CC BY
32
Патология кровообращения и кардиохирургия (2015) Т. 19. № 3. С. 110-113
оригинальные статьи
Нейрохирургия
Транскрипционная активность CSPG4/NG2
как прогностический маркер послеоперационного
течения глиобластом
Цидулко А.Ю.1, Кобозев В.В.2, Волков А.М.2, Костромская Д.В.2, Айдагулова С.В.3, Киселев R.C.3, Прудникова Т.Ю.1, Кривошапкин А.Л.2, 4
1 ФГБНУ «Научно-исследовательский молекулярной биологии и биофизики», 630117, Россия, Новосибирск, ул. Тимакова, 2/12; 2 ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт имени академика Е.Н. Мешалкина» Минздрава России, Россия, 630055, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15; 3 ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 630091, Россия, Новосибирск, Красный проспект, 52 4 Европейский медицинский центр, 129090, Россия, Москва, ул. Щепкина, 35
УДК 616.8-089
Поступила в редакцию 15 июня 2015 г. Принята к печати 27 июля 2015 г.
Введение
Материал и методы
Глиобластома - злокачественная опухоль головного мозга, характеризующаяся выраженным инвазивным ростом и неблагоприятным прогнозом. В опухолях происходит изменение экспрессии многих генов, в частности гена СЗРС4/ЫС2, играющего значительную роль в пролиферации опухолевых клеток глиобластомы и неоваскуляризации опухоли. До сих пор остается неясной возможность его использования как маркера прогноза лечения новообразования.
Проведено клиническое и молекулярно-биологическое исследование 8 пациентов с диагнозом «Глиобластома». Образцы опухолей фиксировали в растворе КЫА-^ег (1-^еТесНпо1о§1е5, США). Экспрессии СЗРй4/ Ый2 и Сй44 оценивали с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени; в качестве контрольного гена использовали СЛРйЧ. Пациентов разделили на две группы по показателю постоперационной выживаемости: группа 1 - выживаемость менее 1 года, группа 2 - выживаемость более 1 года после удаления опухоли.
Молекулярно-биологические исследования показали значительное увеличение уровня экспрессии СБРС4/ Ый2 в опухолях пациентов 1-й группы (в среднем в 4 раза) по сравнению с уровнем экспрессии в опухолях 2-й группы. Также продемонстрировано, что повышение экспрессии СЗРС4/ЫС2 в опухолях с плохим прогнозом положительно коррелирует (коэффициент Пирсона 0,9514) с увеличением уровня маркера раковых стволовых клеток Сй44 в тех же клинических образцах.
ВыВОды Полученные данные демонстрируют перспективу использования СЗРС4/ЫС2 для определения оптимально-
го постоперационного лечения пациентов с глиобластомой.
Результаты
Ключевые слова Глиобластома • Ген CSPG4/NG2 • Хондроитинсульфат протеогликан • Прогноз заболевания
Глиобластома - наиболее злокачественная из гли-альных опухолей головного мозга со средней продолжительностью жизни после оперативного лечения 4-12 мес. [1, 4]. В злокачественных опухолях головного мозга происходит изменение экспрессии большого числа генов. Ранее исследователи продемонстрировали использование С5РС4/ЫС2 для прогноза течения заболевания других видов злокачественных новообразований. Установлено, что С5РС4/ЫС2 ассоциирован с плохим прогнозом острого миелоидного лейкоза [5],
рака молочной железы [3] и меланомы [7]. Однако для опухолей мозга этот вопрос остается малоизученным.
Для различных видов рака известно, что агрессивность опухоли зачастую определяется содержанием в ее составе опухолевых стволовых клеток. Авторы высказывали гипотезу, что и для глиобластом повышенная агрессивность также может быть связана с содержанием стволовых клеток в опухоли [6]. Известный молекулярный маркер стволовых клеток различных опухолей -хондроитинсульфат протеогликан С044 - рецептор
Для корреспонденции: Цидулко Александра Юрьевна, alexandra.tsidulko@gmail.com, тел.: +7 (383) 333-50-11
Таблица 1 Праймеры, использованные для полимеразной цепной реакции
Ген Последовательность Температура плавления, °C
CSPG4ING2 F 5'-TATGTTGGCCAGACTTGCAT-3' R 5'-TGCAGGTCTATGTCGGTCAG-3' 59 59
CD44 F 5'-GACAAGTTTTGGTGGCACG-3' R 5'-CACGTGGAATACACCTGCAA-3' 59 59
GAPDH F 5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' R 5'-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3' 59 59
гиалуроновой кислоты, а также, возможно, некоторых других лигандов. Поэтому определение уровня €044 может характеризовать содержание стволовых клеток в конкретной опухоли.
