CC BY
57
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2013 БИОЛОГИЯ Вып. 2
УДК 577.152.35
ТРАНСФОРМАЦИЯ АКРИЛОНИТРИЛА НИТРИЛАЗОЙ, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА АКТИВИРОВАННОМ И НЕАКТИВИРОВАННОМ ХИТОЗАНЕ
Ю. Г. Максимова3, Т. А. Мавлютоваъ, А. Ю. Максимов3*3, Г. В. Овечкина3, В. А. Демаков3 ь
“Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; [email protected]; (342)2807442
ь Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Выделенный из штамма Pseudomonas fluorescens С2 ферментный препарат, содержащий нитри-лазу, был иммобилизован на немодифицированном и активированном бензохиноном хитозане. Изучена нитрилазная активность, операционная стабильность и зависимость активности иммобилизованного ферментного препарата от температуры реакции. Показано, что ковалентная сшивка с носителем приводит к возрастанию операционной стабильности и сохранению более высокой активности при температуре 70-80°С.
Ключевые слова: нитрилаза; Pseudomonas fluorescens; иммобилизация ферментов; хитозан.
Введение
Нитрилазы (КФ 3.5.5.1) - гидролазы, субъединич-ная структура которых представлена высокомолекулярными гомоолигомерами, формирующими спиральные структуры. Эти ферменты осуществляют одностадийный гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот. В настоящее время нитрилазы интенсивно изучаются как альтернатива химическим катализаторам. Но их техническое использование затруднено из-за чувствительности к кислороду, связанной с окислением остатков цистеина в активном центре, низкой активности и стабильности [Mateo et al., 2006; Martincova, Кгёп, 2010]. Стабильность нитрилаз может быть увеличена путем иммобилизации на носителях.
Важным этапом приготовления гетерогенного биокатализатора является выбор носителя для иммобилизации фермента. Показано, что нет универсального носителя для всех ферментов, но существует ряд особенностей, которыми должен обладать любой материал, используемый для иммобилизации. Эго высокая аффинность к белкам, гидро-фильность, доступность функциональных групп для прямых реакций с ферментами и химических модификаций, механическая стабильность, а также возможность приготовления в различных геометрических конфигурациях, которые обеспечивают проницаемость и подходящую площадь поверхности для выбранной биотрансформации.
Такие характеристики сочетают в себе полиами-носахариды - хитин и хитозан [Krajewska, 2004]. Природные источники хитина практически безграничны, он содержится в ракообразных, насекомых, моллюсках, грибах, дрожжах, кораллах, зоопланктоне. Промышленным способом его получают главным образом выделением из производственных отходов переработки ракообразных [Хитин и хитозан..., 2010]. При деацетилировании хитина получают хитозан - сополимер D-глюкозамина и N-a-цсти л - D - гл ю к о за \ г и н а. За счет большого количества водородных связей, которые способен образовывать хитозан, он является универсальным сорбентом, связывающим огромное количество различных веществ органической и неорганической природы [Ковалева и др., 2010]. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле определяет его способность взаимодействовать с бифункциональными реагентами, образующими химические связи как с молекулой хитозана, так и с молекулой белка, что делает возможным ковалентную сшивку фермента с хитозаном [Максимова и др., 2012].
Известны успешные случаи ковалентного связывания ферментов с активированным хитозаном. Так, при использовании различных активаторов были иммобилизованы липаза [Yi, Noh, Lee, 2009], ката-лаза [Cetinus, Oztop, Saraydin, 2007], аллиназа [Zhou, Wang, 2009], нитрилгидратаза [Максимова и др., 2012]. В то же время, иммобилизация фермента на немодифицированном хитозане может происхо-
© Максимова Ю. Г., Мавлютова Т. А., Максимов А. Ю., Овечкина Г. В., Демаков В. А., 2013
49
дить путем адсорбции [Ковалева и др., 2010]. Цель настоящей работы - получение иммобилизованных препаратов нитрилазы методом ковалентного присоединения фермента к активированному хито-зану и адсорбцией на немодифицированных хитоза-новых гранулах, сравнение активности и стабильности препаратов в реакции гидролиза акрилонитрила и определение влияния температуры на скорость реакции, катализируемой иммобилизованным и свободным ферментом.
Материалы и методы исследования
Клетки штамма Pseudomonas fluorescens С2, обладающего нитрилазной активностью, выращивали на минеральной солевой среде N следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1.0; К2НР04хЗН20 - 1.6; NaCl -0.5; MgS04x7H20 - 0.5; СаС12- 0.005; FeS04x7H20 - 0.01; СоС12х6Н20 - 0.01, в конических колбах объемом 1 л при температуре 30°С и постоянном перемешивании со скоростью вращения 90 об/мин. В качестве источника углерода использовали глюкозу (0.1%), источника азота - ацетонитрил (0.5%).
