CC BY
6
УДК 591.2+571.27:597.553.2+576.89 https://doi.org/10.31016/978-5-6048555-6-0.2023.24.268-274
транскриптомный анализ кишечника байкальского омуля (оз. байкал, восточная сибирь)
Мазур О. Е. 1,
кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов,
olmaz33@yandex.ru
Кутырев И. А. 1,
доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов
Сидорова Т. В. 2,
ведущий инженер лаборатории ихтиологии
Суханова Л. В. 2,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
лаборатории ихтиологии
Аннотация
Впервые представлены новые данные по транскриптому кишечника (задний отдел) байкальского омуля Coregonus migratorius Georgi, 1775 (Salmoniformes: Coregonidae) придонно-глубоководной морфогруппы (оз. Байкала), зараженного паразитами различных систематических групп: цестодами Dibothriocephalus dendriticus, Proteocephalus longicollis, Eubothrium crassum, нематодой Contracaecum osculatum baicalensis. Секвенирование транскриптомных библиотек осуществлялось на секвенаторе Illumina NextSeq550 с использованием набора NextSeq® 550 High Output Kit v2. На основе полученных данных проведена сборка транскриптома de-novo. Консервативные домены и связанные с ними аннотации Gene Ontology были предсказаны с использованием Blast2Go. В результате установлено, что в заднем отделе кишечника, обогащенного лимфоидной тканью (GALT), наблюдается экспрессия функциональных белков, ассоциированных, в первую очередь, с ферментной ак-
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук» (670047, Россия, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, д. 6)
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук (664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3)
тивностью, с развитием специализированных тканей, с клеточными, метаболическими и секреторными процессами. Следует отметить, что значимая доля терминов генной онтологии связаны с работой иммунной системы, с клеточной реакцией на стресс, что в условиях сенсибилизации конечными продуктами обмена гельминтов, их антигенного и травматического воздействия вполне объяснимо. Идентифицированный транскриптом может дать новую информацию для понимания функций лимфоидных органов у лососевых рыб при паразитозах.
Ключевые слова: транскриптом, Со^опш migratorius, кишечник, гельминты
TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF INTESTINES OF THE BAIKAL OMUL (LAKE BAIKAL, EASTERN SIBERIA)
Mazur O. E.
Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Laboratory of Ecology and Parasitology of Hydrobionts,
olmaz33@yandex.ru
Kutyrev I. A.
Doctor of Biological Sciences, Senior Researcher of the Laboratory of Parasitology and Ecology of Hydrobionts
Sidorova T. V. 2,
Leading Engineer of the Laboratory of Ichthyology
Sukhanova L. V. 2,
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of the Laboratory of Ichthyology
Abstract
New data were presented for the first time on the intestinal transcriptome of the intestines (posterior section) of the Baikal omul Coregonus migratorius Georgi, 1775 (Salmoniformes: Coregonidae) belonging to the deep water bottom morphological group (Lake Baikal) infected with parasites of various systematic groups: cestodes Dibothriocephalus dendriticus, Proteocephalus longicollis, Eubothrium crassum, and nematode Contracaecum osculatum baicalensis. Sequencing of the transcriptomics libraries was performed on an Illumina NextSeq550 sequencer using the NextSeq® 550 High Output Kit v2. Based on the obtained data, de-novo transcriptome as-
1 Institute of General and Experimental Biology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (6, Sakhyanovoi st., Ulan-Ude, 670047, Russia)
2 Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033, Russia)
sembly was performed. Conserved domains and their associated Gene Ontology annotations were predicted using Blast2Go. As a result, it was found that in the posterior section of the intestine enriched with lymphoid tissue (GALT), expression of functional proteins was observed that were primarily associated with enzymatic activity, with the development of specialized tissues, with cellular, metabolic and secretory processes. It should be noted that a significant proportion of gene ontology terms is associated with the functioning of the immune system, and with the cellular response to stress, which, under conditions of sensitization by the metabolic end products of helminths and their traumatic and antigenic effects, is quite understandable. The identified transcriptome may provide new information for understanding the functions of lymphoid organs in salmonids with parasitosis.
Keywords: transcriptome, Coregonus migratorius, gut, helminths
Введение. Байкальский омуль Coregonus migratorius (Georgi, 1775) (Salmoniformes: Coregonidae) — эндемичный вид в ихтиоценозе оз. Байкал. Молекулярно-филогенетические исследования доказали видовую самостоятельность вида; его дивергенция от общей сиговой ветви произошла 10—20 тыс. лет назад [3]. В настоящее время численность его популяции катастрофически падает, введен запрет на вылов рыбы. Омуль является промежуточным и окончательным хозяином многих паразитических организмов. Экологические факторы окружающей среды оказывают сопряжённое воздействие на гомеостаз рыб и популяцию в целом, а паразитарные инвазии могут выступать дополнительным стресс-агентом, инициирующим дестабилизаци-онные и иммуномодулирующие процессы [2]. Желудочно-кишечный тракт, как часть иммунной системы позвоночных (gut-associated lymphoid tissue — GALT) играет важную роль в обеспечении гомеоста-за. Компоненты GALT регулируют различные взаимодействия между хозяином и его паразитоценозом [1]. В этой проблематике возрастает особый интерес к механизмам регуляции гомеостаза на молекуляр-но-генетическом уровне.
Цель работы — проведение транскриптомного анализа заднего отдела кишечника C. migratorius, зараженного паразитами различных систематических групп.
