CC BY
86
Фармакология, токсикология
УДК 619:615.9
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИНСЕКТОАКАРИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА ИНСАКАР ПРИ АРАХНОЭНТОМОЗАХ ПЛОТОЯДНЫХ
ЖИВОТНЫХ
А.А. СТЕПАНОВ аспирант М.В. АРИСОВ Научный руководитель - доктор ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Большая Черемушкинская, д. 28, тел./факс 8-499-124-56-55,e-mail:[email protected]
Изучены параметры острой токсичности препарата инсакар при пероральном введении и накожном нанесении: ЛД50 при введении белым мышам в желудок составила 5125±226, при накожном применении -41833 мг/кг. Препарат обладает слабо выраженной кумуляцией, слабым местно-раздражающим действием и не оказывает кожно-резорбтивного эффекта.
Ключевые слова: инсакар, токсичность, кумуляция, крысы, мыши, гематологические и биохимические показатели.
Для расширения ассортимента отечественных противопаразитарных средств на базе ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина разработан новый препарат с инсектоакарицидным действием инсакар, содержащий в качестве ДВ фипронил, пирипроксифен и бензилбензоат.
Препарат представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светло-желтого цвета, со слабым специфическим запахом. Препарат применяют путем топикального (точечного) нанесения на кожу.
Одной из основных задач, возникающих при изучении токсического действия препарата, является выявление побочных нежелательных эффектов и исключение отдаленного действия на организм животных [1, 3, 6].
Целью нашей работы было определение параметров острой токсичности препарата инсакар при пероральном введении и накожном нанесении, изучение кумулятивных свойств, оценка местного и кожно-резорбтивного действия препарата.
Материалы и методы
Изучение токсикологических свойств препарата инсакар проводили в виварии ВИГИС на белых крысах-самцах, белых мышах и кроликах массой тела соответственно 210-230 г, 18-23 г и 2,0-2,3 кг. В опытах использовали брали клинически здоровых животных, которые предварительно находились на 15-дневном карантине. Группы состояли из 4-10 животных.
Расчет параметров острой токсичности инсакара проводили в соответствии с Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ (1997), используя метод Кербера в модификации Прозоровского [1, 6].
В опытах при введении препарата в желудок использовали 36 белых мышей. Готовили 30%-ный раствор и вводили с помощью иглы с булавовидным утолщением в желудок натощак. Препарат вводили в диапазоне доз 0,2 мл/гол (3000 мг/кг) - 0,45 мл (6750 мг/кг). Для каждой дозы использовали по 6 мышей.
За мышами вели наблюдения в течение 2-х недель. Учитывали характер токсического действия: поведение, двигательную активность, состояние шерстного покрова, нарушение физиологических функций.
В связи с тем, что препарат рекомендуют применять накожно изучали его острую токсичность при накожном применении.
В опыте использовали белых беспородных крыс массой по 300 г. За сутки до нанесения препарата выстригали участок кожи размером 6 х 6 см в области спины. Препарат наносили на кожу в дозах: 6 мл (20000 мг/кг), 8 мл (26666 мг/кг) и 10 мл (33333 мг/кг). На каждую дозу использовали по 4 крысы. Дозы 8 и 10 мл наносили дважды с интервалом 10 мин. После обработки крыс помещали в индивидуальные камеры на 4 ч. В дальнейшем, животных содержали в обычных клетках. В течение 30 сут после начала опыта вели наблюдение за внешним видом, состоянием и поведением крыс. Отмечали характер проявления признаков токсикоза и падеж животных.
Кумулятивные свойства препарата изучали по методу Лима с соавт. [8]. Опыт проводили на 30 белых мышах массой 19-20 г. В качестве контроля служили 30 мышей. Все животные содержались на стандартном корме, одинаковом для подопытных и контрольной групп. Препарат вводили животным ежедневно, индивидуально, при помощи металлического зонда, алиментарным путем в виде 30%-ного водного раствора. В течение первых четырех дней животные подопытной группы получали препарат в дозе, равной 0,1 от ранее установленной однократной ЛД50. На 5-е сутки дозу увеличивали в 1,5 раза. В течение 30 сут за всеми животными вели наблюдения, отмечая их смертность. Результаты оценивали по отношению средних эффективных доз острого и подострого экспериментов по формуле Kkum = ЛД50(подостр)/ ЛД50(остр), откуда следует: если коэффициент кумуляции меньше 1, то испытуемый препарат обладает кумулятивными свойствами; если больше 1 - то отмечается повышенная устойчивость к препарату (слабо выраженная кумуляция) [7].
