CC BY
24
УДК 616.981.51:621.385.833
Н.П.Коннов1, Ю.П.Волков1, А.Ю.Корсакова1, Т.В.Данилова2, Н.И.Микшис1, А.О.Мантуров2,
О.С.Кузнецов1, Ю.А.Попов1, М.Н.Киреев1
ТРАНСМИССИОННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ И СКАНИРУЮЩАЯ СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БЕЛКОВ Б-СЛОЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
1Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
Саратовский государственный технический университет
Проведено исследование белков Б-слоя сибиреязвенного микроба методами трансмиссионной электронной (ТЭМ) и сканирующей атомно-силовой микроскопии (АСМ). Для анализа скрытого изображения структуры белков применен метод прямого преобразования Фурье, показавший строго выраженную периодичность и волнообразную симметрию наноструктур исследуемого объекта. АСМ позволила наблюдать трехмерную наноструктурную организацию белков.
Последние два десятилетия исследователи, работающие в области микробиологии и инфекционной иммунологии, уделяют пристальное внимание Б-слоям как грамположительных, так и грамотрица-тельных микроорганизмов [3, 7, 9, 12, 13].
Такой интерес обусловлен тем, что Б-слои, составляющие приблизительно 10 % бактериального белка, являются компонентами сложной поверхностной клеточной организации, функциональная роль которых определяется специфическим взаимодействием с ассоциированными надмолекулярными структурами.
Б-слой представлен протеиновыми или глико-протеидными субъединицами, регулярно расположенными на поверхности клетки, их молекулярная масса колеблется от 40 до 200 кДа [5]. Субъединицы 8-слоя располагаются с высокой плотностью (до 5-105 на клетку) на поверхности бактерий в виде паракристаллических моно- или многослойных сетей, имеющих гексагональную (рб), тетрагональную (р4) или наклонную (р2) симметрию [8].
Существенный вклад в изучение тонкой организации Б-слоев внесли исследования с использованием методов ТЭМ [6, 9, 13] и АСМ [4].
Современные ТЭМ достигают разрешения 0,19-0,2 нм, однако биологические объекты не могут исследоваться с таким разрешением, поскольку они слабо рассеивают и поглощают электроны. Необходимость их фиксации, контрастирования, неоднородное проникновение контрастирующего вещества внутрь структуры, его деформирующее действие, неустранимые приборные ограничения (связанные со сферической аберрацией), являются препятствиями изучения наноструктур биологических объектов.
Необходимость в высоком разрешении привела к разработке новых приемов и методов. Особое место занимают вопросы трактовки электронно-микроскопических изображений, для чего разработаны физические и математические методы обработки информации [2, 3]. Наиболее распространенным является метод преобразования Фурье, представляющий распределение амплитуд изображения исследуемого объекта в виде суммы пространственных гармонических колебаний, отличающихся перио-
дом, амплитудой и фазой. Это позволяет обнаруживать и выделять скрытые периодичности в исследуемом объекте, что особенно важно для изучения паракристаллических структур типа S-слоев.
Здесь мы ограничимся лишь кратким изложением преобразования Фурье, применимым к изучению белков S-слоя сибиреязвенного микроба.
Исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба проводилось на бесплазмидном протеазо-негативном производном вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2 ДТ (Prt~). Выделение и очистку белка Sap проводили согласно процедуре J.Farchaus et al. [11]. Белок ЕА1 выделяли по модифицированной методике J.Ezzell и G.Abshire [10]. Перед электронной микроскопией дополнительно проводили диализ очищенных препаратов белков Sap и ЕА1, против 10 объемов раствора: 10 мМ K2HPCVKH2PO4; 2мМЭДТА; 0,1 мМ фенилметил-сульфонилфторид (ФМСФ) pH 8,0 - в течение 12 ч при температуре 4 °С, затем диализовали против 70 объемов раствора: 5 мМ ацетата натрия; 1 мМ ЭДТА; 0,1 мМ ФМСФ (pH 5,0) - в течение 12 ч при температуре 4 °С. Очищенный диализом препарат центрифугировали 30 мин при 12000 об/мин и температуре 5 °С, осадок ресуспендировали в диализном буфере и разводили 1:10 тем же буфером. Подготовленный таким образом препарат наносили на сетку с углеродной подложкой и высушивали в течение 15-20 мин. Окрашивали 1,5% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) или 2 % раствором уранил-ацетата в течение 1,5-2 мин. Препараты просматривали на электронном микроскопе Hitachi HU-12A (Япония). При изучении белков с помощью АСМ изучаемый материал наносился на свежий скол слюды. После подсыхания белка препарат сканировался в режиме постоянной силы (2,6-10'9 Н).
