CC BY
93
УДК 615.035.2-092.18
К.И. Усов Г.Г. Юшков А.А. Гущина1, А.С. Гущин 2
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИЗОНИАЗИДА® И ИЗОВИТА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА
1 Ангарская государственная техническая академия, НИИ биофизики (Ангарск)
2 ОАО «Фармасинтез» (Ангарск)
Было проведено доклиническое исследование двух препаратов: «Изониазид®» и «Изовит®». При сравнении, физиологических, биохимических, токсикологических и морфофункциональных показателей было установлено, что введение пиридоксина гидрохлорида в состав единой лекарственной формы. — «Изовит®» — снижало большинство токсических проявлений.
Ключевые слова: противотуберкулезные препараты, изониазид, изовит
TOXICOLOGICAL ESTIMATION OF ISONIAZIDUM® AND ISOVITUM® IN EXPERIMENT K.I. Usov 1, G.G. Yushkov 1, A.A. Gushchina 1, A.S. Gushchin 2
1 Angarsk State Technical Academy, Biophysics Scientific Research Institute, Angarsk
2 Farmasintez, Angarsk
We realized, pre-clinical study of two preparations — «Isoniazidum®» and «Isovitum®». At the comparison of physiological, biochemical, toxicological and morphofunctional indices we determined, that introduction of pyridoxine hydrochloride in mixture of unified, medicinal form — «Isovitum®» — reduced, most of toxic manifestations.
Key words: antituberculous preparations, Isoniazidum, Isovitum
Выступая в 1969 г. в Конгрессе США, Вильям Стюарт (Surgeon General) заявил, что пришла пора «закрыть книгу инфекционных болезней». Однако на рубеже XX — XXI столетий стало совершенно очевидным, что эта книга не только не закрыта, но еще далеко не прочитана. В настоящее время туберкулез — эпидемически распространенное заболевание во многих регионах мира — относят к «вновь вернувшимся заболеваниям» [1]. По оценке ВОЗ, треть населения Земли инфицирована Mycobacterium tuberculosis; общее количество заболевших и умерших от туберкулеза в 2006 г. составило 9,2 и 1,7 млн. человек соответственно (WHO, 2008). По данным Роспотребнадзора РФ (март 2009 г.), в 2009 году ожидается рост заболеваемости туберкулезом, и в течение 3-х лет ситуация может выйти из-под контроля [3, 4]. Лечение больных туберкулезом требует длительного, непрерывного и одновременного приема 4 — 5 антибактериальных препаратов (DOTS-plus стратегия), которые, помимо терапевтического эффекта, обладают высокой токсичностью, что оказывает повреждающее действие на многие органы и системы. В последние время на фармацевтический рынок вышли новые формы противотуберкулезных препаратов — комбинированные. Факт появления данных препаратов говорит о необходимости их дальнейшего доклинического исследования с целью выявления общих токсических свойств: об этом также говорилось на научно-практической конференции «Противотуберкулезные лекарственные препараты в Российской Федерации. Реалии и перспективы» [5]. В частности, на конференции была подчеркнута необходимость дальнейших поисков в создании
комбинированных противотуберкулезных препаратов, часть из которых уже прошла доклинические и клинические испытания и рекомендована для практического применения.
Цель работы: сравнить физиологические, биохимические и морфофункциональные изменения при введении препаратов «Изониазид®» (изониазид 300 мг) и «Изовит®» (изониазид 300 мг + пиридоксина гидрохлорид 15 мг) производства ОАО «Фармасинтез» (г. Иркутск) в условиях эксперимента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент проводили на 252 нелинейных белых крысах (самцы, самки). Крысы содержались по 6 животных в клетке в стандартных условиях при температуре 20 — 22 °С и естественном световом режиме на стандартном рационе специализированного вивария (ветеринарное удостоверение 238 № 0018304). Получали питьевую воду без ограничений. Критериями включения животных в эксперимент являлось ветеринарное заключение местной службы Госветнадзора, в ряде случаев — заключение Областной ветеринарной лаборатории на бактерионосительство. Динамику изучали на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после введения образцов препарата на фоне динамического контроля и исходного уровня величин показателей [2, 4] по следующим выбранным:
1. Физиологические показатели: температура тела (измеряли с помощью электронного термометра «Омрон»), АД, ЧСС, суммационно-пороговый показатель (СПП), потребление кислорода (определяли с использованием прибора <^рпо1у1-2»),
показатели физиологических механизмов поведения животных (двигательная и ориентировочноисследовательская активность, изменение потребления пищи и воды).