Целью исследования являлось изучение уровня экспрессии гена €5РС4/ЫС2 в глиобластоме на транскрипционном уровне, его взаимосвязи с содержанием €044, тяжестью течения заболевания и возможности использования в качестве прогностического маркера для оптимизации послеоперационного лечения пациентов с такой патологией.
Материал и методы
В центре ангионеврологии и нейрохирургии ФГБу «Новосибирский научно-исследовательский институт имени академика Е.Н. Мешалкина» Минздрава России прооперировали 8 пациентов по поводу глиобластомы головного мозга - Сг.4. Пациентов разделили на две группы по показателю постоперационной выживаемости: 5 пациентов (группа 1) - выживаемость менее 1 года и 3 пациента (группа 2) с выживаемостью более 1 года после удаления опухоли [4]. От каждого пациента получено по одному образцу ткани опухоли. Образцы фиксировали в растворе ЯЫА-^ег (^еТесИпо^еэ, США) согласно инструкции производителя и хранили при температуре -20 °С.
Для выделения суммарной РНК образцы замораживали в жидком азоте и гомогенизировали. Выделение РНК проводили с использованием реагента TRIzol (LifeTechnologies, США) с дальнейшей дополнительной очисткой с помощью набора PureLink (Invitrogen, США) согласно прилагаемому протоколу. кДНК получали из 1-2 мкг РНК при помощи First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, США) и в дальнейшем анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для ПЦР использовали праймеры, представленные в табл. 1.
Количественную ПцР в реальном времени с использованием красителя SYBR Green I (Biolink, Москва) и Taq-полимеразы (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск) проводили при помощи амплификатора CFX96 (BioRad, США) в режиме: 3 мин 95 °C, 20 с 95 °C, 15 с 59 °C, 50 с 72 °C. Общий объем реакции составил 25 мкл. Амплификацию проводили в течение 40 циклов. В качестве контрольного гена выбрали ген GAPDH. Продукты ПЦР проверяли на специфичность методом кривой плавления. Анализ результатов проводили методом определения относительной экспрессии с использованием программного обеспечения Origin 8.5 (OriginLab, США).
Статистический анализ
Данные экспрессии генов представляли как среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия
Таблица 2 Характеристика образцов глиобластом
Образец Пол Возраст, лет Клинический диагноз Длительность жизни после операции, мес.
GB17 Ж 57 4
GB18 М 55 13
GB36 М 52 36
GB37 Ж 36 13
Глиобластома
GB40 М 28 7
GB43 М 42 9
GB45 М 53 8
GB46 Ж 53 10
112
© Цидулко А.Ю. и соавт., 2015.
Относительная экспрессия CSPG4/NG2 и CD44 в клинических образцах глиобластомы
сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки р была меньше 0,05. Для оценки корреляции уровня экспрессии генов использовали коэффициент Пирсона. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Origin 8.5 (OriginLab, США).
Результаты
С учетом катамнеза заболевания пациентов образцы опухоли разделили на две группы. В первую группу вошли образцы глиобластом пациентов с выживаемостью менее 1 года после операции, во вторую - более 1 года (табл. 2).
При помощи метода ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием GAPDH в качестве контрольного гена оценивали уровень экспрессии CSPG4ING2 в клинических образцах глиобластомы пациентов с различной выживаемостью после операции (рисунок).
Обнаружено, что уровень экспрессии CSPG4ING2 достоверно различается в группах пациентов с выживаемостью до года и после и составляет 27,1 ±4,8 и 6,0±1,1. Такая ассоциация уровня экспрессии CSPG4ING2 с выживаемостью пациентов позволяет предположить о возможности его использования в качестве прогностического маркера агрессивности опухолей головного мозга.