При просмотре препаратов белка в ТЭМ обнаруживались мелкие решетчатые структуры размером 7x9 нм со строго выраженной наклонной симметрией (рис. 1, а, б).
Для более детального исследования пространственной наноструктурной организации изображения белков S-слоя был применен метод прямого преобразования Фурье, позволяющий выявить
Рис. 1. Электронограммы препаратов белков Sap (а) и ЁА1 (б), выделенных из штамма В. anthrcicis Sterne 34F2 ДТ (Rrt~) после диализа и негативного контрастирования '
Рис. 2. График спектров мощности изображений S, и S2
скрытое изображение в исследуемом объекте. Фрагмент исходного изображения белка (рис. 1, а) был отсканирован и представлен в виде точечного рисунка с разрешением 2200x1846 точек на Дюйм. Цвет каждой точки соответствовал определенному значению интенсивности в диапазоне от 0 до 255 (от черного цвета к белому). Каждая строка полученного точечного рисунка рассматривалась как дискретная последовательность X;. Путем поворота 5, на 90 градусов было получено изображение Бг- 1
Для изображений 8| и 82 был рассчитан Фурье-спектр мощности, определенный как 1
1 м-\
а* = мЪв'
где С, - Фурье-спектр мощности г'-й строки, М-количество строк в изображении.
О, (к) = X х,. {п)е-^1Ы)"к, (к = 0,1,2,..., Л -1)
л=0
у .
где С, (к) - значение к-й составляющей спектра /-й строки, N - количество точек в строке, Х{(п)-значение п-й составляющей г-й строки.
Полученные спектры мощности изображений Б| и Б2 представлены на рис. 2. По горизонтали от-
ложено ■ значение - пространственной частоты в мкм”1. Полученные величины соответствуют характерным линейным размерам рассматриваемого объекта.
На графике спектра мощности S2 отчетливо выражены локальные максимумы Р,, Р2, Рз, Р4 в диапазонах 100,2—100,7; 99,6-99,8; 99,2—99,4; 98,2-98,6 мкм"1.
Изображение S2 было подвергнуто полосовой фильтрации в диапазонах частот, соответствующих локальным максимумам. Полученные в результате фильтрации изображения представлены на рис. 3.
ТЭМ-исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба, с использованием преобразования Фурье, дает наглядную картину их наноструктур со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.
ACM. является уникальным прибором, дающим трехмерное изображение поверхности неконтрасти-рованных биологических объектов с нанометровым разрешением в условиях, близких к таковым in vivo [1]. На АСМ-изображениях отчетливо видны параллельные ряды упорядоченных линейных цепочек белков с высотами 2-3 нм для белка Sap (рис. 4, а) и 7-8 нм для ЕА1 (рис. 4, б).
