CC BY
42
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА MEDICAL NEWS Of NORTH CAUCASUS
2015. Т. 10. № 4 2015. Vol. 10. Iss. 4
© Коллектив авторов, 2015 УДК 616.61-006
DOI - http://dx.doi.org/10.14300/mnnc.2015.10087 ISSN - 2073-8137
ТРАНСКРИПТОМНЫЕ МАРКЕРЫ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИШЕМИЧЕСКОМУ ПОВРЕЖДЕНИЮ ПОЧКИ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
Д. И. Водолажский, С. Н. Димитриади, Д. С. Кутилин, Е. М. Франциянц, О. И. Кит
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Россия
TRANSCRIPTOMIC MARKERS OF PREDISPOSITION
TO ISCHEMIC DAMAGE OF THE KIDNEY IN PATIENTS WITH CANCER
Vodolazhsky D. I., Dimitriadi S. N., Kutilin D. S., Frantsiyants E. M., Kit O. I. Rostov Research Institute of Oncology, Russia
В настоящее время для поиска маркеров предрасположенности к ишемическому и постре-перфузионному повреждению почки в ходе органосохраняющей операции в условиях тепловой ишемии почки, а также для выяснения фундаментальных молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе данного явления, целесообразным является изучение экспрессии апоптоз-регулирующих генов. Методом количественной ПЦР в реальном времени проводили определение относительной экспрессии 14 генетических локусов (MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD, p53, APAF1, AIFM1, ICAD, XIAP, HIF1A). В ходе исследования выявлены гены -CASP3, CASP8, CASP9, CASP8/FADD и HIF1A, экспрессия которых позволяет прогнозировать развитие острого повреждения почек у больных раком почки после проведенной органосохраняющей операции в условиях тепловой ишемии почки.
Ключевые слова: экспрессия генов, ишемическое и постреперфузионное повреждение почки, тепловая ишемия почки, прогноз
Currently, to search markers of susceptibility to ischemia and postreperfusion injury of kidney during nephron sparing surgery in terms of warm renal ischemia, as well as to determine fundamental molecular biological processes that underlie this phenomenon, it is appropriate to study the expression of apoptosis-regulating genes. By quantitative real-time PCR was performed determination of the relative expression of 14 genetic loci (MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD, p53, APAF1, AIFM1, ICAD, XIAP, HIF1A). The study identified genes - CASP3, CASP8, CASP9, CASP8/FADD and HIF1A, whose expression allows prediction of the acute renal injury development in patients with cancer after nephron-sparing surgery in terms of warm renal ischemia.
Key words: gene expression, ischemic and postreperfusion renal damage, warm renal ischemia, prognosis
Резекция почки со сложными нефроме-трическими характеристиками опухоли (по шкале R.E.N.A.L.) чаще всего требует использования длительной тепловой ишемии с последующей реперфузией [3]. однако ишемия сопровождается повреждением клеток и субклеточных структур, в том числе митохондрий, что приводит к активации факторов апоптоза и инициации каспа-за-зависимого апоптозного каскада [10]. даже общепринятая 20-минутная тепловая
ишемия способствует развитию осложнений в виде острого повреждения почек (оПП) в раннем послеоперационном периоде [4, 11]. до настоящего времени не описаны маркеры генетической или эпигенетической предрасположенности к риску возникновения ише-мического повреждения почки, позволяющие прогнозировать вероятность развития оПП у пациентов после проведения резекции почки в условиях тепловой ишемии [5, 7]. Поэтому на сегодняшний день является
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Онкология
ORiGiNAL RESEARCH
Oncology
актуальной задача скрининга предиктивных маркеров индивидуальной предрасположенности к развитию ОПП после теплового ише-мического повреждения почки [1].
Целью нашего исследования стало изучение экспрессии апоптоз-регулирующих генов в тканях почек пациентов с почечно-клеточ-ным раком для поиска маркеров индивидуальной предрасположенности к ишемическому и постреперфузионному повреждению почки, а также выяснения фундаментальных молекуляр-но-биологических процессов, лежащих в основе данного феномена.
Материал и методы. Лапароскопическая резекция почки в условиях тотальной тепловой ишемии выполнена 12 больным локальным раком почки. На основании клинической картины в послеоперационном периоде пациенты были разделены на две группы - группа А (5 пациентов), в которой развивалась ОПП и уровень креа-тинина превышал предоперационный более чем на 50 %, и группа Б (7 пациентов), в которой ОПП не развивалась и уровень креатинина не превышал предоперационный более чем на 40 %. В исследовании использовали биоптаты тканей больных с гистологически подтвержденным диагнозом «почечно-клеточный рак T1N0M0». Все экспериментальные процедуры были выполнены с соблюдением принятых этических норм и получением добровольного информированного согласия пациентов.
