CC BY
11УДК 616.281-099:001.8
ТОКСИЧЕСКОЕ ПОРАЖЕНИЕ ВНУТРЕННЕГО УХА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ЦИСПЛАТИНА. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Я. Ю. Кудеева1, 2, Е. В. Байбакова1, М. А.Чугунова1, Н. В. Резакова2
1 ГБУЗ «Московский научно-исследовательский клинический институт оториноларингологии им. Л. И. Свержевского» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия (Директор - проф. А. И. Крюков)
2 ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия
(Зав. каф. оториноларингологии лечебного факультета - проф. А. И. Крюков)
CISPLATIN INDUCED TOXIC IMPAIRMENT OF INNER EAR. EXPEREMENTAL TRIAL IN VIVO
Y. Y. Kudeeva12, E. V. Baybakova1, M. A. Chugunova1, N. V. Rezakova2
1 Moscow State Scientific Centre of Otorhinolaryngology named after L. I. Sverzhevsky
2 Russian State Medical University named after N. I. Pirogov
Цель исследования - изучение закономерностей ототоксического действия однократного введения цисплатина на экспериментальной модели с помощью КСВП, ПИОАЭ и гистологического исследования. Проведенное исследование подтверждает возможность использования выбранной модели для исследования цисплатин-индуцированного поражения слуха. Однократная доза цисплатина приводит к достоверному снижению слуховой функции мышей. Цисплатин запускает процесс апоптоза в клетках сосудистой полоски, спиральном ганглии и наружных волосковых клетках.
Ключевые слова: цисплатин, нейросенсорная тугоухость, КСВП, ПИОАЭ, апоптоз.
Библиография: 18 источников.
The purpose of the research is the study of patterns of cisplatininduced ototoxicity in experimental model using ABR, DPOAE and histology. This study confirms the possibility of using the chosen model for the study of cisplatininduced hearing loss. A single dose of cisplatin causes a significant reduction of auditory function in mice. Cisplatin triggers apoptosis in cells of the stria vascularis, spiral ganglion and outer hair cells.
Key words: asplatin, sensorineural hearing loss, ABR, DPOAE, apoptosis.
Bibliography: 18 sources.
Одним из серьезных побочных эффектов лекарственных препаратов, встречающихся в практике врача-оториноларинголога, является ототоксич-ность. В качестве побочного эффекта он заявлен у таких часто используемых препаратов, как сульфаниламидные антибиотики (гентамицин), цито-статики (цисплатин), петлевые диуретики, хинин и др. Данные по распространенности ототоксичности цисплатина неоднозначны. Так, частота встречаемости снижения слуха, по данным разных авторов, колеблется от 9 до 97% [2, 14, 17]. Среди всех факторов, влияющих на вероятность развития поражения внутреннего уха, большинство авторов уделяют особенное внимание суммарной дозе цисплатина [1, 4]. Также встречаются данные о зависимости цисплатин-индуцированной тугоухости от возраста пациентов [5]. Пациенты младшего возраста наиболее подвержены токсическому воздействию препарата. По данным других исследователей, возраст, пол и предшествующая нейросенсорная тугоухость не коррелирует со снижением слуха [18]. Снижение
слуха происходит по нейросенсорному типу, чаще симметрично. Наиболее уязвим для ототоксического воздействия препарата высокочастотный диапазон. Такие разнообразные клинические проявления ототоксичности предрасполагают к детальному изучению локализации повреждений и механизмам поражения. Данные по локализации повреждений внутреннего уха неодназначны. Некоторые исследования говорят о поражении наружных волосковых клеток, как при типичной нейросенсорной тугоухости [5]. Есть данные о повреждении внутреннего уха по типу аудиторной нейропатии [15]. Данные по молекулярным механизмам повреждения также изучены не полностью. К механизмам цитостати-ческого действия цисплатина относят перикисное окисление мембран клеток, митохондриальную дисфункцию, повреждение целостности спирали ДНК клеток с образованием аддуктов [3, 10]. И все большее внимание для понимания причин повреждения клеток уделяется процессу апоптоза. Развитие апоп-тоза происходит при снижение антапоптотической
защиты в клетке, которая выражается в снижении антиапоптотических белков (семейство 1АР-белков, Ьс1-2 и др.) и активации проапоптотических белков, таких как р53, Вах, АЩ эндонуклеаза G, цитохром С, каспаза-3,9 и др. [9].
