes in gene therapy of HIV-1. Front. Biosci. 1999; 4: D497— D505.
9. Sun L.Q., Wang L., Gerlach W.L., Symonds G. Target sequence-specific inhibition of HIV-1 replication by ribozymes directed to tat RNA. Nucleic Acids Res. 1995; 23: 2909—13.
10. Wang L., Witherington C, King A. et al. Preclinical characterization of an anti-tat ribozyme for therapeutic application. Hum. Gene Ther. 1998; 9: 1283-91.
11. Macpherson J.L., Boyd M.P., Arndt A.J. et al. Long-term survival and concomitant gene expression of ribozyme-transduced CD4 1 T lymphocytes in HIV-infected patients. J. Gene Med. 2005; 7: 552—64.
12. Amado R.G., Mitsuyasu R.T., Rosenblatt J.D. et al. Anti—human immunodeficiency virus hematopoietic progenitor celldelivered ribozyme in a phase I study: myeloid and lymphoid reconstitution in human immunodeficiency virus type-1—infected patients. Hum. Gene Ther. 2004; 15, 251—62.
Подготовила А.С. Григорян
По материалам: Huetter G„ Nowak D., Mossner M. et al. Long-term control of HIV by CCR5 delta32/delta32 stem-cell
transplantation. The New England Journal of Medicine 2009; 360: 692-8, Mitsuyasu R.T., Merlgan T.C., Carr A. et al. Phase 2 gene therapy trial of an anti-HIV ribozyme
In autologous CD34 cells. Nature Medicine 2009; 15:285-292.
Новый подход в формировании доступа к кровеносному руслу при гемодиализе
Паллиативное лечение пациентов с декомпенсирован-ной острой или хронической почечной недостаточностью, особенно осложненной энцефалопатией, перикардитом и полинейропатией, включает гемодиализ — метод выведения токсических веществ из организма и коррекции водно-электролитного и кислотно-основного равновесия, основанный на ультрафильтрации крови [1]. Для его проведения необходимым является стабильный доступ к сосудистому руслу, пригодный для еженедельного многолетнего использования, что определяет, во многом, успешность процедуры гемодиализа [2]. В качестве доступов к сосудам верхней или нижней конечностей применяются артериовенозные фистулы или анастомозы, соединяющие близлежащие артерию и вену и в виде
петли укладывающиеся подкожно. В качестве анастомозов используют как аутотрансплантаты сосудов, так и стенты из искусственных материалов (например, по-литетрофлуороэтиленовые трубки [1]). В послеоперационном периоде происходит так называемое «созревание» доступа, которое включает сращение сосудистых швов и аневризмоподобное расширение вены в области фистулы (через 3^6 мес. после операции) или трансплантированного анастомоза (1—1,5 мес.). В это время показано выполнение гемодиализа через катетеры, использование которых на постоянной основе невозможно в виду недостаточного диаметра и частых осложнений (тромбозы, кровотечения). Широкий диаметр доступа к сосудистому руслу обеспечивает адекватную скорость
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