Во время проведения лапароскопической резекции почки с использованием тепловой ишемии до остановки кровоснабжения в резецируемой почке с помощью пистолета Pro Mag Ultra иглой 16 G выполняли пункционную биопсию среднего сегмента резецируемой почки, забирая столбик ткани интактной паренхимы. Пункционную биопсию повторяли на 10-й минуте проведения ишемии и через 20 минут после восстановления кровотока в почке (репер-фузия). Для транспортировки в лабораторию и хранения образцы тканей замораживали в жидком азоте.
Фрагменты тканей гомогенизировали в жидком азоте и проводили экстракцию суммарной РНК по методу P. Chomczynski и N. Sacchi [6]. Полученные препараты РНК обрабатывали ДНК-азой («Синтол», Россия) для удаления следов геномной ДНК. Синтез кДНК проводили с использованием коммерческих наборов «Reverta-L» («Интерлабсервис», Россия).
Методом RT-qPCR определяли относительную экспрессию 14 генетических локусов, вовлеченных в регуляцию сигнальных путей развития апоптоза: MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD, p53, APAF1, AIFM1, ICAD, XIAP, HIF1A. Дизайн праймеров для RT-qPCR осуществляли с использованием референтных последовательностей ДНК NCBI GenBank. В качестве референтного гена использовали ген ACTB (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика используемых в исследовании праймеров
Наименование праймеров № NCBI GenBank Последовательность T отжига, 0С
ACTB NM_001101.3 Forward: AAC CGC GAG AAG ATG ACC C Reverse: AGC ACA GCC TGG ATA GCA AC 60
MDM2 NM_001145339.2 Forward: TAG GAG ATT TGT TTG GCG TGC Reverse: CCT GCT GAT TGA CTA CTA CCA A 60
BAX NM_001291428.1 Forward: GGG ACG AAC TGG ACA GTA ACA Reverse: GCT GCC ACT CGG AAA AAG AC 61 60
BCL2 NM_000633.2 Forward: GGA TCC AGG ATA ACG GAG GC Reverse: GAA ATC AAA CAG AGG CCG CA 63 58
р53 NM_000546.5 Forward: TTG GAA CTC AAG GAT GCC CA Reverse: CGG GAG GTA GAC TGA CCC T 58 62
CASP3 NM_004346.3 Forward: CTG GAA TAT CCC TGG ACA ACA GT Reverse: TCG ACA TCT GTA CCA GAC CGA 63 61
CASP8 NM_001228.4 Forward: CTG AAG CAA ACA GCC AGT GC Reverse: GAC CTC AAT TCT GAT CTG CTC AC 60 63
CASP9 NM_032996.3 Forward: TGA GAC CCT GGA CGA CAT CT Reverse: TCC CTT TCA CCG AAA CAG CA 60 58
CASP7 NM_033338.5 Forward: AAG CTG ACT TCC TCT TCG CC Reverse: TCC AGG TCT TTT CCG TGC TC 60 60
CASP8/ FADD NM_003879.5 Forward: GCC GAG GCA AGA TAA GCA AG Reverse: AAT CCA GTT GAT CTG GGG CAA 60 60
AIFM1 NM_001130847.3 Forward: TCA GGG ACA AAG TGG TCG TG Reverse: ATC TTC ATG CTG CTC ACC GT 60 58
APAF1 NM_001160.2 Forward: ACC TCT GCT GAC AAG ACT GC Reverse: GTT GTG GCC CCT CAA TTC AT 60 58
XIAP NM_001167.3 Forward: ACT GAG AAA ACA CCA TCA CTA ACT Reverse: TGT CCT TGA AAC TGA ACC CCA 60 60
ICAD NM_213566.1 Forward: TCT GTC CAG CAT CAT CCT CC Reverse: GGT GGC ACA ACT CTG ACG TA 60 60
HIF1A NM_001530.3 Forward: ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG G Reverse: AGC TTC GCT GTG TGT TTT GTT 61 59
RT-qPCR проводили в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25мМ dNTPs, 2,5 мМ МдС12, однократный ПЦР-буфер и 1 ед. акт. SynTaq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («Синтол», Россия), краситель ЕУА^гееп (*1) и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референтного гена (актина, АСТВ) или гена-мишени. Rт-qPCR проводили на
МЕДИЦИНСКИМ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА
2015. Т. 10. № 4
MEDICAL NEWS OF NORTH CAUCASUS
2015. Vol. 10. Iss. 4
термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). Относительную экспрессию генетического локуса (RE) рассчитывали по формуле RE=2-ACt [9, 2].