Местное и кожно-резорбтивное действие инсакара изучали на крысах при нанесении препарата 5 раз с интервалом 5 сут в дозах 1 мл/гол, что в 2,5 раза превышает срок применения в практических условиях, и в 5 раз повышенной дозе. Кроме того, в опытах на кроликах изучали местное действие препарата на слизистые оболочки глаз.
Местное действие препарата на кожу изучали на 12 белых беспородных крысах обоего пола массой 250-310 г., разделенных на подопытную и контрольную группы по 6 голов. За сутки до эксперимента у каждого животного в области спины выстригали участки кожи размером 3 х 3 см и определяли толщину кожной складки. На выстриженный участок наносили пипеткой препарат в дозе 1 мл. Оценку реакции кожи проводили по системе, принятой по Range Finding Test: очень слабое покраснение - 1 балл, вполне определенное покраснение - 2, умеренное, до сильного покраснение - 3, тяжелая эритема с образованием корочек - 4 балла.
Действие препарата на конъюнктиву глаза изучали на 3 кроликах. Животным глазной пипеткой закапали в правый глаз по 2-3 капли испытуемого препарата, а в левый по 2-3 капли чистого подсолнечного масла (контроль). Наблюдение за животными вели в течение 1 ч, и затем в течение 3 сут ежедневно. Действие препарата на слизистую глаз оценивали по характеру конъюнктивита и кератита.
Кожно-резорбтивное действие инсакара оценивали по специфическим и интегральным показателям через сутки после последней обработки. Гемато-
логические исследования проводили на гематологическом анализаторе PCE 90-vet (США) (определяли динамику числа эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина, величину гематокрита). По общепринятым методам выводили лейкограмму и определяли СОЭ. По биохимическим тестам оценивали обмен веществ в организме и работу внутренних органов: почек, печени, поджелудочной железы и др. Основные показатели определяли на биохимическом анализаторе «А-125 биосистем» [4-7].
Статистическую обработку цифровых показателей выполняли по Стью-денту-Фишеру на персональном компьютере Pentium-4 с использованием программ Microsoft Excel, Microsoft Access и BIOSTAT.
Результаты и обсуждение
Изучение острой токсичности при пероральном введении. В первые сутки после введения препарата гибель животных отмечали от больших доз препаратов (6000-6750 мг/кг массы тела). Малые дозы не вызывали гибели мышей. Однократное введение препарата в больших дозах вызывало общее угнетение, судорожные явления; мыши зарывались в подстилку и вскоре отмечали их гибель. В последующие двое суток фиксировали гибель от доз 3750-5250 мг/кг. Максимальной переносимой дозой, при которой не отмечали гибели животных, была 3000 мг/кг. Мыши начинали погибать при введении препарата в дозе 3750 мг/кг. Абсолютная смертельная доза для белых мышей составила 6750 мг/кг (табл. 1). При вскрытии павших животных установлены патологоанатомические изменения, свойственные острому отравлению: брыжеечные сосуды кровенаполнены, увеличена печень и селезенка, на слизистой оболочке желудка и кишечника геморрагические воспаления.
1. Параметры острого токсического действия препарата инсакар для мышей при введении в желудок
Доза, мг/кг 3000 3750 4500 5250 6000 6750
Гибель 0/6 1/6 1/6 3/6 5/6 6/6
Z d Zd 0,5 1 2 4 5,5
750 750 750 750 750
375 750 1500 3000 4125
Расчет параметров токсичности:
ЛД50 = ЛД100 - I : п = 6750 - 9750 : 6 = 5125 мг/кг.
Следует отметить, что после трех суток падежа мышей не отмечено, но общее состояние у некоторых мышей оставалось неудовлетворительным в течение 5 сут. В дальнейшем клиническое состояние нормализовалось.
Таким образом, ЛД50 инсакара при введении внутрь для мышей составила 5125^226 мг/кг, что дает основание отнести данный препарат к 4 классу токсичности - малоопасные по ГОСТ 12.1.007-76. [2].
Изучение острой кожной токсичности. Установлено, что в течение всего срока наблюдения не отмечали изменений внешнего вида и нарушений видимых физиологических функций. В группах, где наносили препарат в дозах 8 и 10 мл наблюдали признаки интоксикации по истечении 1-3 сут (тремор, судороги, взъерошенность). В течение 10 сут во второй группе пала одна крыса, в третьей - три крысы. Достижение 100%-ного эффекта было невозможно ввиду требуемых больших доз препарата. ЛД100 определяли методом пробит-анализа [1].