Цель исследования. Создать экспериментальную модель снижения слуха под воздействием ци-сплатина, выявить закономерности снижения слуха методами отоакустической эмиссии на частоте продукта искажения (ПИОАЭ) и коротколатентных слуховых вызванных потенциалов (КСВП) и гистологически определить локализацию повреждений внутреннего уха.
Пациенты и методы исследования. Для поставленной цели нами было обследовано 20 мышей-самцов линии BALB/C в возрасте 3-7 месяцев. В качестве общей анестезии во всех исследованиях использовали комбинацию препаратов золетил в дозировке 4-8 мг на 100 г и ксил в дозировке 2-4 мг/ кг внутримышечно.
Первым этапом регистрировали нормальные показатели слуховой функции животных методом КСВП и ПИОАЭ. Регистрировали ПИОАЭ. Отоакустический ответ зарегистрирован у всех животных. При регистрации ПИОАЭ в качестве стимула применяли одновременно две тональные посылки с частотами Д и / (/меньше /2; /2//1 = 1,22) соотношение сигнал/шум превышало 4 дБ. В 39% случаев получена горизонтальная форма кривой
(форма плато), в 61% ушей - восходящая кривая. Среднее значение ответа на частотах представлено на рис. 1. Рисунок представлен восходящей кривой с минимальным значением на частоте 818 Гц и максимальным - на частоте 7126 Гц.
При оценке порогов слышимости методом КСВП у мышей выявлены первые пики при интенсивности в среднем 25±8 дБ. Анализ исследования показал, что волна I регистрируется в 100% случаев, возникает на 1,8±0,2 мс и имеет максимально высокую амплитуду и стабильную форму. Волна V регистрируется в 70% исследований, четко дифференцируются только при высокой интенсивности стимула. Следует отметить увеличение амплитуды пиков, особенно I и III, по отношению к волнам человека.
На втором этапе животным вводили цисплатин в дозировке 12 мг/кг интраперитонеально, однократно. Регистрацию КСВП и ПИОАЭ проводили на 30-е сутки. При исследовании ПИОАЭ у 80% ушей ответа зарегистрировано не было (полученный ответ не превышал 4 дБ ни на одной частоте). В 20% случаев амплитуда ответа на всех частотах снизилась. Динамика показателей до и после введения цисплатина представлена на рис. 1.
По данным исследования КСВП после инъекции цисплатина во всех случаях повысились пороги слуха и латентность волн. Среднее значение порогов слуха у всех мышей, пролеченных цисплатином, составило 68,7±3,2 дБ.
Средние значения ПИОАЭ под наркозом
Средние значения ПИОАЭ после приема цисплатина (на 30-е сутки)
Частота, Гц
Рис. 1. Динамика изменения средних значений ПИОАЭ у мышей до и после приема цисплатина (п = 20).
3
Рис. 2
КСВП мышей в норме справа и однократно пролеченных цисплати-ном на 30-е сутки слева.
Рис. 3. Изменения в спиральном ганглии мышей, вызванные Рис. 4. Изменения в кортиевом органе мышей, вызванные
цисплатином.
цисплатином.
Рис. 5. Изменения в сосудистой полоске мышей, вызванные ци- Рис. 6. Изменения в кортиевом органе мышей, вызванные сплатином. Иммуногистохимическое исследование с исполь- цисплатином. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к белку Ьах. зованием антител к белку Ьс1-2.
Рис. 7. Изменения в сосудистой полоске мышей, вызванные цисплатином. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к белку Ьс1-2.
Далее все животные были выведены из эксперимента по всем правилам работы с животными.
