CC BY
1614. Shank A. E., Kolter R. New developments in microbial interspecies signaling. Curr. Opin. Microbiol. 2009, 12 ( 2): 205-214.
15. Wenren L. M., Sullivan N .L., Cardarelli L. et al. Two independent pathways for self-recognition in proteus mirabilis are linked by type Vl-dependent export. mBio. 2013, 4 (4): e00374-13. doi: 10.1128/mBio.00374-13.
Поступила 12.03.16
Контактная информация: Бухарин Олег Валерьевич, д.м.н., проф., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
С.Б.Чекнёв, Е.И.Вострова, МЛ.Сарычева, A.B.Вострое
ТОРМОЖЕНИЕ РОСТА БАКТЕРИЙ В КУЛЬТУРАХ STAPHYLOCOCCUS AUREUS И PSEUDOMONAS AERUGINOSA КАТИОНАМИ МВДИ И ЦИНКА, ПРИМЕНЕННЫМИ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Цель. Оценка антибактериального действия связанных белками у-глобулиновой фракции и свободных катионов меди и цинка, примененных в культурах S.aureus и Р. aeruginosa в физиологических (микромолярных) концентрациях. Материалы и методы. Суточную культуру бактерий S.aureus или P.aeruginosa переводили с агара в физиологический раствор и готовили суспензию клеток, содержавшую ориентировочно 103 — 104 КОЕ/мл. В суспензию вносили образцы металлокомплексов у-глобулина с катионами меди или цинка (белка 30 или 45 мкг/мл), контрольные у-глобулины (30 или 45 мкг/мл) и солевые растворы меди или цинка, содержание катионов в которых соответствовало количеству металла, связавшегося с белком на этапе получения металлокомплексов (75 нг/мл). Суспензии инкубировали при 37°С в течение 6 час, через каждые 2 час производя отбор проб и подсчет КОЕ в соответствии с принятым микрометодом. По окончании инкубации (6 ч наблюдения) суспензии переводили в питательный бульон, термостати-ровали в течение суток при 37°С, после чего оценивали прозрачность питательного бульона в сравнении с контрольным (стерильным). Результаты. Начиная с 3 часа наблюдения в культуре S.aureus обнаруживается токсическое действие катионов цинка и меди. Жизнеспособные бактерии отсутствуют в культуре с цинком спустя 6 час, с медью — спустя 4 час инкубации. Связавший катионы меди у-глобулин на сроках 4 и 6 час инкубации на 11,9 — 33,0% (р<0,05 — 0,1) снижает количество жизнеспособных клеток в сравнении с контрольным белком. В культуре P.aeruginosa токсическое действие катионов меди проявляется сразу же после инициации культуры и приводит к реализации полного бактерицидного эффекта спустя 4 час наблюдения. Катионы цинка подобными свойствами не обладают. Связавший катионы меди у-глобулин на сроках 4 и 6 час инкубации на 19,3 — 25,8% (р<0,001) снижает количество жизнеспособных клеток в сравнении с контрольным белком. Заключение. Поддерживаемые в физиологическом растворе бактерии S.aureus подвержены токсическому действию физиологических (микромолярных) концентраций свободных катионов меди и цинка, а также катионов меди, связанных человеческим сывороточным у-глобулином. В тех же условиях бактерии P.aeruginosa испытывают токсическое воздействие катионов меди (но не цинка) как свободных, так и связанных человеческим сывороточным у-глобулином. При этом в присутствии свободных катионов меди в культурах S.aureus и P.aeruginosa реализуется полный бактерицидный эффект.