Статистический анализ проводили с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 8.0. Различия оценивали с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение. Для скрининга прогностических транскриптомных маркеров ОПП было проведено сравнение уровней относительной экспрессии генов MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/ FADD, p53, APAF1, AIFM1, ICAD, XIAP и HIF1A в биоптатах тканей почки пациентов групп А и Б.
В ходе сравнительного исследования у пациентов с ОПП изначально (до проведения ишемии) было обнаружено статистически достоверное (р<0,05) уменьшение уровня экспрессии следующих генетических локусов по отношению к пациентам без ОПП: MDM 2 на 30 %, CASP3 на 50 %, CASP8 на 60 %, CASP9 на 80 % и APAF1 на 40 %. Таким образом, уровень относительной экспрессии проапоптозных генов CASP3, CASP8, CASP9 и APAF1, а также антиапоптозного гена MDM2 можно использовать в качестве прогностических преди-ктивных маркеров предрасположенности к развитию ОПП в случае проведения биопсии до ишемии почки. Отмечалась тенденция к повышенной экспрессии генетического локуса HIF1A (в 1,8 раза) у пациентов с предрасположенностью к ОПП. Это может свидетельствовать о возможном гипокси-ческом состоянии тканей почки у пациентов этой группы (рис. а). Экспрессия генетического локуса CASP8 и FADD-like регулятора апоптоза (CFLAR) в группе пациентов с ОПП в 1,4 раза превышала аналогичный показатель для группы пациентов без ОПП, что может свидетельствовать о выраженной тенденции ингибирования апоптоза в группе пациентов с предрасположенностью к ОПП.
<СА£РЗ CAS PS
Г1 AlfMl
Рис. Соотношение уровня экспрессии генов у пациентов с ОПП к уровню экспрессии у пациентов без ОПП в биоптатах тканей почек, полученных: а) до ишемии; б) на 10-й минуте ишемии; в) через 20 минут после восстановления кровотока
Сравнение относительной экспрессии генов в биоптатах, полученных из почек на 10-й минуте проведения ишемии, у пациентов групп А и Б показало статистически достоверные отличия (р<0,05): у пациентов группы А (развивается ОПП) экспрессия генов BAX, CASP7, CFLAR, APAF1, XIAP и HIF1A повышена на 90 %, 100 %, 180 %, 20 %, 110 % и 460 % соответственно по сравнению с экспрессией этих генов у пациентов группы Б (не развивается ОПП) (рис. б).
Важно отметить, что у пациентов с предрасположенностью к ОПП по сравнению с пациентами без предрасположенности во время ишемии наиболее значительно и статистически достоверно увеличивается экспрессия гена HIF1A, кодирующего альфа-субъединицу транскрипционного фактора HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1). В большинстве клеток в условиях нор-моксии ген HIF1A конститутивно экспрессирует-ся на низком уровне, однако в условиях гипоксии транскрипция HIF1A значительно активируется [12]. HIF1A, как известно, индуцирует транскрипцию более 60 генов, которые участвуют в биологических процессах, таких как ангиогенез и эритропоэз, способствующих увеличению доставки кислорода к испытывающим гипоксию тканям [8].
Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что во время ишемии в почках пациентов группы А по сравнению с аналогичными показателями пациентов группы Б более активно индуцируются процессы клеточной пролиферации в ответ на ишемическое воздействие. У этих пациентов также повышается уровень экспрессии проапоптозных генов BAX и APAF1, эф-фекторной фазы (CASP7), а с другой стороны, увеличивается относительная экспрессия ан-тиапоптозного гена XIAP, который ответственен за ингибирование эффекторных каспаз, и увеличивается экспрессия ингибитора апоптоза CFLAR по сравнению с пациентами, у которых ОПП не развивается. В целом у пациентов с ОПП наблюдается одновременная активация как про-, так и антиапоптозных генов, что свидетельствует лишь о потенциальном увеличении шансов развития апоптоза, но не о его реализации в данный момент времени.