Выделенные с двух сторон улитки животных фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и декальцинировали в растворе ЭДТА. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 3-4 мкм по стандартной методике с использованием готовых к употреблению поликлональных кроличьих антител к bax (проапоптотический белок, Spring Bioscience) и моноклональных мышиных антител к bcl-2 (клон 124, антиапоптотический белок,
Dako). Экспрессию оценивали полуколичественным методом по степени интенсивности окрашивания.
Результаты исследования. При микроскопическом исследовании препаратов внутреннего уха, окрашенных гематоксилином и эозином, установлены изменения спирального ганглия кортиева органа и сосудистой полоски. В клетках спирального ганглия животных, подвергшихся действию цисплатина, визуализируются выраженная вакуолизация цитоплазмы клеток и снижение базофильности ядер по сравнению с клетками интактного спирального ганглия (рис. 3).
Подобные изменения прослеживаются и в клетках сосудистой полоски. Наблюдаются увеличение объема наружных волосковых клеток, что обуслов-
лено их отеком, а также снижение базофильности клеточных ядер (рис. 4).
При иммуногистохимическом исследовании в цитоплазме клеток сосудистой полоски у животных опытной группы выявлено повышение уровня экспрессии проапоптотического белка Ьах (рис. 5).
Одновременно у животных опытной группы отмечено снижение содержания Ьс1-2-протеина, принадлежащего семейству антиапоптотических белков, в клетках кортиева органа и сосудистой полоски, что характеризует возможность вступления клеток в апоптоз (рис. 6 и 7).
Выводы
Описанная модель может использоваться для изучения цисплатин-индуцированной нейро-сенсорной тугоухости в дальнейших экспериментальных исследованиях.
Цисплатин в высокой дозировке приводит к стойкому снижению слуха, что было зарегистрирована методом ПИОАЭ и КСВП
Гистологическое исследование показало, что цисплатин приводит к активации внутриклеточных процессов апоптоза и снижению антиапоптотической защиты в клетках сосудистой полоски, спиральном ганглии и кортиевом органе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Стаховская О. А. Ототоксичность цисплатина и пути ее профилактики при лечении злокачественных опухолей у детей: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2002. - 25 с.
2. Экспериментальное исследование острого ототоксического эффекта цисплатина / М. Р. Богомильский [и др.]: тез. докл. IV-го Междунар. симп. «Современные проблемы физиологии и патологии слуха». - М., 2001. -С. 156-158.
3. Adverse effects of anti-tumor drug, cisplatin, on rat kidney mitochondria: disturbance in glutathione peroxidase activity / S. Sugiyama [ at al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1989. - N 159. - Р. 1121-1127.
4. Analysis of risk factors for cisplatin-induced ototoxicity in patients with testicular cancer / C. Bokemeyer [at al.] // Br. Jurn. Cancer. 1998. - Apr. - N 77 (8). - P. 1355-1362.
5. Cisplatin Ototoxicity and Protection: clinical and experimental studies / L. Rybak [at al.] // Tohoku Jurn. Exp. Med. -2009. - Nov. - N 219 (3). - P. 177-186.
6. Cisplatin ototoxicity: the importance of baseline audiometry / J. L. Nagy [at al.] // Am. Jurn. Clin. Oncol. - 1999. -Vol. 22, N 3. - P. 305-308.
7. Evoked otoacoustic emissions - an approach for monitoring cisplatin induced ototoxicity in children / P. Stavroulaki [at al.] // Intern. Jurn. Pediatr. Otorhinolaryngol. - 2001. - Vol. 59. - P. 47-57.
8. Hearing loss in children and young adults receiving cisplatin with or without prior cranial irradiation / M. J. Schell [at al.] // Jurn. Clin. Oncol. - 1989. - N 7. - P. 754-760.
9. Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis? / V. M. Gonzalez [at al.] // Mol. Pharmacol. - 2001, Apr. - N 59 (4). - P. 657-663.
10. Mitochondrial injury: an early event in cisplatin toxicity to renal proximal tubules // H. R. Brady [at al.] // Am. Jurn. Physiol. - 1990. - N 258. - Р. F1181-F1187.