Журн. микробиол., 2016, № 3, С. 9—18
Ключевые слова: антибактериальное действие, медь, цинк, S.aureus, P.aeruginosa
S.B.Cheknev, E.I. Vostrova, M.A.Sarycheva, A. V. Vostrov
INHIBITION OF GROWTH OF BACTERIA IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA CULTURES BY COPPER AND ZINC CATIONS, APPLIED AT PHYSIOLOGICAL CONCENTRATIONS
Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
Aim. Evaluation of antibacterial effect of y-globulin fraction bound and free copper and zinc cations, applied in cultures of S. aureus and P. aeruginosa at physiological (micromolar) concentrations. Materials and methods. Day cultures of S. aureus or P. aeruginosa were transferred from agar to physiological solution, and cell suspension was prepared, containing approximately 103 — 104 CFU/ml. Samples of metal-complexes of y-globulin with copper and zinc cations (30 and 45 |ig/ml), control y-globulins (30 and 45 ^g/ml) and salt solutions of copper and zinc, cation content in those corresponded to the quantity of the metal, that had bound with the protein at the stage of metal-complex obtaining (75 ng/ml), were introduced into the suspension. The suspensions were incubated at 37°C for 6 hours, sampling and CFU count according to the accepted micromethod was carried out every 2 hours. By the end of incubation (6 hours of observation) the suspensions were transferred into nutrient broth, thermostated for 1 day at 37°C, transparency of the nutrient broth compared with control (sterile) was evaluated afterwards. Results. Toxic effect of copper and zinc cations is detected starting from the 3rd hour of observation in S. aureus culture. Viable bacteria are absent in the culture with zinc after 6 hours, with copper — after 4 hours of incubation, y-globulin, that had bound copper cations, reduces the quantity of viable cells compared with control protein by 11.9 — 33.0% (p<0.05 — 0.1) at 4 and 6 hours of incubation. In P. aeruginosa culture, toxic effect of copper cations manifests immediately after initiation of the culture and results in realization of complete bactericidal effect after 4 hours of observation. Zinc cations do not have such properties, y-globulin, that had bound copper cations, reduces the quantity of viable cellscompared with control protein at4and6hoursofincubationby 19.3—25.8% (p<0.001). Conclusion. S. aureus bacteria, supported in physiological solution are subject to toxic effect of physiological (micromolar) concentrations of free copper and zinc cations, and also copper cations, bound by human serum y-globulin. P. aeruginosa bacteria under the same conditions experience toxic effect of copper cations (but not zinc), free as well as bound by human serum y-globulin. Whereas a full bactericidal effect is realized in S. aureus and P. aeruginosa cultures in the presence of free cations of copper.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 3, P. 9—18
Key words: antibacterial effect, copper, zinc, S. aureus, P. aeruginosa
ВВЕДЕНИЕ
Одним из факторов вирулентности патогенных бактерий выступает их способность к детоксикации по тяжелым металлам, в частности, меди й цинку [8, 16,17], которые, в свою очередь, играют существенную роль в защите организма хозяина от бактериальных патогенов [8,23, 24]. В реализации токсического действия катионы меди и цинка могут замещать атомы других металлов в каталитических центрах бактериальных белков [8], ингибировать включение бактериальной клеткой необходимых для обеспечения ее жизнедеятельности микроэлементов [19], опосредовать прямое бактериостатическое или бактерицидное действие [5, 24].
Работами последнего времени, включая результаты наших недавних исследований, обоснованы представления о ранее не известных механизмах преодоления толерантности бактерий к тяжелым металлам [5, 9, 13, 18, 21]. Эти механизмы связаны со стабилизацией цинком исходно недоступных металлу сайтов присоединения меди, в результате чего структуры бактериальной стенки могут подвергаться дестабилизирующему воздействию редокс-активных катионов [5, 18, 21]. Эти механизмы связаны также с вызываемым цинком агрегированием поверх-
ностных бактериальных белков, следствием чего оказывается снижение их функциональной пластичности, активности трансмембранного обмена, способности бактерий к формированию биопленок и обретению всего уровня и степени защиты, которые формируются в условиях бактериального сообщества [5,9,13].
Понятно, что в контексте торможения образования биопленки речь может идти только об инициальных стадиях инфекционного процесса — когда биопленка еще не сформировала своего функционального потенциала, не оформилась морфологически и метаболически. По существу, это условия нормального тканевого обмена, не индуцированных межклеточных взаимодействий. Это условия, когда содержание связанного белками и свободного металла в тканях и циркуляции соответствует биохимической норме, а концентрации катионов находятся в пределах физиологических.
Физиологические концентрации меди и цинка в плазме крови человека определяются на уровне 10 — 20 мкМ [14, 20]. При этом медь находится в циркуляции и в тканях в практически полностью связанном белками (преимущественно, церулоплазмином) состоянии, тогда как цинк биологически доступен и в свободной (ионной) форме, содержание которой оценивают в пределах от 0,2 до 1,0 нМ [7,14]. Металл может дополнительно поступать в кровоток или в перикле-точный матрикс тканей за счет активной дегрануляции тромбоцитов и нейтрофи-лов, когда его локальная концентрация возрастает в 30 — 60 раз [7]. Любое тканевое повреждение или воспаление вызывает высвобождение из тромбоцитарных и нейтрофильных депо значительного количества биологически доступного (лабильного) цинка [7, 20]. .
