CC BY
75
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.15421/nvlvet8707 http://nvlvet.com.ua/
UDC 619:614.3.7:636.4
The study of essential oil on antimicrobial activity and their composition towards microorganism
V.L. Kovalenko1, O.O. Napnenko1, I. Chornyi2, A.V. Zagrebelnyi3
1State Scientific Control Institute Biotechnology and Strains of Microorganisms, Kyiv, Ukraine 2State Agrarian and Engeneering University in Podilya, Kamyanets-Podilskyi, Ukraine
3State Scientific and Research Institute of Laboratory Diagnostics and Veterinary and Sanitary Expertise, Kyiv, Ukraine
Article info
Received 05.02.2018 Received in revised form
09.03.2018 Accepted 16.03.2018
State Scientific Control Institute
Biotechnology and Strains of Microorganisms, Donetska str., 30, Kyiv, 03151, Ukraine. Tel.: +38-044-245-76-08 E-mail: [email protected]
State Agrarian and Engeneering University in Podilya, T. Shevchenko Str., 13, Kamyanets-Podilskyi ,32316, Ukraine. Tel.: +38-038-496-83-22 E-mail: [email protected]
State Scientific and Research Institute of Laboratory Diagnostics and Veterinary and Sanitary Expertise, Donetska str., 30, Kyiv, 03151, Ukraine. Tel.: +380 (44) 243-37-54 E-mail:
Kovalenko, V.L., Napnenko, O.O., Chornyi, I., & Zagrebelnyi, A.V. (2018). The .study of essential oil on antimicrobial activity and their composition towards microorganism. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(87), 38-41. doi: 10.15421/nvlvet8707
In the course of the research, the microorganisms that often caused disease for animals were used, according to the literature, were genetically predisposed to resistance to traditional antibiotics and needed to find new effective means to combat them. It was used different antibiotic substances benzalkonium chloride, silver nanoparticles, and promising in this direction, essential oils of plants: fir, eucalyptus. The article provides information on the selection and study of the efficacy of substances, components with essential oils necessary for the development of complex bactericidal agents and the study of their antimicrobial activity against microorganisms. In determining the antimicrobial activity of essential oils, test cultures were used: Microccoccus luteusATCC9341, Microccoccus lisogenicus, B. subtilisAATCC6633, B.cereusATCC6633, S. aureus 209-P, S. zooepidemicus, Clebsiella spp, Salmonella cholerae suis, Pasterella multocida from the museum of State Scientific and Control Institute of Biotechnology and strains of microorganisms. The determination of fungicidal acity was performed on microscopic molds of Penicillium citrinum, Penicillium urticae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus. In experiments with Staphilococcus aureus, Streptococcus zooepidemicus, Pasteurella multocida, the antibiotic action of essential oils of eucalyptus and puff was confirmed and the possibility of its enhancement by the addition of quaternary ammonium compounds was confirmed. According to the results, the use as an alternative to antibiotics and disinfectants of preparations based on vegetable essential oils in the form of aerosols not only improves the number of animals from respiratory infections of bacterial origin, but also significantly improves the ecological conditions of the work of personnel in livestock buildings, promotes treatment and prevention respiratory diseases. The investigations have proved the expediency of using vegetable essential oils for the design of highly effective drugs and the possibility of enhancing their antimicrobial activity by quaternary ammonium compounds and silver nanoparticles, as well as a complex preparation «Asept» for aerosol application in the presence of animals.
Key words: essential oils, microorganisms, benzalkonium chloride, nanoparticles, bactericidal agent.