2. Биохимические показатели: активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатами-нотрансферазы (АСТ), содержание общего белка, билирубина, холестерина, аскорбиновой кислоты, глюкозы и мочевины в сыворотке крови, содержание ксантуреновой кислоты в моче. Для забора крови у крыс проводили эвтаназию путем декапи-тации с соблюдением Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Моча предварительно собиралась в обменные клетки Simax.
Для оценки морфофункциональных изменений проводили: а) патоморфологические исследования, что включало аутопсию с макроскопическим описанием, измерение относительной массы органов (сердце, легкие, печень, селезенка, почки, головной мозг, щитовидная железа); б) гистологическое исследование тканей печени, щитовидной железы, легких, почек, желудка. Расчёт среднесмертельных доз проводили по Керберу. Животным препараты вводили в виде водного раствора внутрижелудочно, через рот с помощью металлического атравматического зонда: терапевтическую (8 мг/кг), промежуточную (50 мг/кг) и токсическую (140 мг/кг) дозы, что составляет 1/10 от LD50 для препарата «Изовит®».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При внутрижелудочном введении образца препарата «Изониазид®» LD50 составила 1667 ± 48,5 мг/кг (самцы) и 1683 ± 48,5 мг/кг (самки). Для препарата «Изовит®» LD50 = 6750 ± 216,8 мг/кг (самцы) и 6657 ± 216,8 мг/кг (самки). По данным токсикометрии, статистически значимых различий между самцами и самками не установлено. В среднем LD50 для препарата «Изовит®» оказалась выше в 4,00 раза. Введение препарата «Изовит®» в дозе 140 мг/кг привело к снижению прироста массы тела, начиная с седьмых суток, но со значительно меньшей направленностью, чем при введении препарата «Изониазид®». Снижение потребления воды было отмечено с 1— 3-х суток наблюдения по сравнению с изониазидом, где снижение в потреблении воды было отмечено во всех сроках наблюдения. АД повышалось разово и в значительно меньшей степени, ЧСС увеличивалась на 3-и сутки, суммационно-пороговый показатель повышался на 3 — 7-е сутки. Уровень потребления кислорода повышался только на последние сутки. Продолжительность гексеналового сна увеличивалась с 3-х суток. При оценке двигательной и ориентировочно-исследовательской активности крыс ожидаемого подавления практически не отмечалось на фоне динамического контроля, за исключением максимальных и преимущественно разовых отличий при введении препарата «Изовит®» в дозе 50 мг/кг и отсутствия отличий при введении препарата «Изониазид®» в дозе 8 мг/кг. Из показателей крови было отмечено повышение лейкоцитов и снижение эритроцитов и, как след-
ствие, понижение гемоглобина на 1-е и 3-и сутки при дозе 140 мг/кг. Время свертывания крови от такового в контроле не отличалось.
Результаты биохимических показателей при воздействии препаратами: «Изониазид®» и «Изовит®» и представлены в таблице1.