11. Ototoxicity due to cis-diamminedichloroplatinum in the treatment of ovarian cancer: influence of dosage and schedule of administration / G. S. Waters [ at al.] // Ear and Hearing. - 1991. - Vol. 12, N 2. - P. 91-102.
12. Ototoxicity from cisplatin therapy in childhood cancer / P. P. Coradini [at al.] // Jurn. Pediatr. Hematol. Oncol. -2007. - N 29. - P. 355-360.
13. Ototoxicity of cisplatinum in children and adolescents / R. Skinner [at al.] // Br. Jurn. Cancer. - 1990. - Vol. 61. -P. 927-931.
14. Phase II study of cis-dichlorodiammineplatinum (II) in childhood osteosarcoma: children's cancer study group report / E. S. Baum [at al.] // Cancer Treat. Rep. - 1979. - Vol. 63. - P. 9-10.
15. Selective inner hair cell ototoxicity induced by carboplatin / M. Wake [at al.] // Laryngoscope. - 1994. - Apr. -N 104 (4). - P. 488-493.
16. Skinner R. Best practice in assessing ototoxicity in children with cancer / Eur. Jurn. Cancer. - 2004. - N 40. - P. 23522235.
17. Tattersall M. Ototoxicity in patients receiving cisplatin: importance of dose and method of drug administration / R. R. Reddel [at al.] // Cancer Treat. Rep. - 1982. - Vol. 66. - P. 19-23.
18. Weekly high-dose cisplatin is a feasible treatment option: analysis on prognostic factors for toxicity in 400 patients / F. E. Jongh [at al.] // Br. Jurn. Cancer. - 2003. - Apr. 22. - N 88 (8). - P. 1199-1206.
Кудеева Яна Юрьевна - мл. н. с. Московского научно-исследовательского клинического института оториноларингологии им. Л. И. Свержевского Департамента здравоохранения Москвы, аспирант каф. оториноларингологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н. И. Пирогова. Россия, 117152, Москва, Загородное шоссе, д. 18А, стр. 2; тел. 8-926-108-31-48, е-mail: Ya_ kudeeva@mail.ru
Байбакова Елена Викторовна - канд. мед. наук, ст. н. с. Московского НИКИО им. Л. И. Свержевского ДЗ Москвы. Россия, 117152, Москва, Загородное шоссе, д. 18А, стр. 2; тел.: +7-495-633-92-06, е-mail: erotermel@ gmail.com
Чугунова Мария Александровна - канд. мед. наук, н. с. Московского НИКИО им. Л.И. Свержевского ДЗМ. Россия, 117152, Москва, Загородное шоссе, д. 18А, стр. 2; тел.: +7-495-633-92-06, E-mail: chugunova-la@mail.ru
Резакова Надежда Валерьевна - аспирант каф. оториноларингологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова. Россия, 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1; тел.: +7-495-633-92-06, е-mail: nvkalinina@mail.ru.
Referenses
1. Stahovskaja O. A. Ototoksichnost' cisplatina i puti ee profilaktiki pri lechenii zlokachestvennyh opuholej u detej: avtoref. dis. kand. med. nauk M., 2002, 25 p.
2. Jeksperimental'noe issledovanie ostrogo ototoksicheskogo jeffekta cisplatina. Bogomil'skij M. R. [i dr.] Tezisy dokladov IV-go mezhdunarodnogo simpoziuma "Sovremennye problemy fiziologii i patologii sluha" (Suzdal', 19-21 ijunja 2001 g.), pp. 156-158.
3. Adverse effects of anti-tumor drug, cisplatin, on rat kidney mitochondria: disturbance in glutathione peroxidase activity. Sugiyama S. [at al.]. Biochem. Biophys. Res. Commun., N 159, 1989, pp. 1121-1127.
4. Analysis of risk factors for cisplatin-induced ototoxicity in patients with testicular cancer. Bokemeyer C. [at al.]. Br. Jurn. Cancer. Apr 1998, N 77(8), pp. 1355-1362.