п • ^ •• • 1 • • и •• • и
Вивчення антим1крооно1 активносл еффних ол1и та 1х композицш до м1крооргашзм1в
В.Л. Коваленко1, О.О. Напненко1, 1.О. Чорний2, О.В. Загребельний3
'Державний науково-контрольний шститут бютехнологи i штамiв мiкроорганiзмiв, м. Кшв, Украша 2Подтьський державний аграрно-технiчний унiверситет, м. Кам'янець-Подшьський, Украша 3Державний НД1 з лабораторно'1 дiагностики та ветеринарно-сантарноI експертизи, м. Кшв, Украша
При проведент до^джень використовували мтрооргатзми, як найчастiше спричиняли захворювання тварин, були, за дани-ми лтератури, генетично схильними до набуття резистентностi до традицшних антибютичних речовин та потребували пошу-ку нових ефективних засобiв для боротьби з ними. В роботi використовували як рiзнi антибютичш субстанцп бензалкотя хлорид, наночастинки срiбла, так i перспективш в цьому напрямку ефiрнi олп рослин: тхти, евкалтту. У статтi наведена тформащя
щодо тдбору та вивчення ефективностi субстанцт, KOMnonenmie з eфiрними олiями, neo6xiÖHUx для розробки комплексных бактерицидных 3aco6ie та вивчення гх антимтробног акmивнoсmi до мiкрooрганiзмiв. При визначенш антимтробног акmивнoсmi eфiрних олш використовували тест-культури: Microccoccus luteus ATCC9341, Microccoccus lisogenicus, B. subtilis AATCC6633, B.cereus ATCC6633, S. aureus 209-P, S. zooepidemicus, Clebsiella spp, Salmonella cholerae suis, Pasterella multocida з музею Державнго науково-контрольного тституту бютехнологп i шmамiв мiкрooрганiзмiв. Визначення фунгщидног акивнoсmi проводили на мтрос-котчних плкеневих грибах Penicillium citrinum, Penicillium urticae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus. В до^дах з тест-мтрооргатзмами Staphilococcus aureus, Streptococcus zooepidemicus, Pasteurella multocida тдтверджена антибютична дiя eфiрних олш евкалтту i тхти та тдтверджено можливкть гг тдсилення додаванням четвертинних амоншних сполук. У вiдnoвiднoсmi до рeзульmаmiв, застосування як альтернативи антибютикам та дезшфкючим засобам nрenараmiв на oснoвi рослинних eфiрних олш у виглядi аeрoзoлiв не ттьки оздоровлюе noгoлiв 'я тварин вiд рестраторних тфекцш бакmeрiальнoгo походження, але й значно покращуе eкoлoгiчнi умови роботи персоналу в тваринницьких примщеннях, сприяе лкванню та попередженню захворю-вання дихальних шляхiв. Д^дженнями доведено доцтьтсть використання рослинних eфiрних олш для конструювання високоефе-ктивних nрenараmiв та можливкть тдсилення гх антимтробног акmивнoсmi четвертинними амоншними сполуками та наночас-тинками срiбла, а також запропоновано комплексний препарат «Асепт» для аерозольного застосування в nрисуmнoсmi тварин.
Ключовi слова: eфiрнi олп, мтрооргатзми, бензалкотя хлорид, наночастинки, бактерицидний зааб.
Вступ
Найбiльшi збитки тваринницьк господарства несуть ввд захворювань, що супроводжуються уражен-ням дихально! та шлунково-кишково! системи. В бшьшосл випадшв в 1'хнш основi лежать шфекцшш захворювання переважно бактершного походження. Водночас юнуе багато факторiв як бютичних, так i абютичних, яш виступають пусковим мехашзмом та значно впливають на подальший розвиток цих захво-рювань, а також ефектившсть методiв та засобiв 1'х профшактики i л^вання (Kurtyak et al., 2017; Boiko et al., 2017; Levkivska et al., 2017; Kysera et al., 2018; Gutyj et al., 2018).
Причинами захворювань тварин можуть бути також порушення технолопчного процесу та навггь людський фактор. Вс щ причини та фактори, що сприяють розвитку шфекцшного процесу, призводять до функцюнальних порушень оргашзму тварин та до розвитку шфекцшних захворювань, ефективно боро-тись iз якими можна лише одночасним впливом на ва ланки технолопчного процесу. Таким чином, пробле-ми профшактики i л^вдаци бактерiальних захворювань тварин в промислових господарствах необхвдно вирiшувати в комплекс з вирiшенням iнших техноло-гiчних питань щодо утримання та годiвлi тварин (Lorian, 1996; Hanaki and Hiramatsu, 2001; Homzykov, 2006; Vasilyeva, 2016).
Мета роботи: пiдбiр та вивчення ефективносп субстанцiй, компоненпв, необхiдних для розробки комплексних антибактершних засобiв та вивчення 1хньо1 антимшробно! активностi до мiкроорганiзмiв.
При проведенш дослвджень використовували шк-роорганiзми, яш найчастiше спричиняли захворювання тварин, були, за даними лiтератури, генетично схильними до набуття резистентностi до традицшних антибiотичних речовин та потребували пошуку нових ефективних засобiв для боротьби з ними (Weidemann, 1998; Kovalenko and Nedosiekov, 2011).