В наших исследованиях культуры бактерий Б.аигеш и Р.аеги^пова проявляли чувствительность к бактериостатическому действию катионов цинка и бактерицидному — меди, примененных в миллимолярных концентрациях [5], а рост Б.аигеш обнаруживал тенденцию к торможению в присутствии 15 нМ меди и 40 нМ цинка [4], т.е. концентраций катионов, почти на три порядка меньших, чем физиологические. При этом, в отличие от меди, активной в свободном (ионном) состоянии [4], эффект катионов цинка в большей степени характеризовал действие металла, связанного белками у-глобулиновой фракции [4].
Целью работы явилась оценка антибактериального действия связанных белками у-глобулиновой фракции и свободных катионов меди и цинка, примененных в культурах Б.аигеш и Р.аеп^поза в физиологических (микромолярных) концентрациях.
Реализация эффекта столь низких концентраций катионов металлов в питательных средах, принятых для культивирования бактерий, сопряжена с известными трудностями, определяемыми возможностью хелатирования катионов присутствующими в объеме белками, гликопротеинами, аминокислотами, саха-рами, активно и неспецифически связывающими металл. Поэтому в работе применена технология перевода бактерий из питательной среды в физиологический раствор и постановки опытов в физиологическом растворе. Это предполагало проведение на препаративном этапе исследования сравнительной оценки устойчивости выделенных клинических изолятов к термостатированию в минимальной по основным питательным компонентам среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Первичные культуры бактерий Б-аигеш и Р.аеп^това получены принятым методом посева патологического биоматериала человека на элективные и селективные питательные среды [1]. В работе использовали один клинический изолят Б.аигеш и один Р.аепщтова, отобранные в ходе предварительных исследований из трех изолятов Б.аигеш и трех изолятов Р.аегщтоэа в качестве наиболее устойчивых к термостатированию в течение 24 час при 37°С в физиологическом растворе — снижение динамики роста бактерий не более чем на 1 ^ (КОЕ/мл).
Для построения кривых роста (выживания) бактерий из суточной культуры
S.aureus или P.aeruginosa, выращенной на чашках Петри с питательным агаром Nutrient Agar (HiMedia Lab.), с использованием стандарта мутности и серии последовательных десятикратных разведений в физиологическом растворе (рН 5,3 — 5,6) готовили суспензию, содержавшую ориентировочно 103 — 104 КОЕ/мл. В полученную суспензию вносили образцы металлокомплексов у-глобулина с медью или цинком и контрольные белки (конечная концентрация 30 или 45 мкг/мл), а также солевые растворы меди (водный сульфат) (Mere) или цинка (хлорид), содержание металлов в которых соответствовало их количеству, связавшемуся с белком на стадии получения экспериментальных образцов (75 нг/мл в 0,15 M NaCl), или контрольный 0,15 M NaCl.
Суспензии бактериальных клеток в объеме 1,5 мл инкубировали при 37°С в течение 6 час. Отбор проб и подсчет числа КОЕ в культуре проводили на 0, 2, 4 и 6 час инкубации в соответствии с принятым микрометодом.
Для установления вклада бактерицидного компонента в действие свободных и связанных белком катионов металлов по окончании срока наблюдения (6 час) в исследуемые пробы объемом 0,5 мл вносили по 4,5 мл питательного бульона Nutrient Broth (HiMedia Lab.). Образцы термостатировали в течение суток при 37°С, после чего оценивали прозрачность питательного бульона в сравнении с контрольным (стерильным).
При математической обработке результатов исследования достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента.
Для получения белковых металлокомплексов использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (ICN) вО,15 Мрастворе NaCl (рН 6,92— 6,93) с концентрацией белка по навеске 100 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассо-циатов мембранной фильтрацией (0,45 мкм, Millipore) образцы у-глобулина инкубировали в течение 1 час при 37°С с водным сульфатом меди (Merc) или хлоридом цинка; концентрация металла — 0,5 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы у-глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без солей указанных металлов.
По истечении срока инкубации опытные и контрольные образцы в объеме 10 мл подвергали двукратной молекулярной ультрафильтрации в ячейках Ultracel-30k (Millipore) в режиме 1700 g 5 мин с умеренным охлаждением. По окончании фракционирования супернатанты поднимали из ячеек, восстанавливали в 0,15 M растворе NaCl и (как и на всех этапах исследования) анализировали спектрофотоме-трически в ультрафиолете, в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 0,1 нм, в автоматическом режиме с использованием дифференцирующего спектрофотометра UV-1800 Shimadzu.