В результате обработки экспериментальных данных ЛД50 препарата составила 41833 мг/кг.
По гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76) в соответствии с установленными параметрами кожной токсичности для крыс препарат инса-кар относится к 4 классу опасности [2].
Изучение кумулятивных свойств. Для изучения кумулятивных свойств установили первоначальную дозу препарата, которая составила 0,1 от ранее установленной однократной ЛД50 - 512,5 мг/кг или 0,0342 мл/гол. 30%-ного водного раствора. Для удобства введения препарата внутрь мышам и последующих расчетов, незначительно округлили значения первоначальных доз, которые составили 525 мг/кг или 0,035 мл/гол 30%-ного водного раствора. Результаты приведены в таблице 2.
2. Изучение кумулятивных свойств препарата инсакар
Период введения, сут Ежедневно вводимая доза, мл/гол. Ежедневно вводимая доза, мг/кг Суммарная доза, мг/кг Пало/ было %
1-4 0,035 525 2100 0/30 0
5-8 0,0525 787 3148 0/30 0
9-12 0,078 1181 4724 0/30 0
13-16 0,118 1772 7088 2/30 6,6
17-20 0,177 2658 10632 12/30 40
21 -24 0,266 3987 15948 22/30 73,3
25-28 0,40 5980 23920 30/30 100
В результате обработки экспериментальных данных ЛД50 препарата при многократном введении в желудок составила 13092,8 мг/кг.
Используя формулу Кагана-Станкевича, определили коэффициент кумуляции:
ЛД50 многократно 13092,8
К=....................=---------= 2,55.
ЛД50 однократно 5125
Учитывая суммарную дозу (ЛД50 многократная) препарата, определили коэффициент кумуляции, который составил 2,55. По классификации веществ по кумулятивным свойствам исследуемый препарат относится к группе веществ со слабо выраженной кумуляцией.
Изучение местного действия на кожу. При нанесении препарата инсакар у одной из трех крыс регистрировали наличие изменений кожи в течение 1 ч в виде покраснения (2 балла), в течение 12 ч переходящая в слабое покраснение (1 балл). У второго животного регистрировали слабое покраснение в течение 12 ч. Общая сумма баллов составила 2,5, что позволяет классифицировать местно-раздражающее действие препарата как слабое (4 класс опасности).
Восстановление функционального состояния кожи протекало без постороннего вмешательства в течение суток после прекращения нанесения препарата.
Изучение местного действия на слизистые оболочки глаз. Проводили через 1, 24, 48 и 72 ч по изменению кровенаполнения конъюнктивы, наличию лакримаций и состоянию роговицы глаза по 10-бальной системе. Результаты исследований приведены в таблице 3.
При нанесении препарата у кроликов отмечали выраженную гиперемию и слезотечение. Эти явления исчезли через 24 ч.
3. Оценка раздражающего действия препарата инсакар при воздействии на конъюнктиву глаза кролика
№ Оценка в баллах через (часы) Раздражающий эффект
1 24 48 72
1 6 2 0 0 слабовыраженный
2 6 2 0 0 слабовыраженный
3 6 2 0 0 слабовыраженный
Таким образом, препарат обладает слабовыраженным действием на слизистую оболочку глаза с восстановлением слизистой оболочки до нормы в течение суток.
Кожно-резорбтивное действие в подостром эксперименте. В течение всего опыта внешних признаков токсикоза и гибели крыс не отмечали. Подопытные животные по своему поведению, внешнему виду ничем не отличались от контрольных животных.
Результаты оценки влияния препарата на показатели периферической крови крыс приведены в таблице 4.