MaTepia™ та методи дослiджень
У робот використовували як рiзнi антибiотичнi субстанцп бензалконiя хлорид, наночастинки срiбла, так i перспективш в цьому напрямку ефiрнi олл рос-лин: тхти, евкалшта. Застосовували поживнi середо-вища: МПАХ, МПА, МПБХ, МПБ, середовище Сабу-
ро, тiоглiколеве середовище. Bei середовища готували згiдно з настановами або за загальноприйнятими методиками та стерилiзували автоклавуванням (при температурi 118 °С - 60 хвилин).
При вивченш антибютично! активностi ефiрних олiй методом дифузй' в агар враховували особливосп ix дифундування, яш обумовленi ^тми лiпофiльними компонентами, i можливими зменшеннями зон затримки росту на агарi порiвняно з xiмiчними засо-бами. Дослiдження антимшробно! активносп ефiрниx олiй проводили iз застосуванням модифiкованиx з урахуванням нерозчинностi ефiрниx олiй в водi мето-дiв, а саме: методу макророзведень в поживному се-редовищi з подальшим культивуванням в умоваx, оптимальниx для мiкроорганiзмiв; методу дифузй' в агар iз застосуванням паперовиx дискiв, просочент певними концентрацiями ефiрниx олiй.
Вивчення мшмально дiючиx к1лькостей та конце-нтрацiй рослинниx ефiрниx олiй на тестовi мшроор-ганiзми та деяш патогеннi iзоляти проводили за застосування методу дифузй' з ураxовуванням особливосп поширення ефiрниx олiй, яш обумовленi ix лiпофiль-ними компонентами, тому зони затримки росту на агарi будуть значно меншими, нiж при застосуванш водорозчинниx антибiотичниx речовин та xiмiчниx дезiнфектантiв.
При визначеннi антимiкробноi активносп ефiрниx олiй використовували тест-культури: Microccoccus luteus ATCC9341, Microccoccus lisogenicus, B. subtilis AATCC6633, B.cereus ATCC6633, S. aureus 209-P, S. zooepidemicus, Clebsiella spp, Salmonella cholerae suis, Pasterella multocida з музею Державного науково-контрольного шституту бiотеxнологii i штамiв мiкроорганiзмiв. Визначення фунгщидно! акивностi проводили на мiкроскопiчниx плiсеневиx грибаx Penicillium citrinum, Penicillium urticae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus.
Бактерицидну дш 2 ефiрниx олiй та ix сумiшi ви-вчали в 3 серiяx дослiдiв iз застосуванням тест-об'екпв. Тест-об'екти (10*Шсм) iнфiкували суспензь ею однодо6ово1' агаровоi культури Е. coli (шт. 1257) i S. aureus (шт. 209-Р) з розраxунку 2 млрд мжробнт клiтин в 1 см3 суспензп культур, приготовлениx ввд-поввдно до оптичного стандарту МакФарланда на 100 см2 поверxнi. В контрольна дослiдаx аналогiчно iнфiкованi тест-об'екти зрошували фiзiологiчним розчином. У кожному дослщ використовували не
менш трьох TecT-o6'eKTÍB. Ефiрнi оли наносили на тест-об'екти в концентрацшх 1:4000 - 1:8000.
Пiсля зашнчення вщповщно1 експозицп з контро-льних i дослвдних тест-об'eктiв брали змиви стериль-ними марлевими тампонами, яш вмiщували в пробiр-ки з нейтралiзатором. Змиви дослiджували за загаль-ноприйнятою методикою (ввдмивання центрифугу-ванням, висiвом центрифугату на 50% сахарозний МПБ з пересiвом через 24 години, шкубування в термостатi при температурi 37 °С, для видшення Е. coli використовували середовище Ендо, та 8,5% сольовий МПА для iндикацil S. aureus).
Ефективнiсть знезаражування визначали за наявнь стю або вщсутшстю росту тест-культур на живильних середовищах при шкубацп посiвiв у термостап при 37 °С через 48 годин i 7 дiб (Lorian, 1996; Hanaki and Hiramatsu, 2001; Homzykov, 2006).
Результати та ix обговорення
Результати дослiдiв з визначення антимшробнох активностi ефiрних олш рослин (шхтово1 та евкалш-тово!) та в поeднаннi гх з тдсилювачами антимшроб-но! дй' - четвертинними амоншними сполуками та наночастинками срiбла до мiкроорганiзмiв Staphylo-
coccus aureus, Streptococcus spp, Pasteurella multocida. Результати дослвджень викладеш в таблиц 1.