Уровень экспрессии CD44, определенный в тех же образцах опухолей, для которых проанализировали экспрессию CSPG4ING2, показан на рисунке. В опухолях пациентов с выживаемостью до года уровень экспрессии CD44 выше по сравнению с опухолями пациентов с выживаемостью более 1 года и составляет 26,1±5,1 и 7,3±1,9. Это коррелирует с экспрессией CSPG4ING2 в этих же клинических образцах (коэффициент Пирсона
0,9514) и подтверждает высказанное предположение, что низкая выживаемость может быть связана с высоким содержанием стволовых клеток, экспрессирующих С5РС4/ЫС2 и С044.
Обсуждение
Полученные результаты свидетельствуют о достоверной разнице в уровне экспрессии С^РС4/Ый2 в глиобластомах пациентов с продолжительностью жизни после операции до года и более. Аналогичные показатели получили авторы, показавшие, что высокий уровень С^РС4/Ый2 играет роль в пролиферации опухолевых клеток глиобластомы [8]. На фоне повышения экспрессии этого гена также происходит усиление пролиферативной активности элементов сосудистого русла опухоли, уровень которой характеризует степень ее агрессивности, что было показано при совместном изучении ангиогенеза в глиобластомах и меланомах на доклинических моделях [10].
Авторы немногочисленных работ показали, что повышенное содержание С^РС4/Ый2 в опухоли способно приводить к возникновению лекарственной устойчивости [2] или устойчивости к радиотерапии [9]. В исследовании мы продемонстрировали повышение в опухолях пациентов с плохим прогнозом выживаемости уровня хондроитинсуль-фат протеогликана С044 - маркера стволовых клеток. При различных видах рака агрессивность опухоли зачастую определяется содержанием в ее составе стволовых клеток [6], поэтому увеличение экспрессии С044 также может быть сопряжено с высокой толерантностью глиобластом к хи-мио- и радиотерапии.
В совокупности полученные результаты открывают перспективу для использования С^РС4/Ый2 как прогностического маркера при выборе стратегии постоперационного лечения пациентов. В частности, могут быть пересмотрены очередность применения методов химио- и радиотерапии, а также соотношение времени их воздействия и дозы под контролем возможного рецидива методами нейровизуализации.
Несомненно, конкретные предложения могут быть сформулированы только после проведения дополнительных уточняющих исследований с привлечением иммуногис-тохимических методов и распространения данного подхода на другие глиальные новообразования.
Заключение
Низкая выживаемость больных в постоперационном периоде может быть связана с повышенным уровнем экспрессии гена С5РС4/ЫС2 и высоким содержанием в опухоли стволовых клеток, экспрессирующих С$РС4/ЫС2 и С044.
Оценки экспрессии гена CSPG4/NG2 в качестве прогнос- 3
тического маркера агрессивности опухоли в стандартную I
процедуру гистоморфологического анализа глиальных но- ; 4
вообразований позволит оптимизировать ведение пациен- ■ 5 тов с глиобластомой в постоперационном периоде.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта инте- ; 6.
ресов. Работа поддержана грантом Российского фон- •
да фундаментальных исследований № 14-04-01283. '. 7
g
Список литературы
1. Гайтан А'С', Кривошапкин А.Л., Каныгин В.В. Результаты ре- '. 9 зекции глиобластом головного мозга с применением комбини- I рованной флуоресцентной навигации // Патология кровообра- '. щения и кардиохирургия. 2014. Т. 2. С. 37—41. '. 10
2. Chekenya M., Krakstad C., Svendsen A. et al. // Oncogene. 2008. Vol. 27. № 39. P. 5182-5194.
Сведения об авторах
Цидулко Александра Юрьевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБНУ «Научно-исследовательский молекулярной биологии и биофизики» (Новосибирск, Россия)
Кобозев Вячеслав Витальевич - канд. мед. наук, зав. отделением нейрохирургии центра ангионеврологии и нейрохирургии ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт имени академика Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Россия)
Волков Александр Михайлович - д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии центра новых технологий ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт имени академика Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Россия) Костромская Диана Владимировна - канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии центра новых технологий ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт имени академика Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Россия) Айдагулова Светлана Владимировна - д-р мед. наук, проф., зав. лабораторией клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (Новосибирск, Россия)
Киселёв Роман Сергеевич - клинический ординатор кафедры нейрохирургии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (Новосибирск, Россия)
Прудникова Татьяна Юрьевна - канд. биол. наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБНУ «Научно-исследовательский молекулярной биологии и биофизики» (Новосибирск, Россия).