При введении препарата «Изониазид®» в дозе 140 мг/кг со второго месяца было обнаружено повышение содержания общего белка в сыворотке крови, активности АЛТ. Пиковые изменения отмечены через три месяца в виде еще большего повышения активности АЛТ, АСТ, общего белка, билирубина и мочевины. Большинство биохимических показателей имело ту же направленность изменений, что и при введении препарата «Изовит®», но степень их количественных проявлений была несколько ниже. К третьему месяцу введения изо-вита показатель АЛТ понизился, активность АСТ практически не изменилась, содержание общего белка и билирубина, содержание мочевины. Динамика изменения концентрации ксантуреновой кислоты в моче крыс при введении исследуемых препаратов в течение трех месяцев в дозе 100 мг/кг отражена в таблице 1. При этом выделение ксантуреновой кислоты с мочой оказалось крайне неустойчивым: с первого по третий месяц оно составило, соответственно, 1,6, 1,7 и 1,9 мкг/кг, что свидетельствует о менее выраженном влиянии системы «изониазид + витамин В6» на метаболизм триптофана. Наличие основного действующего вещества — изониазида — в моче крыс контролировали с помощью качественной реакции, которая была положительной во всех пробах. Содержание аскорбиновой кислоты в плазме крови при введении изониазида снижалось по сравнению с динамическим контролем. У крыс-самцов при дозе 5 мг/кг оно составило 27,9 ± 0,3, при дозе 50 мг/кг — 23,9 ± 0,5, при дозе 100 мг/кг — 17,6 ± 0,6. Для крыс-самок динамика была аналогичной. Статистическую оценку достоверности полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента при р < 0,05.
В соответствии с требованиями доклинических исследований морфологические изменения регистрировали по окончании срока введения. При вскрытии животных, подвергавшихся воздействию изониазидом в дозе 100 мг/кг, обнаружено умеренное полнокровие магистральных сосудов печени. Синусоиды и центральные вены печени представлены без выраженных изменений. Гепатоциты обычной формы и окраски, ядра хорошо выражены. Клетки Купфера без видимых отличий от контроля. В легких магистральные сосуды полнокровны, межальвеоляр-ные перегородки утолщены за счет полнокровия капилляров и пролиферации альвеолоцитов, просветы альвеол свободные, слизистая бронхов складчатая. Сосуды почек умеренно полнокровны, эпителий извитых канальцев без существенных изменений, клубочки обычной формы, просветы извитых канальцев свободные. В головном мозге умеренно выражена отёчность мелких и средних сосудов кары, гомогенизация хроматина ядер нейронов. Красная