4. Гематологические показатели крыс при накожном пятикратном нанесении ____________________________препарата инсакар_____________________________
Показатель Опыт Контроль % к контролю
Эритроциты, 1012/л 7,89±0,32 8,29±0,47 95,17
Лейкоциты, 109/л 9,13±0,25 9,2±0,19 99,24
Гемоглобин, г/л 142,16±8,53 143,83±8,08 98,84
Гематокрит, % 44,7±3,67 48,9±4,63 91,41
СОЭ, мм/г 1,16±0,72 1,33±0,54 87,22
Лейкограмма, %
Нейтрофилы сег- 12,33±3,61 14,66±4,12 84, 11
ментоядерные
Эозинофилы 3,0± 1,14 2,66±1,08 112,8
Лимфоциты 83,33±4,12 81,68±4,86 102,05
Моноциты 1,34±1,08 1,0±1,15 133
Анализ полученных данных по количеству эритроцитов, лейкоцитов (2 группа), уровню гемоглобина, гематокрита, а также по лейкограмме показал отсутствие различий между подопытными и контрольными животными (Р >
0,05). Отмечено снижение СОЭ на 12,78 % по сравнению с контролем, но данное снижение не существенно.
Результаты изучения влияния препарата на функциональную активность печени, почек и некоторых показателей белкового, жирового и углеводного обмена приведены в таблице 5.
Как следует из таблицы, почти все биохимические показатели у животных подопытной и контрольной групп находятся примерно на одном уровне и статистически не достоверны (Р > 0,05). Отмечено снижение уровня общего билирубина на 19 % по сравнению с контролем. Данное изменение значимости не имеет, так как оно связано с тем, что в подопытной группе наблюдали незначительное снижение числа эритроцитов и, соответственно, уменьшение их разрушения.
При убое у крыс взвешивали внутренние органы и определяли массовые коэффициенты. Результаты приведены в таблице 6.
5. Показатели функциональной активности печени и состояния белкового, жирового и углеводного обмена крыс при накожном пятикратном нанесении _________________________препарата инсакар____________________________
Показатель Опыт Контроль % к контролю
Глюкоза, моль/л 6,73±0,47 6,8±0,29 98,97
Белок общий, г/л 71,33±2,17 72,5±3,97 98,39
Альбумин, г/л 28,0±2,89 27,66±3,36 101,23
Билирубин общий, мкмоль/л 14,45±10,67 17,83±12,64 81,04
АЛТ, ед/л 55,5±6,25 57,0±7,76 97,37
ACT, ед/л 168,83± 18,64 166,83±26,10 101,20
Щелочная фосфатаза, ед/л 287,83±79,9 273,0±67,5 105,43
Амилаза, ед/л 1063,33±203,47 981,66±127,68 108,31
Остаточный азот,мкмоль/л 7,01±0,35 7,5±0,22 93,47
Креатинин, мкмоль/л 55,83±3,83 63,16±8,86 88,39
6. Массовые коэффициенты внутренних органов крыс после пятикратного ____________________нанесения препарата инсакар____________________
Группа Почки Легкие Селезенка Сердце Печень
Инсакар Контроль 6,28±0,64 5,87±0,43 0 1 ,4 ,2 1, 0, -н -н 23 ,2 ,8 7, 5, 8 3 ,5 ,6 0, 0, -н -н 84 ,0 ,4 4, 3, 3 1 ,2 ,4 0, 0, -н -н 44 ,0 ,4 3, 3, 41,94±1,66 37,01±3,68
Как следует из таблицы, пятикратное накожное применение препарата не привело к достоверному изменению массовых коэффициентов почек, легких, селезенки, сердца и печени по сравнению с контрольными животными.
Литература
1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Госмедиздат, 1963. - 151 с.
2. Гост 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда: вредные вещества: классификация и общие требования безопасности. - М., 1984.
3. Жуленко В.Н., Рабинович М.И., Таланов Г.А. Ветеринарная токсикология. - М.: Колос, 2001. - 384 с.
4. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. - М., 1985. - С. 134-136.
5. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М., 1975. - 253 с.
6. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств, утвержденные Минздравом РФ 29 декабря 1997 г. // Ведомости Фармакоп. Комитета. - 1998. - № 1. - С. 27-32.
7. Методические рекомендации по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций веществ в воздухе рабочей зоны. - 1980. - 25 с.
8. Lim R.K., Rink K.G., Glass H.G. // Arch. Intemat. Pharmacodyn. - 1961. -V. 130, № 3-4. - P. 336-353.
Toxicological estimation insectoacaricid preparation insacar at arachnoentomosis of carnivores
A.A. Stepanov
The parameters of acute toxicity of insacar are studied. LD50 at introduction inside for mice has made 5125^226 mg/kg, LD50 at application on a skin - 41833 mg/kg. Insacar has poorly expressed accumulation, weak local irritating action and does not render skin getting effect.
Keywords: insacar, toxicity, cumulation, rats, mice, haematological and biochemical parameters.
