CC BY
184
ИММУНОГЕНЕТИКА В ГЕМАТОЛОГИИ
Бидерман Б. В., Хамаганова Е. Г., Якутик И. А., Судариков А. Б.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр Министерства здравоохранения России», Москва.
ТИПИРОВАНИЕ ГЕНОВ HLA-A*/B*C*/DRB1*/DQB1* МЕТОДОМ PCR-SBT У ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ПОКАЗАНИЯМИ К АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
PCR-SBT (sequence based typing) — метод секвенирования ДНК, позволяющий напрямую определить первичную последовательность ти-пируемого гена того или иного локуса HLA (от англ. Human Leukocyte Antigens). Количество вновь открываемых HLA-аллелей постоянно увеличивается, для выявления вновь открываемых HLA-аллелей должна постоянно расти панель олигонуклеотидных проб при типировании методом PCR-SSOP (sequence specific oligonucleotide probes) или панель праймеров при типиро-вании методом PCR-SSP (sequence specific primers). Только секвенирование дает возможность выявить новый аллель, к которому еще нет оли-гонуклеотидных зондов или праймеров, и избежать ошибки, неизбежной в данном случае при использовании методов PCR-SSOP или PCR-SSP. PCR-SBT особенно важен при подборе пар донор-реципиент при неродственной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), поскольку от HLA-идентичности больного и донора во многом зависит исход трансплантации. Секвенирование генов HLA, в отличие от других методов HLA-генотипирования, позволяет проводить определение аллельных вариантов генов главного комплекса гисто совместимости (у человека — HLA) путем прямого сравнения первичных последовательностей нуклеотидов в цепочке ДНК анализируемого образца с консенсусной последовательностью нуклеотидов в соответствующем гене HLA в базе данных. Основной проблемой при PCR-SBT является правильное разрешение так называемых неоднозначностей, возникающих вследствие гетерозиготности генов HLA, когда не ясно к какому именно из двух HLA гаплотипов относится данный нуклеотид. Этой проблемы можно избежать, используя вариант аллельспецифичного секвенирования.
В ФГБУ ГНЦ Минздрава России проведено типирование методом аллельспецифичного PCR-SBT на наборах «Protrans» (Germany): Protrans S4 (локусы HLA-A*/B*/C*/DRB1*) и Protrans S3 (HLA-DQB1*) 20 больных с показаниями к ал-логенной ТГСК, у которых связи с отсутствием
HLA-идентичного сибса, планировалось проведение неродственной ТГСК. Также типирование методом PCR-SBT было проведено у одной HLA-идентичной пары больной-брат для подтверждения HLA-геноидентичности; и у одной пары больной-брат, где было неизвестно, являются ли больной и донор HLA-геноидентичными. В одном случае секвенирование использовалось для подтверждения носительства аллеля В* 15:10, установленного ранее при типировании методом PCR-SSP c праймерами «Invitrogen» (USA). При типировании локусов HLA класса 1 проводилось секвенирование экзонов 2 и 3, при типировании локусов HLA класса 2 — экзона 2.
Во всех случаях типирования методом PCR-SBT Protrans S4 (S3 для DQB1) получены результаты на уровне «высокого разрешения», т. е. с четырьмя цифрами и выше. Секвенирование 2 и 3 генов класса 1 и экзона 2 генов класса 2 в большинстве случаев дало возможность провести типирование на уровне стрингов аллелей, имеющих одинаковые нуклеотидные последовательности экзонов, кодирующих пептидсвязыва-ющие домены молекул HLA, т. е. с маркировкой G, например, A*03:01:01G, B*15:01:01G и т.д.
Секвенирование локуса В методом PCR-SBT Protrans S4 у пациентки с В* 15:10 (В71) подтвердило носительство этого редкого для нашей популяции аллеля, более характерного для популяций субсахарского региона Африки (результат секвенирования В*15:10:0Ю). Т аким образом, секвенирование методом PCR-SBT на наборах «Protrans» (Germany): Protrans S4 (локусы HLA-A*/B*/C*/DRB1*) и Protrans S3 (HLA-DQB1*) дало возможность провести HLA-типирование больных, нуждающихся в аллогенной ТГСК от неродственного донора, на соответствующем уровне, отвечающем современным требованиям для HLA-типирования при неродственной ТГСК. К недостаткам метода можно отнести его относительную трудоемкость и дороговизну по сравнению с другими распространенными методами ДНК-типирования (PCR-SSOP и PCR-SSP).