Кривошапкин Алексей Леонидович - д-р мед. наук, проф., зав. отделением нейрохирургии Европейского медицинского центра, зав. кафедрой нейрохирургии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (Москва, Новосибирск, Россия)
CSPG4ING2 transcriptional activity as a prognostic marker of the postoperative clinical course of glioblastoma
Tsidulko A.Yu.1*, Kobozev V.V.2, Volkov A.M.2, Kostromskaya D.V.2, Aidagulova S.V.3, Kiseliov R.S.3, Prudnikova T.Yu.1, Krivoshapkin Al.2 4
1 Institute of Molecular Biology and Biophysics , 2/12 Timakova St., 630117 Novosibirsk, Russian Federation; 2 Academician Ye. Meshalkin Novosibirsk Research Institute of Circulation Pathology Ministry of Health Care of Russian Federation, 15 Rechkunovskaya St., 630055 Novosibirsk, Russian Federation; 3 Novosibirsk State Medical University Ministry of Health Care of Russian Federation, 52 Krasniy Prospect, 630091 Novosibirsk, Russian Federation; 4 European Medical Center, 35 Schepkina St., 129090 Moscow, Russian Federation
* Corresponding author. Email: alexandra.tsidulko@gmail.com
Objective. Glioblastoma is a malignant brain tumor characterized by severe invasive growth and poor prognosis. The expression of different genes is changed in tumors, including gene CSPG4ING2, which plays a significant role in the proliferation of glioblastoma cells and tumor neovascularization. The objective of our study was to evaluate the possibility of using the above gene as a prognostic marker for glioblastoma.
Methods. g patients with a diagnosis "glioblastoma" underwent clinical and molecular-biological examination. The tumor samples were fixed in RNA-later (LifeTechnologies, USA). CSPG4ING2 and CD44 expression was evaluated by real-time RT-PCR with GAPDH as a reference gene. The patients were divided into two groups according to the postoperative survival rate: Group 1 - less than 1 year, and Group 2 - over 1 year after surgery.
Results. Molecular biological studies showed a significant 4-fold increase of CSPG4ING2 expression level in tumors from group 1 as compared to that of group
2 patients. It was also found out that increased CSPG4ING2 expression in galloping tumors is in positive correlation with an increase in cancer stem-cell marker CD44 expression (Pearson coefficient 0.9514).
Conclusion. The data obtained suggest that CSPG4ING2 is a promising prognostic marker to determine optimal postoperative treatment of patients with glioblastoma.
Key words: glioblastoma; CSPG4ING2 gene; chondroitin sulfate proteoglycan; prognosis
Hsu N.C., Nien P.Y., Yokoyama K.K. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013. Vol. 441. № 2. P. 514-518.
Karsy M., Neil J.A., Guan J. et al. // Neurosurg. Focus. 2015. Vol. 38. № 3. P. E4. doi: 10.3171/2015.1.FOCUS14755.
Petrovici K., Graf M., Hecht K. et al. // Cancer Genomics Proteomics. 2010. Vol. 7. № 4. P. 173-180. Pointer K.B., Clark P.A., Zorniak M. et al. // Neurochem. Int. 2014. Vol. 71. P. 1-7.
Price M.A., Colvin Wanshura L.E., Yang J. et al. // Pigment Cell Melanoma Res. 2011. Vol. 24. № 6. P. 1148-1157. Stallcup W.B., Huang F-J. // Cell Adh. Migr. 2008. Vol. 2. № 3. P. 192-201.
Svendsen A., Verhoeff J.J., Immervoll H. et al. // Acta Neuropathol. 2011. Vol. 122. № 4. P. 495-510.
Wang J., Svendsen A., Kmiecik J. et al. // PLoS One. 2011. Vol. 6. № 7. P. e23062. doi:10.1371/journal.pone.0023062
Received 15 June 2015. Accepted 27 July 2015.