Экспериментальные исследования в биологии и медицине 207
Таблица 1
Динамика биохимических показателей
№ Доза Мочевина сыворотки (ммоль/л) Общий белок сыворотки (г/л) Активность АЛТ в сыворотке (ед/л) Активность АСТ в сыворотке (ед/л) Глюкоза (ммоль/л) Холестерин общий (ммоль/л) Билирубин общий (ммоль/л)
п/п (мг/кг) Самцы Самки Самцы Самки Самцы Самки Самцы Самки Самцы Самки Самцы Самки Самцы Самки
Срок наблюдения - 30-е сутки
100 8,1 ±0,05 8,1 ±0,06 78,6 ± 1,0 79,2 ± 1,0 62,0 ±2,0 62,8 ± 1,8 354,8 ±2,1 359,6 ±2,0 5,8 ±0,1 5,7 ±0,2 1,6 ±0,02 1,7 ±0,03 8,1 ±0,04 8,1 ±0,04
8,6 ± 0,05* 8,5 ± 0,04* 78,4 ±0,8 79,1 ±1,0 64,2 ±2,0 65,0 ±2,1 357,4 ±2,4 358,1 ±2,1 6,4 ±0,2* 6,3 ±0,2* 1,6 ±0,04 1,7 ± 0,02 8,1 ±0,05 8,1 ±0,04
8,1 ±0,05 8,1 ±0,03 78,1 ±1,0 78,4 ±1,1 61,5 ±2,1 62,3 ± 1,9 351,4 ±2,1 352,6 ± 1,9 5,7 ±0,1 5,8 ±0,2 1,6 ±0,04 1,6 ±0,03 8,1 ±0,05 8,1 ±0,04
1 8,1 ±0,04 8,1 ±0,03 77,9 ± 1,0 78,1 ±1,0 61,4 ± 1,8 62,0 ±2,0 353,5 ±2,1 354,8 ±2,0 5,8 ±0,1 5,9 ±0,1 1,6 ±0,02 1,6 ±0,03 8,1 ±0,03 8,1 ±0,04
8,1 ±0,03 8,1 ±0,03 78,3 ±0,6 78,9 ±0,7 61,2 ±2,0 62,0 ±2,1 350,4 ± 1,9 352,1 ±2,0 5,7 ±0,1 5,7 ±0,1 1,6 ±0,04 1,6 ±0,04 8,1 ±0,03 8,1 ±0,03
8,1 ±0,04 8,1 ±0,02 78,4 ±0,6 78,9 ±0,8 61,3 ± 1,8 61,5 ± 1,6 351,2 ±2,0 353,2 ± 1,9 5,7 ±0,1 5,7 ±0,1 1,6 ±0,03 1,7 ±0,03 8,1 ±0,04 8,1 ±0,03
Контроль 8,1 ±0,03 8,1 ±0,03 78,6 ±0,9 79,0 ±1,1 61,6 ± 1,5 61,9 ± 1,8 351,6 ±2,1 355,4 ± 1,8 5,7 ±0,1 5,8 ±0,1 1,6 ±0,03 1,7 ±0,04 8,1 ±0,03 8,1 ±0,04
Срок наблюдения - 60-е сутки
100 8,2 ±0,05 8,2 ±0,05 81,4 ±0,6 82,0 ±0,6 70,1 ±2,0* 71,0 ± 1,5* 356,3 ±2,0 359,4 ±1,8 5,6 ±0,1 5,6 ±0,2 1,6 ±0,03 1,7 ± 0,03 8,2 ± 0,05 8,1 ±0,06
8,3 ±0,04 8,2 ±0,05 86,5 ± 0,6* 90,0 ± 1,0* 86,5 ±2,0* 88,3 ± 1,9* 359,7 ±2,1 360,1 ±1,9 5,5 ±0,2 5,6 ±0,2 1,6 ±0,04 1,7 ± 0,04 8,2 ± 0,06 8,1 ±0,06
8,1 ±0,03 8,1 ±0,04 80,1 ±0,5 80,8 ±0,6 62,0 ±2,0 62,6 ±2,0 355,2 ± 1,6 357,1 ±2,0 5,6 ±0,1 5,6 ±0,1 1,6 ±0,03 1,6 ±0,04 8,1 ±0,04 8,1 ±0,04
2 8,2 ±0,03 8,1 ±0,03 81,6 ±0,6 83,4 ± 1,0 65,3 ±2,0 66,4 ±2,1 354,4 ±2,0 356,2 ± 1,9 5,6 ±0,1 5,7 ±0,1 1,6 ±0,03 1,6 ±0,03 8,1 ±0,04 8,1 ±0,03
8,1 ±0,03 8,1 ±0,03 80,1 ±0,7 78,4 ± 1,0 61,0 ± 1,6 61,7 ±2,0 356,9 ±2,0 359,4 ± 1,6 5,7 ±0,2 5,7 ±0,3 1,6 ±0,03 1,7 ±0,04 8,1 ±0,03 8,1 ±0,03
8,1 ±0,04 8,1 ±0,03 79,4 ±0,8 77,4 ± 1,0 61,1 ±1,5 62,0 ±2,0 357,0 ± 1,6 358,4 ± 1,9 5,7 ±0,1 5,8 ±0,1 1,6 ±0,02 1,7 ±0,05 8,1 ±0,02 8,1 ±0,04