Содержание свободных (не связавшихся с белком) металлов в фильтрате оценивали с Использованием фотометрии реакций комплексообразования: меди — с диэтилдитиокарбаматом натрия (рН 9,0 — 9,2), длина волны 440 нм; цинка — с о-фенантролином (нейтральный рН), длина волны 226 нм (UV-1800 Shimadzu). Далее проводили расчет концентрации металлов, связавшихся с белком.
Расчет показателей изменения оптической плотности и молярных отношений в растворе осуществляли на основании концентрации у-глобулина, установленной спектрофотометрически при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0,7). Полученные и использованные в работе образцы у-глобулина содержали по шесть катионов меди или цинка на молекулу белка.
Кислотность образцов контролировали с помощью базового электронного рН-метра Sartorius PB-11, укомплектованного электродом PY- Р11.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно на рис.1 (А, Б), в физиологическом растворе, дополненном 30 или 45 мкг/мл человеческого сывороточного у-глобулина (линия 1), роста бактерий в культуре S.aureus не наблюдается, количество жизнеспособных клеток в культуре проявляет тенденцию к некоторому монотонному снижению, составляющему на
крайнем сроке наблюдения (6 час) в ед. логарифма КОЕ/мл 14,8 — 24,8% от показателя на старте исследования.
Начиная с третьего часа наблюдения в культуре S.aureus обнаруживается токсическое действие катионов цинка (А, линия 3) и меди (Б, линия 3), примененных в дозе 75 нг/мл. В присутствии катионов цинка жизнеспособные бактерии отсутствуют в культуре спустя 6 час наблюдения (рис. 1, А), в присутствии катионов меди жизнеспособных бактерий не определяется на сроке 4 час после инициации культуры (рис. 1, Б).
Белок, связавший 75 нг/мл катионов цинка (А, линия 2), достоверно не отличается в культуре бактерий S.aureus от контрольного у-глобулина. Белок, связавший 75 нг/мл катионов меди (Б, линия 2), на сроках 4 и 6 час после инициации культуры достоверно снижает количество жизнеспособных клеток в сравнении с контрольным у-глобулином. Выраженная в ед. логарифма КОЕ/мл разница с контрольным белком составляет 11,9% (р<0,05) и 33% (р<0,1) на сроках 4 и 6 час, соответственно.
Очевидно, что поддерживаемые в физиологическом растворе бактерии S.aureus подвержены токсическому действию физиологических концентраций катионов меди и цинка, а также катионов меди, связанных человеческим сывороточным у-глобулином. При этом в присутствии свободных катионов меди и цинка в культуре достигается полный бактерицидный эффект, который в условиях применения катионов меди реализуется на 2 час раньше, чем в присутствии катионов цинка (рис. 1, А и Б).
Как видно на рис. 2 (А, Б), в физиологическом растворе, дополненном 30 или 45 мкг/мл человеческого сывороточного у-глобулина (линия 1), в культуре Р. aeruginosa отмечается некоторый рост числа жизнеспособных клеток (А) или их количество практически не меняется на всем сроке наблюдения — до 6 час после инициации культуры (Б).
Сразу же после внесения 75 нг/мл катионов меди в культуре P.aeruginosa проявляется их токсическое действие на клетки бактерий, приводящее на сроке 4 час наблюдения к реализации полного бактерицидного эффекта (Б, линия 3). Катионы
Рис. 1. Торможение роста культуры Б.аигеив в присутствии металлокомплексов человеческого сывороточного т-глобулина, образованных с катионами цинка (А) и меди (Б) в сравнении с эффектом контрольных белков и катионов металлов, примененных изолированно, п=6.
*р<0,1 и **р<0,05 по сравнению с контрольным белком (1), ***р<0,02 по сравнению с катионами цинка (3), ****р<0,001 по сравнению с контрольным белком (1) и модифицированным катионами металлов у-глобулином (2). Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс — время инкубации (час), по оси ординат — 1й(КОЕ/мл). 1 (А и Б) — контрольные у-глобулины, 2 (А) — модифицированный цинком у-глобулин, 2 (Б) — модифицированный медью у-глобулин, 3 (А) — катионы цинка, 3 (Б) — катионы меди; точка с ординатой 0 приведена на сроке, когда в культуре отсутствуют жизнеспособные бактерии (подтверждено оценкой стерильности питательного бульона).