5. Cisplatin Ototoxicity and Protection: Clinical and Experimental Studies. Rybak L. [at al.]. Tohoku J. Exp. Med., Nov 2009, N 219(3), pp. 177-186.
6. Cisplatin ototoxicity: the importance of baseline audiometry. Nagy J. L. [at al.]. Am. J. Clin. Oncol., 1999, vol. 22, N 3, pp. 305-308.
7. Evoked otoacoustic emissions — an approach for monitoring cisplatin induced ototoxicity in children. Stavroulaki P. [at al.]. Intern. J. Pediatr. Otorhinolaryngol., 2001. vol. 59, pp. 47-57.
8. Hearing loss in children and young adults receiving cisplatin with or without prior cranial irradiation. Schell M. J. [at al.]. Jurn. Clin. Oncol., 1989, N 7, pp. 754-760.
9. Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis? Gonzalez V. M. [at al.]. Mol. Pharmacol., 2001, Apr, N 59(4), pp. 657663.
10. Mitochondrial injury: an early event in cisplatin toxicity to renal proximal tubules. Brady H. R. [at al.]. Am. J. Physiol., N 258, 1990, pp. F1181-F1187.
11. Ototoxicity due to cis-diamminedichloroplatinum in the treatment of ovarian cancer: influence of dosage and schedule of administration. Waters G. S. [at al.]. Ear and Hearing, 1991, vol. 12, N 2, pp. 91-102.
12. Ototoxicity from cisplatin therapy in childhood cancer. Coradini P. P. [at al.]. Jurn. Pediatr. Hematol. Oncol., 2007, N 29, pp. 355360.
13. Ototoxicity of cisplatinum in children and adolescents. Skinner R. [at al.]. Br. Jurn. Cancer., 1990, vol. 61, pp. 927-931.
14. Phase II study of cis-dichlorodiammineplatinum (II) in childhood osteosarcoma: children's cancer study group report. Baum E. S. [at al.]. Cancer Treat. Rep., 1979, vol. 63, pp. 9-10.
15. Selective inner hair cell ototoxicity induced by carboplatin. Wake M. [at al.]. Laryngoscope, 1994, Apr, N 104 (4), pp. 488-493.
16. Skinner R. Best practice in assessing ototoxicity in children with cancer. Eur Jurn. Cancer, 2004, N 40, pp. 2352-2235.
17. Tattersall M. Ototoxicity in patients receiving cisplatin: importance of dose and method of drug administration. Reddel R. R. [at al.]. Cancer Treat. Rep., 1982, vol. 66, pp. 19-23.
18. Weekly high-dose cisplatin is a feasible treatment option: analysis on prognostic factors for toxicity in 400 patients. Jongh F. E. [at al.]. Br Jurn. Cancer, 2003, Apr 22, N 88 (8), pp. 1199-1206.
Kudeeva Yana Yu. - researcher, Department of inner ear pathology. Moscow State Scientific Centre of Otorhinolaryngology named after L.I. Sverzhevsky, Ministry of Healthcare of Moscow. 117152, Moscow, Country Shosse. 18A, p. 2, ph. 8-926-108-31-48, e-mail: Ya_kudeeva@mail.ru
Baybakova Elena V. - researcher, Department of inner ear pathology. Moscow State Scientific Centre of Otorhinolaryngology named after L.I. Sverzhevsky, Ministry of Healthcare of Moscow. 117152, Moscow, Country Shosse. 18A, p. 2, ph. +7-495-633-92-06, e-mail: erotermel@gmail.com
Chugunova Mariya A. - researcher, Department of inner ear pathology. Moscow State Scientific Centre of Otorhinolaryngology named after L. I. Sverzhevsky, Ministry of Healthcare of Moscow. 117152, Moscow, Country Shosse. 18A, p. 2, ph. +7-495-633-92-06, e-mail: chugunova-la@mail.ru
Rezakova Nadegda V. - graduate student Russian State Medical University named after N. I. Pirogov. 117997, Moscow, ul. Ostrovityanova, h. 1, ph. +7-495-633-92-06, e-mail: nvkalinina@mail.ru
