CC BY
67
84
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2012. Вып. 4 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Физиологические исследования
УДК 612.017.1:612-092
Л.В. Бедулева, А.С. Корепанов, И.В. Меньшиков, А.О. Сосновцева, Е.Ю. Столярова
ТОЛЕРАНТНОСТЬ, ВЫЗВАННАЯ ЦИКЛОСПОРИНОМ А В МОДЕЛИ КОЛЛАГЕН-ИНДУЦИРОВАННОГО АРТРИТА КРЫС,
ОПОСРЕДОВАНА РЕВМАТОИДНЫМ ФАКТОРОМ
Циклоспорин А - широко используемый в клинической практике иммуносупрессант, особенностью действия которого является формирование трансплантационной толерантности. Способность циклоспорина А индуцировать толерантность к антигену указывает на то, что в механизм действия циклоспорина А вовлечены регуляторные механизмы, поддерживающие состояние иммуносупрессии после отмены циклоспорина А. Важная роль ревматоидного фактора в супрессии иммунного ответа позволяет предполагать, что ревматоидный фактор может быть вовлечен в установление толерантности, вызываемой циклоспорином А. Целью работы было исследование роли ревматоидного фактора в индуцированной циклоспорином А супрессии иммунного ответа в модели коллаген-индуцированного артрита крыс. Крысам вводили циклоспорин А в течение 5 дней после иммунизации бычьим коллагеном, включая день иммунизации. Ревматоидный фактор был измерен с помощью 2 разных тест-систем, которые позволяют определять 2 разные по специфичности популяции ревматоидного фактора. Одну из популяций определяли в тест-системе, где антигеном выступают танизированные нагруженные гомологичным IgG эритроциты, другую - в тест-системе, где антигеном служит IgG кролика. Обнаружено, что циклоспорин А, предъявляемый крысам в течение 5 дней после иммунизации бычьим коллагеном, подавляет продукцию антител против коллагена, но вызывает интенсивную продукцию обеих популяций ревматоидного фактора с максимумами на 7-й и 14-й день после иммунизации. Животные, получившие пятидневный курс циклоспорина А после иммунизации бычьим коллагеном, не отвечают на повторное предъявление бычьего коллагена, что указывает на развитие толерантности к нему. Ассоциация между развитием толерантности к бычьему коллагену и индукцией высокого уровня популяций ревматоидного фактора, выявленная у крыс, иммунизированных коллагеном и получивших циклоспорин А, указывают на то, что механизмом, обеспечивающим толерантность, вызванную циклоспорином А, является установление регуляторного контроля над лимфоцитами специфичными к коллагену, осуществляемого ревматоидным фактором.
Ключевые слова: циклоспорин А, ревматоидный фактор, идиотип-антиидиотипические взаимодействия, индуцированная толерантность, коллаген-индуцированный артрит.
Циклоспорин А (ЦсА) отличается от других иммунодепрессантов способностью специфически супрессировать иммунный ответ и формировать трансплантационную толерантность [1]. Поэтому ЦсА нашел широкое применение в клинике для предотвращения отторжения трансплантата, развития реакции трансплантат против хозяина, лечения некоторых аутоиммунных заболеваний.
Уникальные свойства циклоспорина А были объяснены селективным влиянием на регуляторные популяции Т-лимфоцитов [1]. Обнаружено, что ЦсА эффективно подавляет начальные этапы активации Т-хелперов, что приводит к ингибированию продукции ими целого спектра цитокинов ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ГМ-КСФ, альфа-ФНО, гамма-интерферона [1; 2], необходимых для пролиферации, роста и диф-ференцировки лимфоцитов, ведомых Т-хелперами (В-лимфоцитов и предшественников цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов), а также самих Т-хелперов. В отличие от эффекта, оказываемого на Т-хелперы, ЦсА не мешает индукции и увеличению активности антиген-специфических Т-супрессоров [1]. Однако в настоящее время антиген-специфические Т-супрессоры не выделяют в отдельную субпопуляцию лимфоцитов, механизмы ограничения иммунного ответа с участием Т-супрессоров остаются не ясны.