Сравнение экспрессии генов в биоптатах, полученных из почек пациентов групп А и Б через 20 минут после восстановления кровотока, показало следующие статистически достоверные отличия (р<0,05): у пациентов группы А обнаружено относительное увеличение экспрессии генов CFLAr и HIF1A на 250 и 220 % соответственно и снижение экспрессии генов MDM2, CASP9, p53, APAF1, AIFM1,
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Онкология
ORiGiNAL RESEARCH
Oncology
ICAD и XIAP соответственно на 20 %, 80 %, 40 %, 80 %, 70 %, 60 % и 60 % по сравнению с пациентами группы Б. После восстановления кровотока в почке, как и во время ишемии, в биоптатах почек пациентов, у которых развилось ОПП, уровень экспрессии генов CFLAR и HIF1A превышал аналогичный показатель в биоптатах пациентов, у которых ОПП не произойдет. При этом уровень экспрессии генов MDM2, CASP9, p53, APAF1, AIFM1, iCAD и XIAP был значительно понижен (рис. в).
Таким образом, профиль экспрессии генов MDM2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9,
Заключение. Проведенное исследование позволило выявить генетические локусы,экспрессия которых значительно отличается в двух группах пациентов: с развитием (А) и отсутствием острого повреждения почек (б): CASP3, CASP8, CASP9, CASP8/FADD и HIF1A. Относительная экспрессия этих генетических локусов может быть использована в качестве молекулярных маркеров предрасположенности к ишемическому и постишемиче-
Литература
1. Кит, О. И. Экспрессия молекулярных маркеров острого повреждения почек в динамике экспериментальной ишемии / О. И. Кит, Е. М. Франциянц, С. Н. Димитриади [и др.] // Экспериментальная урология. - 2014. -№ 4. - С. 12-15.
2. Коган, М. И. Изменение экспрессии генетических локусов в мононуклеарной фракции периферической крови больных раком предстательной железы / М. И. Коган, М. Б. Чибичян, Д. И. Водолажский // Клиническая онкология. - 2012. - № 5. - С. 59-60.
3. Матвеев, В. Б. Органосохраняющее лечение рака почки / В. Б. Матвеев, Д. В. Пер-лин, К. М. Фигурин, М. И. Волкова // Практическая онкология. - 2005. - Т. 6, № 3. - С. 162-166.
4. Becker, F Assessing the impact of ischaemia time during partial nephrectomy / F. Becker // European Urology. - 2009. - Vol. 56. - P. 625635.
5. Burne, M. J. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model / M. J. Burne, M. Haq, H. Matsuse [et al.] // Transplantation. -2000. - Vol. 69, № 5. - P. 1023-1025.
6. Chomczynski, P. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
BCL2, CFLAR, p53, APAF1, AIFM1, ICAD, XIAP и HIF1A в биоптатах почек пациентов групп А (ОПП) и Б (без ОПП) статистически достоверно отличается в период до проведения ишемии, во время ишемии и после восстановления кровотока. Это позволяет выделить кластеры генов для биоптатов, полученных на разных этапах хирургического вмешательства, экспрессию которых можно использовать в качестве преди-ктивных маркерных сигналов для прогнозирования вероятности развития ОПП в послеоперационном периоде (табл. 2).
скому повреждению почки у больных раком почки после проведенной органосохраняющей операции.
Обнаруженные в ходе исследования маркеры также позволяют расширить представления о молекулярных механизмах развития ОПП у одних пациентов и устойчивости к повреждающему воздействию ишемии-реперфузии других пациентов и исходя из этого наметить направления будущих исследований.
thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on / P. Chomczynski, N. Sacchi // Nat. Protoc. - 2006. - Vol. 1, № 2. - P. 581-585.
7. Eckardt, K.-U. Role of hypoxia in the pathogenesis of renal disease / K.-U. Eckardt, W. W. Bernhardt, A. Weidemann [et al.] // Kidney International. - 2005. -№ 68. - P. 46-51.
8. Lee, J. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1) alpha: its protein stability and biological functions / J. W. Lee, S. H. Bae, J. W. Jeong [et al.] // Experimental & Molecular Medicine. -2004. - Vol. 36, № 1. - P. 1-12.
9. Schmittgen, T. D. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method / T. D. Schmittgen, K. J. Livak // Nature Protocols. - 2008. - Vol. 3. - P. 1101-1108.
10. Sims, N. R. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke / N. R. Sims, H. Muyderman // Biochimica et Biophysica Acta. - 2010. - Vol. 1802, № 1. -Р. 80-91.
11. Tompson, R. H. Renal function after partial nephrectomy: effect of warm ischemia relative to quantity and quality of preserved kidney / R. H. Tompson, B. R. Lane, C. M. Lohse [et al.] // Urology. - 2012. - Vol. 79, № 2. -Р. 356-360.