Таким образом исследование белков сибиреязвенного микроба методами ТЕМ и ACM показало хорошую корреляцию, симметричность и упорядо-
а б в г
Рис. 3. Результат полосовой фильтрации.изображения 32 в диапазоне частот: а) 100,2-100,7 мкм-1 (локальный максимум Р, на рис. 2); б) 99,6-99,8 мкм-1 (локальный максимум Р2 на рис. 2); в) 99,2-99,4 мкм-1 (локальный максимум Р3 на рис. 2); г) 98,2-98,6 мкм"1 (локальный максимум Р4 на рис. 2)
Рис. 4. АСМ-изображение препаратов белков Sap (а) и ЕА1 (б), выделенных из штамма В. anthracis Sterne 34F2 ДТ (Prf) после диализа и высушивания на поверхности слюды (сила взаимодействия острия и поверхности 2,6 нН). Размеры участков сканирования составляют 60x60 нм (а) и 100x500 нм (б)
ченность наноструктуры образуемых ими слоев. Полученные данные согласуются. с результатами, приведенными в статье [9].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Байбурин В.Б., Волков Ю.П., Коннов Н.П. Многофункциональный комплекс сканирующей зондовой микроскопии и его применение. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - 120 с. - 2. Вайнштейн Б.К. Электронная микроскопия атомного разрешения // УФН. - 1987. - Т. 152. - С. 75-122,- 3. Иваницкий Г.Р., Кринский В.И., Сельков Е.Е. Математическая биофизика клетки. - М.: Наука. - 1978. -308 с. - 4. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков .Ю.П. и др.// Пробл. особо опасных инф. - 2002. - Вып.' 1(83). -С. 90-96. - 5. Северина JI.O. // Микробиология.- 1995.-Т. 64, №6. - С. 725-733. - 6. Austin J.W., Stewart М., Murray R. //J. Bacteriol. - 1990. - Vol. 172, N 2. - P. 808-817. -7. В ah I H., Scholz H., Bayan N. et al. If FEMS Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 20. - P. 47-98. - 8. Caston J.R., Beren-guer J., Kocsis E. et al. Hi. Struct. Biology. - 1994. - Vol. 113, N2. - P. 164-176,- 9. Couture-Tosi E., Delacroix H., Mignot T. et al.lt J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, N23. -P. 6448-6456. - 10. Ezzell J., Abshire T. // Infect. Immun. -
1988. - Vol. 56, N 2. - P. 349-356. - 11. Farchaus J., Ribot W., Downs M. et al. H J. Bacteriol. - 1995. - Vol. 177. -P. 2481-2489. - 12. Mock М., Fouet A. // Microbiol. Rev. -2001.-Vol. 55.-P. 647-671.- 13. Sleytr U., Messner P.//J. Bacteriol.- 1998.-Vol. 170.-P. 2891-2897.
N.P.Konnov, Yu.P.Volkov, A.Yu.Korsakova, T.V.Danilova, N.I.Mikshis, A.O.Manturov, O.S.Kuznetsov, Yu.A.Popov, M.N.Kireyev 1
Transmission Electron and Scanning Power Microscopic Studies of Bacillus anthracis S-Layer Proteins
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov;
Saratov State Technical University
S-layer proteins of the anthrax pathogen were studied using the methods of transmissive electron microscopy (ТЕМ) and scanning atom-power microscopy (АРМ). To analyse the hidden image of the protein structure, the direct Fourier transform method was used which elucidated strictly expressed periodic nature and wave-like symmetry of the nanostructures. Three-dimensional nanostructural organization of the proteins could be seen by means of the АРМ procedure.
Поступила 15.03.04.
УДК 616.932:616.988.21 ■
В.В.Лобанов, B.B.Сухарь, Н.И.Пасюкова, А.В.Миронова
ГИДРОФОБНОСТЬ VIBRIO CHOLERAE И КОЛОНИЗАЦИЯ КИШЕЧНИКА
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Представлены данные, свидетельствующие о множественности факторов, причастных к колонизации кишечника холерными вибрионами. Адгезию и колонизацию во многом определяют их гидрофобные свойства. Прилипание вибрионов к эпителию тонкой кишки осуществляют, видимо, пили адгезии, а к слизи - гидрофобные группировки липополисахарида. R-мутанты, вследствие высокой чувствительности к комплементу, не способны размножаться в тонком кишечнике новорожденных мышей и крольчат, но способны задерживаться в толстой кишке, по крайней мере, 24 ч.
Колонизация тканей животных микроорганиз- с адгезии бактерий к слизи и затем к тканям-мише-
мами является важным моментом инфекционного ням, что позволяет относить адгезины к факторам
процесса. При кишечных инфекциях она начинается патогенности [4, 5]. Для неинвазивных энтеропато-