C. Cunningham обнаружил, что за супрессию иммунного ответа, вызванную ЦсА, могут быть ответственны антиидиотипические антитела [3]. Ранее мы показали, что важным фактором супрессии иммунного ответа, осуществляемой через идиотип-антиидиотипические взаимодействия, является ревматоидный фактор (РФ). Так, высокий уровень ревматоидного фактора в фазу индукции иммунного ответа препятствует развитию экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний: коллаген-индуцированного артрита крыс [4], аутоиммунной гемолитической анемии у мышей [5]. Стимуляция продукции РФ у крыс с индуцированным артритом подавляет аутоиммунную реакцию к коллагену и значительно редуцирует симптомы артрита [6]. Наличие идиотип-антиидиотипических взаи-
модействий между РФ и антителами разной специфичности [7-10] позволяет предполагать, что РФ -универсальный фактор супрессии иммунного ответа и может опосредовать иммуносупрессию, вызываемую циклоспорином А. Целью работы было исследование роли ревматоидного фактора в индуцированной циклоспорином А супрессии иммунного ответа.
Материалы и методика исследований
Крысы Wistar массой 150-170 г были поделены на 3 группы. Группа 1 (БК+ЦсА), n=8, была иммунизирована бычьим коллагеном (БК) (Elastin, USA) и получала инъекции циклоспорина А (Сан-диммун-Неорал, Новартис). Группе 2 (ЦсА), n=6, вводили циклоспорин А. Группа 3 (БК), n=10, была иммунизирована бычьим коллагеном. БК вводили внутрикожно в дозе 400 мкг, в НАФ (Sigma). Циклоспорин А вводили в дозе 25 мг/кг подкожно ежедневно в течение 5 дней, включая день начала эксперимента. Через 9 недель после начала эксперимента крыс всех групп подвергали иммунизации бычьим коллагеном в НАФ. Для групп 1 и 3 иммунизация БК через 9 недель после начала эксперимента являлась повторной, для группы 2 - первичной.
Кровь у крыс забирали еженедельно, кардиальной пункцией под анестезией, для построения индивидуальной кинетики исследуемых антител. В плазме крови определяли уровень антител к БК, уровень популяций РФ. РФ был измерен с помощью двух разных тест-систем, которые позволяют определять две разные по специфичности популяции РФ. Одну из популяций РФ определяли в тест-системе, где антигеном выступают танизированные нагруженные гомологичным IgG эритроциты (РФ1) [11], другую - в тест-системе, где антигеном являются IgG кролика (РФ2) [12]. Антитела против БК определяли методом ИФА. Для оценки достоверности различий был использован критерий Манна-У итни.
Результаты и их обсуждение
У крыс, иммунизированных БК и получивших пятидневный курс ЦсА (группа 1), не выявлено ни повышения уровня антител к БК, ни признаков артрита, тогда как у контрольных животных, иммунизированных БК (группа 3), наблюдается повышение уровня антител к БК, у 40 % крыс, иммунизированных БК, иммунный ответ сопровождается артритом (рис. 1).
ш
И -н о а с
5
0 1 2 3 4 5 6
недели после примирования
■ А. - БК + ЦсА (группа 1, п=8)
—— ЦсА (группа 2, п=6)
-----БК. устойчивые к артриту крысы (группа 3, п=6)
—♦— БК, артритные крысы (группа 3, п=4)
Рис. 1. Кинетика антител против БК у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА (группа 1); крыс, получивших ЦсА (группа 2); крыс, иммунизированных БК (группа 3). Каждая точка представлена средним ±SD
Наблюдаемая супрессия иммунного ответа против БК и предотвращение развития артрита у крыс, получивших ЦсА в течение 5 дней после иммунизации БК, не противоречит известным эффектам ЦсА подавлять иммунный ответ против антигена при предъявлении ЦсА в фазу индукции иммунного ответа [13].
2012. Вып. 4 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Неожиданным оказалось то, что иммунизация БК вместе с пятидневным курсом введения циклоспорина А вызывает интенсивную продукцию обеих популяций ревматоидного фактора - РФ 1, с максимумом на 7-й день после иммунизации (рис. 2) и РФ 2, с максимумом образования на 14-й день после иммунизации (рис. 3). Таким образом, ЦсА, предъявляемый крысам в течение 5 дней после иммунизации БК, предотвращает развитие гуморального иммунного ответа против БК, но вызывает интенсивную продукцию ревматоидных факторов.