Клеточную суспензию центрифугировали 20 мин., со скоростью вращения 8500 об/мин., клеточный осадок отмывали фосфатным буфером, содержащим 44 мМ бутират натрия. Осадок клеток ре-суспендировали в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия в указанной концентрации.
Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе при 22 кГц 7 раз по 20 сек. с охлаждением осадка. Суспензию, содержащую разрушенные клетки, центрифугировали 20 мин. при скорости вращения 8500 об/мин. с охлаждением (4°С).
Высаливание фермента проводили сульфатом аммония до 35% от насыщающей концентрации и центрифугировали 20 мин. при 8500 об/мин. с охлаждением. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с бутиратом натрия, концентрацию белка определяли по методике Бредфорд. Ферментный препарат хранили при температуре -18 °С.
Раствор хитозана 2% (вес/об.) в 2% (об./об.) уксусной кислоте накапывали через иглу шприца в 1М раствор КОН и оставляли на 40 мин. для затвердения, промывали фосфатным буфером до нейтральной реакции промывных вод. Часть гранул активировали 0.1% раствором бензохинона в течение 15 мин. и промывали 3 раза фосфатным буфером, пятикратно превышающим по объему раствор бензохинона.
Иммобилизацию ферментного препарата на хи-тозановых гранулах проводили в течение 40 мин. при 22°С, затем гранулы промывали фосфатным буфером до исчезновения белка в промывных водах. Количество связанного белка определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с гранулами по методике Бредфорд.
Активность иммобилизованной и свободной
нитрилазы (Е) определяли по концентрации продукта - акриловой кислоты (АК) при проведении трансформации 0.07-1.3 М раствора акрилонитрила (НАК) в фосфатном буфере (pH 7.2) при 22°С в течение 40 мин.. Операционную стабильность определяли по сохранению активности при проведении последовательных циклов реакций продолжительностью 24 ч. каждый с 0.58 М раствором акрилонитрила в качестве субстрата, после каждого цикла биокатализатор отмывали фосфатным буфером и хранили при температуре +4...+10°С. Влияние температуры на активность биокатализатора определяли при проведении реакции с 0.58 М раствором акрилонитрила в фосфатном буфере (pH 7.2) в течение 60 мин. в диапазоне температур от 10 до 80 °С с предварительным нагревом в течение 10 мин.
Концентрацию акриловой кислоты определяли методом ВЭЖХ на хроматографе ЬС-10 «§Ытас17и» (Япония) с диодно-матричным УФ- и флуоресцентным детектором и колонкой 8упе^ 4и Нус1го-Р1Р 80А (250| 4.6 мм). В качестве подвижной фазы использовали раствор 25 мМ ЫаЬЬРОь скорость потока составляла 0.5 мл/мин. при температуре 25°С. Удельную ферментативную активность определяли как количество акриловой кислоты в ммоль, образуемое 1 г белка в 1 ч.
Результаты и их обсуждение
Определено количество белка, связанного не-модифицированным и активированным хитозаном. Показано, что при возрастании концентрации белка в пробе до 18.5 мг/мл связывание белка достигает 55-60% от исходного количества. Установлено, что активация хитозана не приводила к возрастанию количества связанного белка (рис. 1).
%
мг белка в пробе
Рис. 1. Связывание ферментного препарата на неактивированном (1) и активированном (2) хитозане; % - концентрация белка в пробе
По-видимому, при связывании белка с неактивированным хитозаном возникает адсорбция, столь же эффективная, как и ковалентная сшивка с активирующим веществом, когда многочисленные аминогруппы хитозана образуют водородные связи с карбоксильными группами белков.
Изучена активность иммобилизованного и неиммо-билизованного препарата нитрилазы в реакции трансформации акрилонитрила. Показано, что при иммобилизации на хитозановых гранулах, как активированных, так и немодифицированных, наблюдается снижение нит-рилазной активности (таблица). Возможно, это связано с деформациями активного центра, происходящими при иммобилизации фермента. Кроме того, хитозановые гранулы адсорбируют продукт реакции - акриловую кислоту. В среднем активированные гранулы адсорбируют 50-70, неактивированные - 40-65% акриловой кислоты. В результате того, что активность фермента оценивается по конечному продукту, истинная активность будет выше измеренной.
Ннтрилазная активность иммобилизованных ферментных препаратов и фермента в растворе
Концен- Активность нитрилазы, ммоль/г/ч
трация НАК, М На активированном хитозане На немодифицированном хитозане В растворе
0.07 21.0 5.6 13.0
0.15 13.7 6.8 22.0
0.29 24.0 9.4 42.5
Оценивали операционную стабильность биокатализатора на основе иммобилизованной нитрилазы. Показано, что нитрилаза, ковалентно связанная с активированным хитозаном, более стабильна, чем адсорбированная на немодифицированном носителе (рис. 2).