Рис. 2. Торможение роста культуры P.aeruginosa в присутствии металлокомплексов человеческого сывороточного у-глобулина, образованных с катионами цинка (А) и меди (Б) в сравнении с эффектом контрольных белков и катионов металлов, примененных изолированно, п=6 или п=9.
*р<0,02 по сравнению с контрольным белком (1), **р<0,001 по сравнению с катионами цинка (3), ***р<0,001 по сравнению с контрольным белком (1) и модифицированным катионами металлов у-глобулином (2) —А и Б или по сравнению с контрольным белком (1) — Б.
цинка, примененные в дозе 75 нг/мл, подобным действием в отношении клеток P.aeruginosa не обладают (А, линия 3). Они, скорее, реализуют бакгериостатическое действие, поскольку в сравнении с чистым физиологическим раствором снижают число жизнеспособных клеток в культуре P.aeruginosa на 9,4% (р<0,001).
Белок, связавший 75 нг/мл катионов цинка (А, линия 2), достоверно не отличается в культуре бактерий P.aeruginosa от контрольного у-глобулина. Белок, связавший 75 нг/мл катионов меди (Б, линия 2), на сроках 4 и 6 час после инициации культуры достоверно снижает количество жизнеспособных бактерий в сравнении с контрольным у-глобулином. Выраженная в ед. логарифма КОЕ/мл разница с контрольным белком составляет 19,3% (р<0,001) и 25,8% (р<0,001) на сроках 4 и 6 час наблюдения, соответственно.
Следовательно, поддерживаемые в физиологическом растворе бактерии Р. aeruginosa подвержены токсическому действию физиологических концентраций катионов меди, а также катионов меди, связанных человеческим сывороточным у-глобулином. В отличие от свободных катионов цинка и катионов меди, связанных белками у-глобулиновой фракции, свободные катионы меди реализуют в отношении P.aeruginosa очевидное бактерицидное действие (рис. 2 А, Б).
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследования получены в культурах бактерий, поддерживавшихся в ходе постановки экспериментов в физиологическом растворе, дополненном физиологическими (микромолярными) концентрациями катионов меди и цинка, примененных в виде водного сульфата и хлорида, соответственно, человеческим сывороточным у-глобулином и его металлокомплексами, образованными белком, связавшим физиологические (микромолярные) концентрации катионов меди или цинка.
Как и в наших предшествующих исследованиях, выполненных на модели «капли на газоне» [5], катионы цинка реализуют выраженное токсическое действие на клетки S.aureus и не обладают подобными свойствами в отношении бактерий P.aeruginosa. В связанном белками у-глобулиновой фракции состоянии катионов цинка эффект их воздействия в культуре S.aureus утрачивается, а для клеток P.aeruginosa металлокомплекс у-глобулина с цинком, скорее, выступает питательным субстратом, необходимым для жизнеобеспечения бактерий и соответствующим контрольному у-глобулину. ,
Диапазон активности катионов меди значительно шире, чем цинка. Как в отношении клеток S.aureus, так и в культуре P.aeruginosa, они обеспечивают достижение полного бактерицидного эффекта, который в обеих культурах регистрируется на сроке 4 час от старта исследования. При этом показательно, что аналогично экспериментальной модели «капли на газоне» [5] чувствительность P.aeruginosa к воздействию катионов меди оказывается заметно выше, чем клеток S.aureus, в отношении которых спустя 2 час от старта исследования токсичность металла не определяется. Клетки P.aeruginosa в присутствии катионов меди теряют в течение первых 2 час наблюдения почти 75% численности популяции, выраженной в ед. логарифма КОЕ/мл (р<0,001 по сравнению с действием катионов цинка).
В отличие от цинка, будучи хелатированными белками у-глобулиновой фракции, катионы меди сохраняют способность ингибировать размножение клеток в культурах S.aureus и P.aeruginosa, достоверно снижать в динамике наблюдения число жизнеспособных бактерий.
В сравнении с широким спектром токсической активности катионов меди, реализуемой в отношении как грамотрицательных (P.aeruginosa), так и грамполо-жительных (S.aureus) бактерий, действие катионов цинка в значительно большей степени специфично. Известно, что металл определяет функциональную активность многих поверхностных белков и факторов вирулентности патогенных стрептококков [23]. Установлено также, что в концентрациях, не ингибирующих рост Escherichia coli, цинк снижает экспрессию факторов вирулентности бактерий и адгезию клеток в культуре [ 11 ].