3000 2500 -
Рис. 2. Кинетика РФ1 у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА; крыс, получивших ЦсА; крыс, иммунизированных БК. Каждая точка представлена средним ±SD. * - достоверно по сравнению
с группой 3 (р< 0,05)
Рис. 3. Кинетика РФ2 у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА; крыс, получивших ЦсА; крыс, иммунизированных БК. Каждая точка представлена средним ±SD. * - достоверно по сравнению
с группой 3 (р< 0,05)
Сравнение уровня РФ1 и РФ2 у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА (группа 1), и крыс, иммунизированных БК и оказавшихся устойчивыми к артриту (группа 3), показало, что уровень РФ1 и РФ2 на максимумах их образования в преартритный период у крыс, иммунизированных
БК и получивших курс ЦсА, достоверно выше, чем у крыс, устойчивых к артриту (рис. 2, 3). Ранее нами было показано и воспроизведено в настоящем эксперименте, что повышение уровня РФ1 и (или) РФ2 в преартритный период (1-2 недели после иммунизации) у крыс, иммунизированных БК, ассоциировано с нормальным иммунным ответом против БК и устойчивостью к развитию артрита [4], тогда как отсутствие повышения в обеих исследуемых популяциях РФ в этот период ведет к гипе-риммунному ответу на антиген и развитию артрита (рис. 2, 3). Поэтому можно предполагать, что супрессия иммунного ответа против БК, вызванная ЦсА, - результат не только подавления активности Т-хелперов специфичных к БК, но и высокой активности РФ-продуцирующих лимфоцитов.
Почему ЦсА, предъявленный в фазу индукции иммунного ответа, подавляя продукцию антител против БК, не подавляет, а усиливает продукцию РФ?
Известно, что индукция РФ-продуцирующих лимфоцитов в модели коллаген-индуцированного артрита крыс происходит через идиотип-антиидиотипические взаимодействия с лимфоцитами против БК [4]. Учитывая, что иммуносупрессорное действие ЦсА основано на подавлении активности Т-хелперов [1; 2], можно предполагать, что идиотип опосредованная индукция РФ не зависит от Т-хелперов, поэтому РФ-продуцирующие лимфоциты в модели коллаген-индуцированного артрита не подвергаются ингибированию циклоспорином А.
Анализ уровня популяций РФ у крыс, получивших только циклоспорин А (группа 3), показал, что само по себе введение циклоспорина А не приводит к повышению уровня РФ1 (рис. 2) или РФ2 (рис. 3). Поэтому более интенсивная продукция популяций РФ у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА, по сравнению с иммунизированными БК, не является результатом прямого аддитивного влияния ЦсА на продукцию РФ. Интенсивная продукция РФ у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА, может быть результатом отсутствия контррегуляторного влияния со стороны лимфоцитов против БК. Обычно в ходе иммунного ответа, вызванного БК, антитела против БК, будучи связаны в идиотипических взаимодействиях с РФ-продуцирующими лимфоцитами, нарастают вслед за РФ, вызывая снижение его уровня. В случае иммунизации крыс БК и предъявления им ЦсА в течение 5 дней продукция антител к БК супрессирована и не ограничивает рост РФ.
Учитывая, что РФ является фактором негативной регуляции активности антиколлагеновых лимфоцитов [4-6], интенсивный ответ РФ1 и РФ2 у крыс, иммунизированных БК и получивших ЦсА, позволяет предполагать, что супрессия иммунного ответа против БК, вызванная его предъявлением с ЦсА, может быть устойчивой, то есть представлять собой толерантность к коллагену. Для проверки предположения, что ЦсА вызывает толерантность к антигену, крыс всех групп иммунизировали БК повторно, через 9 недель после начала эксперимента.
Исследование вторичного иммунного ответа против БК у групп 1 и 3 (рис. 4) показало, что вторичный иммунный ответ против БК у крыс, получивших циклоспорин А вместе с первичной иммунизацией БК (группа 1), в 15 раз слабее, чем у крыс, иммунизированных ранее БК (группа 3).
Рис. 4. Вторичный иммунный ответ против БК. БК введен через 9 недель после начала эксперимента. Каждая точка представлена средним от 4 животных±SD
2012. Вып. 4
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Иммунный ответ против БК у группы 1 слабее также, чем у крыс группы 2, получивших ранее циклоспорин А, несмотря на то, что для крыс группы 1, в отличие от крыс группы 2, предъявление БК повторное, что предполагает более сильный иммунный ответ. Вторичный иммунный ответ к коллагену у крыс группы 1 не только слабый, но и быстро затухающий. Таким образом, иммунизация крыс БК, вместе с предъявлением циклоспорина А в течение 5 дней, формирует неотвечаемость на повторное предъявление БК, то есть индуцирует толерантность к БК.