Контроль 8,1 ±0,04 8,1 ±0,03 80,0 ±0,5 78,3 ±0,6 61,4 ± 1,8 61,8 ±2,0 356,8 ± 1,9 358,5 ±2,0 5,7 ±0,1 5,8 ±0,1 1,6 ±0,04 1,7 ±0,03 8,1 ±0,04 8,1 ±0,05
Срок наблюдения - 90-е сутки
8,6 ± 0,06* 8,4 ± 0,05* 91,3 ± 1,0* 91,8 ± 1,0* 90,3 ±2,0* 91,4 ±2,4* 370,4 ±2,1* 371,5 ±2,0* 5,1 ±0,2 5,1 ±0,2 1,7 ±0,05 1,7 ±0,06 9,0 ± 0,07* 8,7 ± 0,06*
9,4 ± 0,06* 9,3 ± 0,05* 92,4 ± 0,9* 93,0 ±1,1* 99,6 ±2,4* 99,8 ±2,1* 369,1 ± 2,0* 370,2 ± 2,4* 5,0 ±0,2 5,1 ±0,1 1,7 ±0,04 1,8 ±0,04 9,3 ± 0,08* 8,8 ± 0,04*
50 8,3 ±0,06 8,2 ±0,06 81,3 ± 1,0 83,6 ±1,1 80,4 ±2,0 81,2 ±1,8* 363,2 ±3,0 367,9 ±2,1 5,1 ±0,2 5,2 ±0,2 1,6 ±0,04 1,7 ± 0,04 8,3 ±0,2 8,3 ±0,1
3 9,0 ±0,05 9,1 ±0,06 86,5 ± 0,6* 87,1 ±0,5 84,1 ±2,3* 85,8 ±2,4* 361,7 ±2,0 366,7 ±1,8 5,1 ±0,2 5,4 ±0,2 1,6 ± 0,03 1,7 ± 0,03 8,4 ±0,1 8,3 ± 0,08
8,1 ±0,04 8,1 ±0,03 80,0 ±0,7 80,3 ±0,8 73,0 ± 1,6 70,1 ±2,0 357,3 ±1,1 360,6 ±2,0 5,6 ±0,1 5,7 ±0,2 1,7 ±0,03 1,6 ±0,04 8,1 ±0,1 8,1 ±0,1
8,2 ±0,04 8,1 ±0,05 79,5 ±0,5 80,0 ±0,4 73,1 ±1,8 69,4 ±2,0 360,2 ± 1,9 361,4 ±2,1 5,6 ±0,1 5,7 ±0,1 1,6 ±0,04 1,6 ±0,02 8,1 ±0,1 8,1 ±0,06
Контроль 8,2 ±0,03 8,1 ±0,04 79,6 ± 1,0 80,1 ±0,5 72,8 ±1,9 69,3 ±2,1 358,4 ±3,0 359,2 ±2,4 5,5 ±0,2 5,6 ±0,1 1,8 ±0,05 1,7 ±0,02 8,2 ± 0,06 8,1 ±0,05
Примечание: * - отличия статистически достоверны при Р < 0,05; первая строка - Изовит; вторая строка - Изониазид без В6.
БЮЛЛЕТЕНЬ ВСНЦ СО РАМН, 2010, №5(75)
пульпа селезенки полнокровна, лимфоидные фолликулы хорошо выражены, с четкими центрами размножения. В средней и каудальной части желудка встречались небольшие участки дистрофических изменений эпителия. В сердце обнаружены участки цитолиза микрофибрилл, разволокненность пучков. У крыс, получавших препарат «Изониазид®» в промежуточной дозе, морфологические изменения выражены крайне неотчётливо, а при терапевтической дозе признаков структурных повреждений не отмечено. Методами гистохимии было обнаружено снижение активности сукцинатдегидрогеназы в печени животных, снижение содержания гликогена при токсической дозе.
На вскрытии животных при введении препарата «Изовит®» в дозе 100 мг/кг визуально определяемых признаков патологии не обнаружено, что положительно отличает действие препарата «Изовит®» от препарата «Изониазид®». В печени не было обнаружено полнокровия сосудов, синусоиды свободные, клетки Купфера округлены, но не увеличены в размерах. В головном мозге по сравнению с изменениями, вызванными изониазидом, упомянутые проявления были выражены в значительно меньшей степени.