Сказанное позволяет рассматривать эффекты цинка в отношении этих бактерий в качестве патоген-специфических [11, 23] и предполагать, следовательно, реализацию патогенами определенных сигнальных путей, замкнутых на участке, связанных с воздействием или находящихся под контролем катионов цинка, распределенных в межклеточном пространстве.
Действие металла на патогенные стафилококки тоже можно трактовать как патоген-специфическое. Кальпротектин нейтрофилов, хелатируя пищевой цинк, вызывает перепрограммирование бактериального транскриптома и ингибирует рост S.aureus [10]. Наоборот, в обогащенных металлом абсцессах отмечают активную пролиферацию бактерий [10].
Белки у-глобулиновой фракции, хелатирующие катионы металлов из пери-глобулярного пространства, в силу своих физико-химических и биофизических характеристик выступают переносчиками цинка и меди, пусть даже в локальном окружении [3]. По отношению к бактериям S.aureus, экспрессирующим в качестве одного из факторов патогенности поверхностный белок А, служащий Fe рецептором (FcR) клеток [2], у-глобулины и их металлокомплексы представляются естественными лигандами, сбрасывание которых с рецептора вызывает активацию клетки бактерии [2].
В условиях метаболического стресса, которому подвергаются бактерии, переведенные для поддержания в физиологический раствор, белки у-глобулиновой фракции и их металлокомплексы, компенсируя недостаточность питательного субстрата, посредством связывания FcR могут поступать в периплазму и цитозол ь S.aureus и переносить присоединенный ими металл (цинк или медь) внутрь бактериальной клетки.
Но поскольку в биологических системах большая часть цинка (до 70% в плазме крови) непрочно связана с белками (включая у-глобулины), нет необходимости транспортировать металл в клетку бактерии в связанном белком состоянии [3,6]. Под действием активируемых контактом клетки с лигандом FcR протеолитических ферментов поверхности цинк может высвобождаться белком в периклеточное (пристеночное) пространство и поступать в клетку напрямую, независимо от трансмембранного перемещения доставившего металл к клетке белка [3, 6]. И хотя у некоторых бактерий, например E.coli, репрессия импортера цинка ZnuC
отмечается при более низких концентрациях металла, чем индукция экспортера ZntA [26], условия метаболического стресса и белкового голодания могут существенно изменять функционирование систем жизнеобеспечения бактерий и способствовать реализации вектора транспорта металла внутрь клетки даже при физиологических, значительно превышающих пороговые по активации импортеров, концентрациях цинка в пристеночном пространстве бактерии [26].
Сказанное в той же степени относится к катионам меди, хотя составляющая 10"21 М аффинность наиболее чувствительного к меди сенсора бактерий E.coli CueR на несколько порядков превышает таковую цинковых сенсорных белков Zur и ZntR, соответствующую 10"15 М [25]. Достаточно сравнить результаты данной работы по меди и цинку, чтобы вынести заключение о высоком сходстве динамики выживания бактерий S.aureus в присутствии свободных катионов металлов и накоплении меди, как и цинка, внутри бактериальной клетки. Понятно, что катионы меди и цинка слишком различаются реализуемой редокс-активностью и участием в окислительно-восстановительных процессах, чтобы вызвать форсированную и пролонгированную всего до 2 час гибель бактерий исключительно за счет внешнего воздействия на мембрану.
Показательны данные, полученные в нашей работе в культуре бактерий P.aeruginosa, для которых не описано поверхностных структур, соответствующих белку A S.aureus и способных связывать белки у-глобулиновой фракции посредством захвата их Fe региона [2]. Тем не менее, динамика выживания бактерий S. aureus и P.aeruginosa совпадает по времени реализации полного бактерицидного эффекта свободных катионов меди (4 час от старта исследования) и демонстрирует сходные тенденции в условиях применения связавшего катионы меди у-глобулина. <
Следовательно, в условиях метаболического стресса, сопровождающегося белковым голоданием, подверженные воздействию неблагоприятных факторов бактерии перепрограммируют системы жизнеобеспечения и включают дополнительные механизмы извлечения питательных веществ из внешней среды. Возникает нагрузка клетки металлом, которая не компенсируется активным эффлюксом, поскольку системы детоксикации в названных неблагоприятных условиях тоже будут испытывать недостаток субстратов для обеспечения эффективной работы. -
Рассматривая полученные данные в контексте взаимодействия патогена с клетками организма хозяина в ходе развития инфекционного процесса можно полагать, что в реальных условиях инфицирования весьма вероятны и достаточно широко распространены ситуации, при которых бактерии, инфицирующие биологические жидкости и ткани макроорганизма, испытывают воздействие неблагоприятных для них местных или системных изменений гомеостаза в локальном окружении.