Исследование уровня РФ1 в ходе вторичного иммунного ответа против БК (рис. 5) показало, что вторичный иммунный ответ против БК, наблюдаемый у крыс группы 1, в отличие от других групп, сопровождается повышением уровня РФ1, который «завершает» иммунный ответ против БК (рис. 5).
Рис. 5. Кинетика РФ1 и антител против БК в ответ на иммунизацию БК через 9 недель после начала эксперимента: а - группа 1 (БК+ЦсА); б - группа 3 (БК, устойчивые к артриту крысы); в - группа 2 (ЦсА). Каждая точка представлена средним от 4 животных±SD
Таким образом, толерантность к бычьему коллагену, вызванная циклоспорином А в модели коллаген-индуцированного артрита крыс, ассоциирована с интенсивной продукцией популяций ревматоидного фактора. Можно предполагать, что популяции ревматоидного фактора осуществляют супрессорную регуляцию активности лимфоцитов против бычьего коллагена через идиотип-антиидиотипические взаимодействия.
Выводы
Пятидневный курс введения циклоспорина А, начатый одновременно с иммунизацией бычьим коллагеном, индуцирует толерантность к коллагену в модели коллаген-индуцированного артрита крыс. Толерантность, вызванная циклоспорином А, ассоциирована с интенсивной продукцией популяций ревматоидного фактора.
Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России». Лот «Поддержка научных исследований, проводимых научными группами под руководством докторов наук по научному направлению “Биология, медицина” в области: Фундаментальная медицина и физиология. Тема “Исследование механизмов негативной регуляции аутореактивных лимфоцитов и разработка фармацевтической субстанции, подавляющей аутоиммунные реакции”». 2012-2013; Грантом II Республиканского конкурса инновационных проектов по программе «У.М.Н.И.К.» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. 2012.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hess A.D., Colombani P.M., Esa A.H. Cyclosporine and the immune response: basic aspects // Crit. Rev. Immunol. 1986. Vol. 6. P.123-149.
2. Rostaing L., Puyoo O., Tkaczuk J., Peres C., Rouzaud A., Cisterne J.M., de Preval C., et al. Differences in Type 1 and Type 2 intracytoplasmic cytokines, detected by flow cytometry, according to immunosuppression (cyclosporine A vs. tacrolimus) in stable renal allograft recipients // Clin. Transplant. 1999. № 5. P. 400-409.
3. Cunningham C., Power D.A., Stewart K., Catto G. The influence of cyclosporin A on alloantibody responses in inbred rats: provisional evidence for a serum factor with antiidiotypic activity // Clin. exp. Immunol. 1988. Vol. 72. P. 130-135.
4. Beduleva L., Menshikov I. Role of idiotype-anti-idiotype interactions in the induction of collagen-induced arthritis in rats // Immunobiology. 2010. Vol. 215. P. 963-970.
5. Корепанов А.С., Бедулева Л.В., Меньшиков И.В., Князев А.В. Идиотипические механизмы регуляции развития аутоиммунной реакции в экспериментальной модели аутоиммунной гемолитической анемии у мышей // Вестн. Удм. ун-та. Сер. Биология. Науки о Земле. 2012. Вып. 2. С. 62-67.
6. Меньшиков И.В., Бедулева Л.В. Применение Fc-фрагментов иммуноглобулина класса G в качестве антигена для лечения ревматоидного артрита, средство и способ лечения. Патент на изобретение № 2385164. 2010.
7. Carson D.A., Chen P.P., Fox R.I., Kipps T.J., Jirik F., Goldfien R.D., Silverman G., Radoux V., Fong S. Rheumatoid factor and immune networks // J. Clin. Invest. 1991. Vol. 87. P. 379-383.
8. Hunt Gerardo S., Persselin J.E., Stevens R.H. Human IgG anti-F(ab')2 antibodies possess rheumatoid factor activity // Clin. Exp. Immunol. 1990. Vol. 81. P. 293-300.