Отримаш даш сввдчать про високу антимжробну актившсть еф1рних олш евкалшта та тхти та особливо ïxhîx сумшей з бензалкошем хлоридом. Додавання наночастинок ср1бла значно тдвищуе антибютичну дш розчишв еф1рних олш. При застосуванш чистих еф1рних олш та сумшей еф1рних олш спостер1гали пригшчення росту культур тестових мiкроорганiзмiв Streptococcus zooepidemicus, Staphylococcus aureus, Pasterella multocida, а при застосуванш тих же сумь шей 1з додаванням бензалкошя хлориду та наночастинок ср1бла - значно шдсилювалась антимшробна д1я.
При вивченш мшмально дшчих кшькостей та концентрацш рослинних еф1рних олш на тестов1 мжрооргашзми та деяк1 патогенш 1золяти методом дифузп в агар, при нанесенш на паперов1 диски 0,10,3 мл еф1рних олш встановлювали зони затримки росту досл1джуваних культур, що перебували в межах 14-70 мм. За ефектившстю антибактер1ально1 дп ефь рн олiï визначились таким порядком: шхта, евкалшт.
Результати дослiджень (табл. 2-3) вказують на високу антибактерiальну актившсть ефiрних олiй у ввдношенш до тест-мiкрорганiзмiв.
Таблиця 1
Результати вивчення aнтимiкpoбнoï дiï eфipниx oлiй та кoмпoзицiй на тecтoвi мiкpoopгaнiзми Streptococcus zooepidemicus, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida
Розчини (зaвиci) eфipниx oлiй та ïxm cyмiшi в МПБ (0,05 мл на диж)
Streptococcus zooepidemicus
Дiaмeтp зон зaтpимки po^ (мм)
Staphylococcus aureus
Pasteurella multocida
Бензалкошум xлopид (0,1%) 19 ± 3 22 ± 2 19 ± 2
Пixтoвa eфipнa oлiя 22 ± 2 21 ± 3 15 ± 1
Eвкaлiптoвa eфipнa олш 15 ± 1 13 ± 1 18 ± 2
Cyмiш eфipниx ол1й з додаванням бензал- 25 ± 3 29 ± 2 26 ± 3
кoнiyмy xлopидy
Cyмiш eфipниx олш з додаванням бензал- 33 ± 2 35 ± 3 36 ± 1
кoнiyмy xropn^ та нaнoчacтинoк cpiблa
Кoнтpoль Cyцiльний picт Cyцiльний picт Cyцiльний piCT
Таблиця 2
Результати вивчення дй' eфipниx oлiй на тecт-мiкpopгaнiзми
_ ,. . ...... __ Дiaмeтp зон зaтpимки pocтy бaктepiй (мм)
Eфipнi оли (100 мл -—-L-L-L---L—-—-
ч „ ,. „ B. subtilis M. luteus S. aureus
на диcк)_E—_B. cereus_ATCC6633 ATCC9341 P 209
Eвкaлiптy 19 17 23 21 22
nixra 17 19 18 19 21
Таблиця 3
Результати вивчення дп eфipниx oлiй на пoльoвi пaтoгeннi iзoляти бaктepiй
Дiaмeтp зон зaтpимки pocтy бaктepiй (мм) ^и нaнeceннi на диcки eфipниx ол1й (мкл)
Miкpoopгaнiзми _nixrn_Eвкaлiптy
100 50 100 50
E. coli 0 0 31 12
Salmonella cholerae suis 0 0 27 9
Staphylococcus aureus 0 0 33 18
Streptococcus zooepidemicus 19 11 41 23
Pasteurella multocida 27 18 23 11
Klebsiella pneumoniae 0 0 0 0
Clostridium perfringens 17 9 0 0
При внесенш ефiрниx олiй в живильш середовища у спiввiдношенняx 1:10 - 1:200 проявляеться рiзний стутнь антибактерiйноi дп до дослiджуваниx бак-терiальниx культур. За ефективнiстю фунгщидно! ди ефiрнi олп визначались наступним порядком: пixта, евкалiпт.
Зони затримки росту мiкроскопiчниx плiснявиx грибiв (при нанесенш на паперовi диски 0,1-0,3 мл ефiрниx олiй) знаxодились в межаx 20-50 мм. Додат-ково вц^чались змiна кольору грибниx культур вЦд центру до кра!в чашки Петрг При внесеннi ефiрниx олш в живильш середовища з плюнявими грибами - в спiввiдношенняx 1:10 - 1:100 проявляеться фунгщид-на дЦя вЦд пригшчення (поодинош колош!, змша кольору гри6Цв, вщсутшсть повггряного мiцелiю).