мг АК
в пробе
2Ъ "
20 -
15 -
10 -
5 /
0 •
0 48 96 144 192 240 288
ч
Рис. 2. Операционная стабильность нитрилазы, иммобилизованной на активированном (1) и неактивированном (2) хитозане
В целом, за 312 ч. работы биокатализатора, 2 мг ферментного препарата, иммобилизованного на активированном и неактивированном хитозане, при многоцикловой конверсии НАК образуют 136.5 и 37.5 мг акриловой кислоты соответственно. К 13-му циклу реакции активность иммобилизованной нитрилазы падает.
Изучено влияние температуры на активность нитрилазы, связанной с хитозаном, и фермента в растворе. Показано, что как иммобилизованная нитрилаза, так и фермент в растворе имеет макси-
мум активности при 60°С (рис. 3). При температуре 70°С наблюдается снижение активности, у неиммо-билизованного фермента на 73%, у связанного с активированным и неактивированным хитозаном - на 36 и 60% соответственно.
Е,
ммоль/г/ч
Температура, °С
%
Температура, °С
Рис. 3. Влияние температуры на активность нитрилазы в растворе (1) и фермента, иммобилизованного на активированном (2) и неактивированном (3) хитозане; 100% — максимальная активность для каждого биокатализатора
Таким образом, ковалентное присоединение нитрилазы к активированному хитозану приводит к увеличению термостабильности, как по сравнению с адсорбции-ей на неактивированном хитазане, так и с ферментом в растворе.
Следовательно, ковалентное присоединение ферментного препарата, содержащего нитрилазу, к активированному хитозану позволяет получить гетерогенный биокатализатор гидролиза нитрилов, обладающий повышенной операционной стабильностью и устойчивостью к высоким температурам.
Библиографический список
Ковалева Т.А. и др. Хитозан как перспективный носитель для иммобилизации липазы // Биотехнология. 2010. №4. С. 59-64.
Максимова Ю.Г. и др. Каталитические свойства нитрилгидратазы, иммобилизованной на активированном хитозане // Прикл. биохим. и микро-биол. 2012. Т. 48, № 5. С. 484-489.
Хитин и хитозан: природа, получение и применение / под ред. M.Sc.A.P. de Abram. Б.м.: Издано Рос. Хитин. О-вом, 2010. 292 с.
Cetinus S., Oztop H., Saraydin D. Immobilization of catalase onto chitosan and cibacron blue F3GA attached chitosan beads // Enzyme and Microbial Technology. 2007. Vol. 41. P. 447-454.
Krajewska B. Application of chitin- and chito san-based materials for enzyme immobilizations: a review // Enzyme and microbial technology. 2004. Vol. 35. P. 126-139.
Martincova L., Kren V Biotransformations with nitrilases // Current opinion in chemical biology. 2010. Vol. 14. P. 1-8.
Mateo C. et al. Stabilisation of oxygen-labile nitrilases via co-aggregation with poly(ethyleneimine) // J.
Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2006. Vol. 38. P. 154-157.
Yi S.-S., Noh J.-M., Lee Y.-S. Amino acid modified chitosan beads: Improved polymer supports for immobilization of lipase from Candida rugosa II J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009. Vol. 57. P. 123-129.
Zhou J.Q., Wang J. W. Immobilization of alliinase with a water soluble-insoluble reversible N-succinyl-chitosan for allicin production // Enzyme and Microbial Technology. 2009. Vol. 45. P. 299-304.
Поступила в редакцию 17.05.2013
Transformation of acrylonitrile by nitrilase immobilized on activated and nonactivated chitosan
Yu. G. Maksimova, candidate of biology, senior scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2807442 T. A. Mavlyutova, student
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
A. Yu. Maksimov, candidate of biology, senior scientist, associate professor Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected] Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990 G. V. Ovechkina, lead engineer
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected] V. A. Demakov, doctor of medicine, professor, correspondent member of RAS, head of laboratory
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2807442 Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
The enzyme preparation containing the nitrilase isolated from Pseudomonas fluorescens C2 was immobilized on unmodified and benzoquinone activated chitosan. Nitrilase activity, operation stability and dependence of activity of immobilized enzyme preparation from the reaction temperature were studied. It is shown that the covalent attachment with the carrier leads to higher operation stability and maintains a higher activity under the temperature of 70-80°C.
Key words: nitrilase; Pseudomonas fluorescens', enzyme immobilization; chitosan.
Максимова Юлия Геннадьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Мавлютова Татьяна Алексеевна, студентка
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
Максимов Александр Юрьевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, доцент ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
Овечкина Галина Вячеславовна, ведущий инженер
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Демаков Виталий Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАН, зав. лабораторией ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