9. Nardella F.A., Oppliger I.R., Stone G.C., Sasso E.H., Mannik M., et al. Fc epitopes for human rheumatoid factors and the relationships of rheumatoid factors to the Fc binding proteins of microorganisms // Scand. J. Rheumatol. Suppl. Vol. 75. P. 190-198.
10. Kojima K., Yamada T., Ohgaki S., Tanaka H. Crossreaction of monoclonal antiidiotypic antibodies specific for human antithyroglobulin antibody with the Fc portion of human IgG // J. Rheumatol. 1988. Vol. 15. P 587-592.
11. Oreskes I., Mandel D. Reactivity of sized thermal aggregates of immunoglobulin G with IgM rheumatoid factor // Immunology. 1984. Vol. 51. P. 115-121.
12. Tuomi T. Which antigen to use in the detection of rheumatoid factors? Comparison of patients with rheumatoid arthritis and subjects with 'false positive' rheumatoid factor reactions // Clin. Exp. Immunol. 1989. Vol. 77. P. 349-355.
13. Kaibara N., Hotokebuchi T., Takagishi K., Katsuki I. Paradoxical effects of cyclosporin A on collagen arthritis in rats // J. Exp. Med. 1983.Vol.158. P. 2007-2015.
Поступила в редакцию 13.09.12
2012. Вып. 4 БИОЛОГИЯ. НАУ^ О ЗЕМЛЕ
L. V. Beduleva, A.S. Korepanov, I. V. Menshikov, A.O. Sosnovtseva, E.Yu. Stolyarova
Tolerance caused by cyclosporine A in rat collagen-induced rheumatoid-factor-mediated arthritis model
Cyclosporin A is an immunosupressor widely used in clinical practice. The peculiarity of its action is the formation of a transplantation tolerance. The ability of cyclosporin A to induce the antigen-specific tolerance means that the mechanism of cyclosporin A action involves the regulatory mechanisms which maintain the state of immune suppression after withdrawal of cyclosporin A. The important role of rheumatoid factor in the suppression of immune response allows to assume that rheumatoid factor can be involved into the process of reaching tolerance caused by cyclosporin A. It is the purpose of the present paper to investigate the role of rheumatoid factor in cyclosporin A induced suppression in rat collagen-induced arthritis model. We have revealed that a five-day course of cyclosporine A after immunization with bovine collagen (the day of the immunization included) induces tolerance to bovine collagen. Rheumatoid factor was measured by means of two different test systems allowing to define two populations of rheumatoid factor. Said populations differed in specificity. One of the populations was defined in the test system where IgG-homologous-coated erythrocytes acted as the antigen. The other population was defined in the system where rabbit IgG was used as the antigen. It was observed that a five-day course of cyclosporin A induced in rats after immunization with bovine collagen suppresses the production of collagen-directed antibodies but causes the intensive production of both populations of rheumatoid factor with the peak intensity on the seventh and on the fourteenth days after immunization. The animals which underwent a five-day course of cyclosporin A after bovine collagen immunization do not respond to the repeated administration of bovine collagen, which indicated to the development of tolerance to bovine collagen. Tolerance to bovine collagen is associated with induction of high level of rheumatoid factor, which regulates the activity of anti-bovine collagen lymphocytes by idiotype-anti-idiotype interactions.
Keywords: сyclosporin A, rheumatoid factor, idiotype-anti-idiotype interactions, induced tolerance, collagen-induced arthritis.
Бедулева Любовь Викторовна, доктор биологических наук, профессор E-mail: blv76@mail.ru
Корепанов Алексей Сергеевич, аспирант E-mail: korepanov-aleksei@mail.ru
Меньшиков Игорь Викторович, доктор биологических наук, профессор E-mail: miv140560@yandex.ru
Сосновцева Анастасия Олеговна, студентка E-mail: sollomia@narod.ru
Столярова Елена Юрьевна, аспирантка E-mail: shima 12@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
Beduleva L.V.,
doctor of biology, professor
E-mail: blv76@mail.ru
Korepanov A.S., postgraduate student E-mail: korepanov-aleksei@mail.ru
Menshikov I.V.,
doctor of biology, professor
E-mail: miv140560@yandex.ru
Sosnovtceva A.O., student E-mail: sollomia@narod.ru
Stolyarova E.Yu., postgraduate student E-mail: shima 12@yandex.ru
Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