Висновки
В дослiдаx з тест-мжрооргатзмами Staphilococcus aureus, Streptococcus zooepidemicus, Pasteurella multocida тдтверджена антибютична дЦя ефiрниx олш евкалшту i пixти та пiдтверджено можливЦсть ii тд-силення додаванням четвертиннт амонiйниx сполук.
ВЦдповЦдно до результата, застосування як альте-рнативи антибютикам та дезшфшуючим засобам пре-паратш на основЦ рослинниx ефiрниx олш у виглядЦ аерозолiв не тшьки оздоровлюе поголЦв'я тварин вЦд респiраторниx iнфекцiй бактерiального поxодження, а й значно полшшуе екологiчнi умови роботи персоналу в тваринницькт примiщенняx, сприяе лшуван-ню та запобланню заxворювання диxальниx шляxiв.
Дслiдженнями доведено доцшьшсть використання рослинниx ефiрниx олш для конструювання високое-фективниx препарапв та можливЦсть пiдсилення ix антимтробно! активностi четвертинними амонiйними сполуками та наночастинками срiбла, а також запро-поновано комплексний препарат «Асепт» для аерозо-льного застосування в присутносп тварин.
References
Boiko, O.P., Sen, O.M., Boiko, P.K., Kurtiak, B.M., Pun-diak, T.O., & Sobko, G.V. (2017). Characteristics of morphological signs and physiological properties of salmonel stems, isolated from birth and television. Scientific Messenger LNUVMB, 19(78), 129-135. doi:10.15421/nvlvet7826.
Gutyj, B., Grymak, Y., Hunchak, V., Mysak, A., Nazaruk, N., Brezvyn, O., Hariv, I., Shcherbatyy, A., Semeniv, B., Bushueva, I., Parchenko, V., & Kaplaushenko, A. (2018). Preclinical searches of the preparation Thire-omagnile. Ukrainian Journal of Ecology. 8(1), 688695. doi: 10.15421/2018_267.
Hanaki, H., & Hiramatsu, K. (2001). Detection methods of glycopeptide-resistant Staphylococcus aureus. Susceptibility testing. Methods in Molecular Medicine. 48, 85-91 doi: 10.1385/1-59259-077-2:85.
Homzykov, O.M. (2006). Profilaktyka ta likuvannia hostrykh respiratornykh zakhvoriuvan teliat aerozoliamy aktyvnykh biolohichnykh preparativ. Epizootolohiia i profilaktyka infektsiinykh khvorob velykoi rohatoi khudoby: Mizhnarodna nauk.-prakt. konf.: Tezy dopovidei. K.: NAU, 25 (in Ukrainian).
Kovalenko, V.L., & Nedosiekov, V.V. (2011). Kontseptsiia rozrobky ta vykorystannia kompleksnykh dezinfektantiv dlia veterynarnoi medytsyny: Monohrafiia_(in Ukrainian).
Kurtyak, B.M., Romanovych, M.S., Pundyak, T.O., Romanovych, M.M., Romanovych, L.V., & Sobko, G.V. (2017). Ecological features of episotic processes. Scientific Messenger LNUVMB, 19(78), 108-111. doi:10.15421/nvlvet7822.
Kysera, Ya.V., Storchak, Yu.G., & Gutyj, B.V. (2018). Experimental study of immunoprophylactic anti-pneumococcal medicine and its immunogenic properties. Ukrainian Journal of Ecology. 8(1), 307-316. doi: 10.15421/2018_216.
Levkivska, N., Gutyj, B., & Levkivskyj, D. (2016). Comparative effectiveness therapeutic and prophylactic preparations when applying 3% of ethanol-water emulsion of propolis and antibiotics for catarrhal pneumonia in calves. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj. 18, 2(66), 116-121. doi: 10.15421/nvlvet66024.
Lorian, V. (1996). Antibiotics in laboratory medicine. Baltimore: Williams and Wilkins.
Vasilyeva, T.B. (2016). The monitoring of epizootic situation of colibacteriosis in Ukraine during 2004 -2015. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 2(66), 30-34 doi:10.15421/nvlvet6607.
Weidemann, B. (1998). Evaluation of data from susceptibility testing. International journal of antimicribial agents. 10, 218-219.