В почках при токсической дозе нарушений в гомодинамике не выявлено, обратили на себя внимание слабовыраженные явления белковой дистрафии в эпителии извитых канальцев. В сердце — незначительные признаки застойного полнокровия без дистрофических изменений миофибрилл. В щитовидной железе признаков патологии не отмечено. В слизистой части желудка встречались участки дистофически измененного железистого эпителия, в селезенке — нерезко выраженное полнокровие, в легких в токсической дозе отмечено некоторое расширение просвета альвеол. У животных, получавших препарат «Изовит®» в промежуточной дозе, морфологические изменения выражены менее отчётливо, а при терапевтической дозе структурных повреждений не отмечено. При гистохимических исследованиях печени животных при 100 мг/кг установлено снижение активности сукцинатдегидрогеназы как результат отсутствия влияния пиридоксина на степень нарушения гликолиза. При этом активность лактатдегидрогеназы в печени ни при одной из доз от контроля не отличалась, что позволяет считать пиридоксин в таком сочетании достаточным компенсирующим фактором в системе анаэробного окисления. Снижение гликогена в печени снижалось при воздействии изовита как в токсической, так и в терапевтической дозе, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния пиридоксина на процесс накопления гликогена в печени. Активность щелочной фосфатазы при введении изовита в токси-
ческой дозе повышалась, в терапевтической — оставалась на уровне динамического контроля. Выявлена умеренная инфильтрация нейтральными липидами при токсической дозе изовита, выраженная при токсической дозе изониазида. Было отмечено отчетливое снижение активности моноаминооксидазы в печени животных, получавших изониазид в дозе 100 мг/кг, и отсутствие такового при введении изовита в той же дозе. Столь же характерной зависимости при введении изовита в промежуточной дозе не отмечено. В целом проведенные экспериментальные исследования препарата «Изониазид®» показали, что в дозах, значительно превышающих терапевтическую (140 и 50 мг/кг), препарат при однократном введении вызывает характерные для соединений гидразинового ряда изменения в состоянии животных. Доза 8 мг/кг не вызвала у крыс каких-либо отклонений от контроля, что свидетельствует о приемлемой переносимости препарата с отнесением его к малотоксичным по Hodde и Sterner [4]. Спектр биохимических и морфофункциональных изменений при введении препарата «Изовит®» животным был сходен со свойствами изониазида, но проявлялся в значительно меньшей степени, чем при введении препарата «Изониазид®». Особенно это проявилось при исследовании изовита по показателю летальности. Введение препарата «Изовит®» в несколько раз сократило летальность и, по-видимому, способствовало снижению общетоксического действия, что выразилось в уменьшении отличий от контроля по большинству из выбранных показателей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мархаев А.Г., Молонов А.Д., Убеева И.П., Бад-леева М.В. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в районах приграничных с неблагоприятными по туберкулезу странами // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. — Улан-Удэ, 2009. - Т. 66, № 2. - С. 271-273.
2. Маслаускене Т.П., Николаева С.Б. Побочное действие противотуберкулезных препаратов. // Сибирский медицинский журнал. — Иркутск, 2005. - № 3. - С. 13-19.
3. Компанцева Е.В, Овчаренко Л.П., Халата А.В., Кулешова С.А. Фармакокинетика и общетоксическая оценка гранул изониазида и пиридок-сина гидрохлорида // Экология человека. - Пятигорск, 2007. - № 2. - С. 7-10
4. Портяная Н.И., Юшков Г.Г. Биохимия гидразинов. - Ангарск: АГТА, 2005. - С. 92-93.
5. Производство противотуберкулезных лекарственных препаратов в РФ. Реалии и перспективы : мат. науч.-практ. конф. // Проблемы туберкулеза и болезни легких. - 2005. - № 8. -С. 60-62.
Сведения об авторах
Усов Константин Ильич - аспирант НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии (665833, г. Ангарск, 9-й микрорайон, д. 91, кв. 90; тел.: 8 (908) 655-76-84; e-mail: chemist545@mail.ru).
Юшков Геннадий Георгиевич - кандидат медицинских наук, заместитель директора по научной работе НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии.
Гущина Алла Анатольевна - заведующая биохимической лабораторией отдела токсикологии НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии.
Гущин Александр Сергеевич - директор ОАО «Фармасинтез».