Известно, что первичный острофазовый ответ на инфекцию предполагает системное перераспределение цинка (а возможно, и меди) в организме, приводящее к резкому снижению содержания металла в плазме и накоплению его в тканях (прежде всего, печени), где цинк, как и медь, достаточно прочно связывается металлотионеинами [6]. В результате, количество доступного для усвоения бактериями металла существенно снижается, в бактериальных клетках активируется работа транспортеров (у сальмонелл — ZnuABC), позволяющих извлекать цинк из внешней среды, лимитированной по доступности металла [6].
С другой стороны, как отмечено выше, любое тканевое повреждение или воспаление сопровождается активной дегрануляцией тромбоцитов и нейтрофилов, приводящей к высвобождению из внутриклеточных депо значительного количества лабильного (свободного) цинка, в результате чего локальная концентрация металла может возрастать в 30 — 60 раз [7,20]. И хотя эффективность систем детоксикации бактерий по тяжелым металлам необычайно высока [8,16,17], осла-
бленные клетки патогена будут испытывать серьезные проблемы с эффлюксом цинка в условиях многократного повышения его содержания в пристеночном окружении [7, 20].
Не исключено при этом, что активный выброс цинка из клетки может компенсироваться, особенно на фоне формирующейся дисрегуляции транспортных процессов, поступлением в клетку определенного количества меди, известной функциональным антагонизмом цинку и способной даже в физиологических концентрациях реализовать бактерицидное действие, в том числе, на клетки Р. aeruginosa, считающиеся высокорезистентными к ней [22].
Свидетельства тому, что ослабленные, поддерживаемые в условиях, неблагоприятных для обеспечения жизнедеятельности, бактерии не справляются с активным эффлюксом металла и утрачивают толерантность к его токсическому воздействию, очевидно, представляют результаты опытов на сухих медных поверхностях, в ходе которых вследствие так называемого контактного киллинга численность бактериальных популяций снижалась на 7 — 8 ед. логарифма КОЕ/ мл за 1 час, до полного отсутствия нанесенных аэрозолем жизнеспособных бактерий после длительной инкубации [15].
В определенном алгоритме сравнения воздействие сухой меди на клетки бактерий, прежде всего, S.aureus, оказывается более эффективным, чем меди, поступающей из раствора [15]. В клетках бактерий, инкубирующихся на сухих медных поверхностях, накапливается больше катионов меди, чем в клетках суспензионной культуры, извлекающих из питательной среды растворенную медь [12]. Уже спустя несколько минут инкубации отмечают повреждение мембраны с последующей утратой целостности бактериальной клетки [12].
Понятно, что системы детоксикации бактерий по тяжелым металлам замкнуты на сохранность и известную степень гидратации поверхностных структур. Дегидратация поверхности клетки резко ограничивает возможности бактерии выводить избыток тяжелых катионов и, наоборот, повышает эффективность реализации механизмов их токсического воздействия [12,15].
С позиций метаболического стресса, ослабляющего системы детоксикации бактерий по тяжелым металлам и формирующего условия проявления токсического воздействия физиологических концентраций катионов меди и цинка на грамположительные (S.aureus) и грамотрицательные (P.aeruginosa) бактерии, обоснованно полагать, что в развитии любого инфекционного процесса отдельные этапы взаимодействия патогена с организмом хозяина могут контролироваться физиологическими концентрациями катионов меди и цинка, способными, следовательно, вносить определенный вклад в реализацию механизмов антибактериальной защиты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Медицинская микробиология. В.И.Покровский, О.К.Поздеев (ред.). М., ГЭОТАР Медицина, 1998.
2. Тотолян А.А., Бурова Л.А. Fc-рецепторные белки Streptococcus pyogenes и патогенез постинфекционных осложнений. Журн. микробиол. 2014, 3: 78-90.
3. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Голуб А.Е., Денисова Е.А., Воробьёва У.А. Эффекты меди и цинка при связывании с человеческим сывороточным у-глобулином. Мед. иммунология. 2006, 8 (5-6): 615-622.