Материалы и методы. Биологический материал получен от байкальского омуля (5+—6+), придонно-глубоководной морфо-группы (Посольский сор, оз. Байкал). Образцы заднего отдела кишечника (1 г ткани) гомогенизировали в жидком азоте и выделяли РНК с использованием набора RNEasy Mini (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Затем получали библиотеки комплементарной
ДНК (кДНК) с использованием 250—500 нг общей РНК. Адаптеры для секвенирования Illumina затем лигировали к кДНК, которую после подвергали ПЦР-амплификации в течение 15 циклов: денатурации при 98 0C в течение 10 секунд, отжига при 60 0C в течение 30 секунд и элонгации при 72 0C в течение 30 секунд, с использованием конечного этапа элонгации при 72 0C в течение 5 минут. Все полученные образцы секвенировались на платформе Illumina NextSeq550 с использованием набора NextSeq® 550 High Output Kit v2 (300 циклов) в режиме парно-концевого чтения по 150 b.p. Чтения высокого качества были объединены и собраны с помощью программы Trinity (с параметрами по умолчанию). Открытые рамки считывания были предсказаны с использованием программы Transdecoder (http:// transdecoder.sf.net) с параметрами по умолчанию. На основе полученных данных произведена сборка de-novo с использованием программного пакета Trinityrnaseq (табл.). Консервативные домены и связанные с ними аннотации Gene Ontology (GO) были предсказаны с использованием Blast2Go. Паразитологический анализ проводили по общепринятым методикам.
Таблица
Статистика сборки de-novo транскриптома кишечника Coregonus migratorius
n_seqs smallest largest n_bases mean_len n_under_200 n50
120580 283 16377 144511581 1198.47057 0 1862
Результаты исследований. В результате полного паразитологическо-го вскрытия у байкальского омуля зафиксировано 4 вида паразитов, принадлежащих к 2 классам: Cestoda — 3 (Dibothriocephalus dendriticus Nitzsch 1824; Proteocephalus longicollis Zeder, 1800; Eubothrium crassum Bloch, 1779); Nematoda — 1 (Contracaecum osculatum baicalensis Mozgovoi et Ryjikov, 1950). Анализ показал, что доминирующими видами в паразитофауне омуля — C. osculatum baicalensis, затем следуют D. dendriticus, P. longicollis и E. crassum. Все выявленные гельминты специфично локализованы в желудочно-кишечном тракте: C. osculatum baicalensis — желудок, D. dendriticus — оболочки желудка, пищевода, P. longicollis и E. Bassum — кишечник. Впервые проведен полнотранскриптомный анализ заднего отдела кишечника байкальского омуля, который показал следующие результаты. Статистика сборки de-novo транскрипта кишечника показана в таблице. С помощью пакета программ Blast2Go выявлено распределение транскрип-тов по категориям (рис. А-С): молекулярные функции, биологиче-
ские процессы, клеточные компоненты. В молекулярных функциях преобладают транскрипты связывания ферментов (12%), с трансфе-разной активностью (12%), с гидролазной активностью (11%), с каталитической активностью (10%) и белков, которые связываются с ДНК (10%). В биологических процессах доминируют транскрипты, связанные с развитием тканей органов животных (4%), с межклеточным транспортом различных веществ (3%), с регуляцией иммунных процессов (2%), и в целом с иммунным ответом (2%), с клеточным ответом на стресс-факторы (2%), с клеточной дифференцировкой (2%), с белковым и липидным обменом (2%), с различными секреторными процессами (2%). В категории клеточных компонентов GO в большей степени выявлялись термины — цитоплазматические везикулы (8%), цитоплазматические мембраны (7%), нуклеоплазма (6%), цитоскелетная часть (6%), цитозоль (6%).
Заключение. Установлено, что в заднем отделе кишечника, обогащенном лимфоидной тканью, наблюдается экспрессия генов, кодирующих функциональные белки, связанные, в первую очередь, с ферментной активностью, с развитием специализированных тканей, с клеточными, метаболическими и секреторными процессами. Следует отметить, что значимая доля терминов GO ассоциирована с работой иммунной системы, с экспрессией белков, связанных со стрес-
Рис. Данные аннотации Gene Ontology. Классификация белков заднего отдела кишечника Coregonus migratorius по молекулярным функциям (А)
Рис. Данные аннотации Gene Ontology. Классификация белков заднего отдела кишечника Coregonus migratorius по биологическим процессам (В) и клеточным компонентам (С)
сом, что в условиях сенсибилизации конечными продуктами обмена гельминтов, и их травматического и антигенного воздействия вполне объяснимо. Идентифицированный транскриптом может дать новую информацию для понимания функций лимфоидных органов у лососевых рыб при паразитозах.
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант 22-24-00341). Авторы выражают благодарность инж. О. Б. Жепхоловой, с.н.с. М. Д. Ба-туевой, н.с. Т. Г. Бурдуковской, м.н.с. Л. Д. Сондуевой, инж. Л. В. Толочко (ИОЭБ СО РАН) за помощь в паразитологическом вскрытии.
Список источников / References
1. Salinas I., Ding Y., Fernández-Montero J. O., et al. Mucosal Immunity in Fish. In: Buchmann K., Secombes Ch. J. (eds.). Principles of Fish Immunology. Springer, Cham, 2022: 387-443.
2. Souza D. C. M., Santos M. C., Chagas E. C. Immune response of teleost fish to helminth parasite infection. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 2019; 28(4): 533-547.
3. Sukhanova L. V., Smirnov V. V., Smirnova-Zalumi N. S., et al. Molecular phylogeography of lake Baikal coregonid fishes. Advances in Limnology. 2008; 3: 261-283.