Таблица 2
Потенциальные предиктивные маркеры развития ОПН в послеоперационном периоде
Этап, на котором получен биоптат Гены, экспрессия которых статистически достоверно отличается у пациентов с ОПН от пациентов без ОПН Гены, экспрессия которых более чем в 2 раза отличается у пациентов с ОПН от пациентов без ОПН
1. До ишемии МЭМ 2, CASP3, CASP8, CASP9, АРАП CASP3, CASP8 и CASP9
2. На 10-й минуте ишемии ВАХ, САБР7, САБР8/ГАйй, АРАП, Х1АР, И1ПА CASP8/FADD и HIF1A
3. Через 20 минут после восстановления кровотока MDM 2, CASP9, р53, APAF1, А^М1, ICAD,XIAP, САБРв/ГАйй, И1ПА CASP8/FADD и HIF1A
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА
2015. Т. 10. № 4
MEDICAL NEWS OF NORTH CAUCASUS
2015. Vol. 10. Iss. 4
12. Wiener, C. M. In vivo expression of mRNAs encoding hypoxia-inducible factor 1 /
C. M. Wiener, G. Booth, G. L. Semenza //
References
1. Kit O. I., Frantsiyants E. M., Dimitria-di S. N., Kaplieva I. V., Trepitaki L. K. Eksperimentalnaya urologiya. - Experimental Urology. 2014;(4):12-15.
2. Kogan M. I., Chibichyan M. B., Vodolazhsky
D. I. Klinicheskaya onkologiya. - Clinical Oncology. 2012;(5):59-60.
3. Matveev V. B., Perlin D. V., Figurin K. M., Volkova M. I. Prakticheskaya onkologiya. -Practical Oncology. 2005;6(3):162-166.
4. Becker F. European Urology. 2009;56:625-635.
5. Burne M. J., Haq M., Matsuse H., Mohapatra S., Rabb H. Transplantation. 2000;69(5):1023-1025.
6. Chomczynski P., Sacchi N. Nat. Protoc. 2006;1(2):581-585.
Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1996. - Vol. 225, № 2. -P. 485-488.
7. Eckardt K.-U., Bernhardt W. W., Weidemann A., Warnecke Ch., Rosenberger Ch., Wiesener M. M., Willam C. Kidney International. 2005;68:46-51.
8. Lee J. W., Bae S. H., Jeong J. W., Kim S. H., Kim K. W. Experimental & Molecular Medicine. 2004;36(1):1-12.
9. Schmittgen T. D., Livak K. J. Nature Protocols. 2008; 3:1101-1108.
10. Sims N. R., Muyderman H. Biochimica et Biophysica Acta. 2010;1802(1):80-91.
11. Tompson R. H., Lane B. R., Lohse C. M., Leibovich B. C., Fergany A., Frank I., Gill I. S., Blute M. L., Campbell S. C. Urology. 2012;79(2):356-360.
12. Wiener C. M., Booth G., Semenza G. L. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1996;225(2):485-488.
Сведения об авторах:
Водолажский Дмитрий Игоревич, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной онкологии; тел.: +79896110910; e-mail: dvodolazhsky@gmail.com
Димитриади Сергей Николаевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, врач-уролог; тел.: +79282791790; e-mail: dimitriadi@yandex.ru
Кутилин Денис Сергеевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; тел.: +79515385039; e-mail: k.denees@yandex.ru
Франциянц Елена Михайловна, доктор биологических наук, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей; тел.: +79185354388; e-mail: super.gormon@yandex.ru
Кит Олег Иванович, доктор медицинских наук, профессор, директор РНИОИ; тел.: +78633003005; e-mail: onko-sekretar@mail.ru
© Коллектив авторов, 2015 УДК 616.314-089-002
DOI - http://dx.doi.org/10.14300/mnnc.2015.10088 ISSN - 2073-8137
ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВАЯ ТРАВМА КАК ФАКТОР НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ЦНС
С. М. Карпов, К. С. Гандылян, К. Г. Караков, В. А. Зеленский, М. П. Порфириадис, Э. Э. Хачатурян, Д. А. Доменюк, Е. Н. Чалая
Ставропольский государственный медицинский университет, Россия
MAXILLOFACIAL TRAUMA AS THE CAUSE OF NEUROPHYSIOLOGICAL CNS DISORDERS
Karpov S. M., Gandylyan K. S., Karakov K. G., Zelenskiy V. A., Porfiriadis M. P., Khachaturyan E. E., Domenyuk D. A., Chalaya E. N.
Stavropol State Medical University, Russia
Обследовано 37 больных с травмой верхней зоны и 45 больных с повреждением средней зоны лица. Учитывая результаты исследования, авторы полагают, что установление диагноза черепно-мозговой травмы (ЧМТ) при травмах челюстно-лицевой области (верхняя и средняя зоны лица)