4. Чекнёв С.Б., Вострова Е.И., Писковская Л.С., Востров А.В. Эффекты катионов меди и цинка, связанных белками у-глобулиновой фракции, в культуре Staphylococcus aureus. Журн. микробиол. 2014, 3:4-9.
5. Чекнёв С.Б., Вострова Е.И., Апресова М.А., Писковская Л.С., Востров А.В. Торможение роста бактерий в культурах Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в присутствии катионов меди и цинка. Журн. микробиол. 2015, 2:9-17.
6. Ammendola S., Pasquali P., Pistoia С. et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is
2.ЖМЭИ 3 № 24-2016
17
required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infect. Immunity. 2007, 75 (12): 5867-5876.
7. Borza D.-B., Morgan W.T. Histidine-proline-rich glycoprotein as a plasma pH sensor. Modulation of its interaction with glycosaminoglycans by pH and metals. J. Biol. Chemistry. 1998, 273 (10): 5493-5499. .
8. Botella H., StadthagenG., Lugo-Villarino G. etal. Metallobiology of host-pathogen interactions: an intoxicating new insight. Trends Microbiol 2012,20(3):106-112.
9. Conrady D.G., Brescia C.C., Horii K. et al. A zinc-dependent adhesion molecule is responsible for intercellular adhesion in staphylococcal biofilms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105(49): 19456-19461.
10. Corbin B.D., Seeley E.H., Raahi A. et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 2008,319 (15); 962-965. ,. ..
11. Crane J.K., Naeher T.M., Shulgina I. et al. Effect of zinc in enteropathogenic Escherichia coli infection. Infect. Immunity. 2007,75 (12): 5974r5984, ;
12. Espirito Santo C., Lam E.W., Elowsky C.G. et al. Bacterial killing by dry metallic copper surfaces. Appl. Environm. Microbiol. 2011,77 (3): 794-802.
13. Golub E.E., Cheruka J., Boosz B. et al. A comparison of bacterial aggregation induced by saliva, lysozyme, and zinc. Infect. Immunity. 1985,48 (1): 204-210.
14. Gorgani N.N., Parish C.R., Altin J.G. Differential binding of histidine-rich glycoprotein (HRG) to human IgG subclasses and IgG molecules containing к and X light chains. J. Biol. Chemistry. 1999,274 (42): 29633-29640.
15. Grass G., Rensing C., Solioz M. Metallic copperas an antimicrobial surface. Appl. Environm. Microbiol. 2011. 77 (5): 1541-1547.
16. Hodgkinson V., Pétris M.J. Copper homeostasis at the host-pathogen interface. J. Biol. Chemistry. 2012, 287 (17): 13549-13555.
17. Hood M. I., Skaar E.P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Rev. Microbiol. 2012, 10: 525-537.
18. Lu Y. Metal ions as matchmakers for proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107 (5): ■ 1811-1812.
19. Remy L., Carrière M., Derré-Bobillot M. et àl. The Staphylococcus aureus Oppl ABC transporter imports nickel and cobalt in zinc-depleted conditions and contributes to virulence. Molec. Microbiol. 2013, 87 (4): 730-743.
20. Rink L., Kirchner H. Zinc-altered immune function and cytokine production. J. Nutrition. 2000, 130 (5, Suppl.): 1407-1411.
21.Salgado E.N., Ambroggio X.1., Brodin J.D. et al. Metal templated design of protein interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107 (5): 1827-1832. 22. Samanovic M.I., Ding C., Thiele D.J., Darwin K.H. Copperin microbial pathogenesis: med-
ding with the metal. Cell Host Microbe. 2012,11:106-115. 23.Shafeeq S.., Kuipers O.P., Kloostermah T.G. The role of zinc in the interplay between pathogenic streptococci and their hosts. Moled. Microbiol. 2013, 88 (6): 1047-1057.
24. Stafford S.L., Bokil N.J., Achard M.E.S. et al. Metal ions in macrophage antimicrobial pathways: emerging roles for zinc and copper. Bioscience Reports. 2013, 33 (4): 541-554.
25. Wàldron К. J., Robinson N J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal? Nature Rev. Microbiol. 2009, 7: 25-35.
26. Yamamoto K., Ishihama A. Transcriptional response of Escherichia coli to external zinc. J. Bacteriol. 2005, 187 (18): 6333-6340.
Поступила 05.11.15
Контактная информация: Чекнёв Сергей Борисович, д.м.н., 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)190-43-88
