CC BY
28
BicHUK ,fl,mnponeTpoBCBKoro ymBepcmery. Bionoria, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2016. 24(1), 234-239.
doi:10.15421/011629
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
www.ecology.dp.ua
УДК 578.81+578.85/.86
Спектр BipyciB, видтених i3 рослин Pulsatillapratensis (Ranunculaceae)
природноУ флори Украши
О.А. Шидловська1, О.М. Андрiйчук2, Т.А. Компанець2
Институт мжробюлогп та вiрусологu шет Д.К. Заболотного НАН Украти, Ктв, Украта 2Кшвсъкий нацюналъний ушверситет iMemi Тараса Шевченка, Кшв, Украта
Робота присвячена скриншгу BipyciB на рослинах природно! флори Украши. Дослщжено червонокнижну рослину Pulsatilla pratensis (L.) Mill. 1з рослин P. pratensis, вщбраних на територи Канiвcького природного заповщника, видiлено шфекцит вipycо-подiбнi частинки дiаметpом 34, 36, 43, 47, 50 та 57 нм, якг мали piзне коло pоcлин-iндикатоpiв. Вipiони pозмipом 34-43 нм викли-кали некротичну та хлоротичну плямиcтicть на Chenopodium amaranticolor Coste and Reyn., а 47-57 нм - некрози, хлорози та де-формац1ю листкових пластинок на Cucumis sativus L. За допомогою рослин-шдикатс^ визначали iнфекдiйнy природу збудника, коло хазягв, вiдокpемили вipyc i3 cyмiшi змiшаних вipycних iнфекцiq, визначали концентрацто вipyciв у рослинах, а також встано-влювали видову приналежтсть патогену. На pоcлинах-iндикатоpах cпоcтеpiгали симптоми, хаpактеpнi для вipycноi iнфекцii: по-бypiння листково! пластинки, кpапчаcтicть, хлорози та некрози. Bci симптоми були системними та, ймовipно, викликаними разними вipycами. Нажаль, видiленi вipycи в pоcлинах-iндикатоpах накопичувалися у незначних концентpацiях i швидко втрачали шфекцштстъ, через що ми не мали змоги остаточно !х iдентифiкyвати та детально охарактеризувати. Припускаемо, що ц частки можуть належати бактеpiофаговi, а симптоми на рослинах Ch. amaranticolor викликав iншiй вipyc. Для пеpевipки цього припу-щення у подальших доcлiдженнях зосередилися на одночасному видшент вipyciв рослин i бактеpiофагiв. 1з кореневищ P. pratensis i навколокореневого Грунту видiлено чотири iзоляти бактерюфапв iз довгими хвостовими вiдpоcтками, piзних за pозмipами. Охарактеризовано бюлопчну (лiтичнy) активнicть стосовно iндикатоpних бактерш, моpфологiю негативних колонiй та биковий склад бактеpiофагiв. За результатами дослщження, фаги pоздiлили на три тдгрупи, що iмовipно вiдповiдають трьом piзним видам вipy-ciв. Результати аналiзy полiпептидного складу можуть вiдобpажати певний еволюцйний процес у популяци фапв, що мали cпiлъ-ного предка. Поpiвняння бiлкiв фагiв piзних хазя!в показуе piзноманiття молекулярних мас !х полiпептидiв, до складу яких входить декшька деcяткiв бiлкiв. Отpиманi результати закладають основу для вивчення розповсюдження окремих вipyciв у пpиpодi, визна-чення !х взаемозв'язкiв у бюценозах.
Ключоа слова: вipycи рослин; бактерюфаги; електронна мiкpоcкопiя
The spectrum of viruses isolated from Pulsatilla pratensis (Ranunculaceae)
a native plant of Ukraine
О.А. Shydlovska1, E.N. Andriychuk2, T.A. Kompanets2
'Danylo Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine 2Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, Ukraine
The article is devoted to virus screening of wild plants of Ukraine's flora. The object of the research is the Red Book plant Pulsatilla pratensis (L.) Mill., which grows on the territory of Kanev Nature Reserve. Isolated isometric infectious virus-like particles with diameters of 34, 36, 43, 47, 50 and 57 nm were isolated from selected plants of P. pratensis. In our research, determination of the infectious nature of the pathogen, host range, concentration of viruses in plants, species identity and virus isolation from the mixture in mixed viral infections were carried with using indicator plants. The typical viral symptoms were observed on indicator plants: browning of the leaf plate, mottling,
1нститут м^обюлогп i вiрусологiï iMeHi Д.К. Заболотного НАН Украши, вул. Академжа Заболотного, 154, Кшв, 03680, Укра1на Danylo Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of NAS of Ukraine, Acad. Zabolotny Str., 154, Kyiv, 03680, Ukraine
Кшвський нацюналший утверхситет iMeHi Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 64/13, Kuïe, 01601, Украïна Taras Shevchenko National University of Kyiv, Volodymyrska Str., 64/13, Kyiv, 01601, Ukraine Tel.: +38-067-504-55-49. E-mail: [email protected]; [email protected]
chlorosis and necrosis. All symptoms were systemic and could be caused by a variety of virase species. Virions with sizes from 34 to 43 nm produced the necrotic and chlorotic spotting on Chenopodium amaranticolor Coste and Reyn. On the other hand, virions with sizes from 47 to 57 nm produced the necrosis, chlorosis and deformation of the leaf plates on Cucumis sativus L. That is not typical for viruses previously discovered on P. pratensis. The viruses isolated in these plants viruses were cumulated in small concentrations and rapidly lost their infectivity. The number of isolated viruses was insufficient for their identification. Four bacteriophage isolates with long phage tails of different size were isolated from P. pratensis roots and radical soil. The biological (lytic) activity towards the tracer bacteria, the morphology of negative colonies, and bacteriophage protein structure were characterized. According to our research, it is possible to divide phages into three subgroups that probably correspond to three different types of viruses. Results of the polypeptide analysis may reflect an evolutionary process in a population of phages that had a common ancestor. Comparison of phage proteins of different hosts shows a variety of molecular weights of polypeptides comprising up to several dozens of proteins. The results of the current work lay the basis for studying the spread of viruses in nature and determination of their relationships in biocenoses.
Keywords: plant viruses; bacteriophages; electron microscopy Вступ
Одним i3 щдходав до виявлення BipyciB рослин природно! флори може бути тотальне видшення Bcix Bipyco-подабних частинок i3 наступною !х пеpевipкoю на фгто-патогеншсть. Адже за скриншгового видшення вipyciв рослин також можна виявити бактерюфаги, яш населя-ють ризосферу рослин. Особливють пoдiбнoгo дослвд-ження - те, що не завжди видшеш вipycи викликають симптоми захворювання на даних рослинах, так само, як i бактери не завжди стають причиною розвитку фгто-патологи. Тому необхщне вивчення взаемозв'язку мгж рослинами, вipycами рослин та вipycами бактеpiй.
Оcтаннiм часом усе бшьше уваги придшясться вив-ченню вида рослин, занесених до Червоно! книги Укра-!ни. Бiльшicть iз цих вид1в, на жаль, не можуть щдтри-мувати чиcельнicть сво!х популяцш на постшному piвнi у природнш флopi. 1х чиcельнicть i ареал постшно змен-шуються. Цьому сприяе безлiч фактор1в, зокрема, людський вплив (оскшьки значна частина видiв рослин мае декоративне, екoнoмiчне, лiкаpcьке чи грунтозахис-не значення), змiни ктмату, piзнoманiтнi забруднення атмосфери, гщросфери та датосфери, вплив iнфекцiйниx агенпв ^руав, бактеpiй та гpибiв).
До Червоно! книги Укра!ни занесено Pulsatilla pratensis (L.) Mill. (сон лучний) (Diduh, 2009). P. pratensis -лшарська, декоративна та отруйна рослина (Martonfiova, 2004). Здавна рослини роду Pulsatilla використовували у схщнш медицин для лжування ентерипв, а також як протипухлинт та cпазмoлiтичнi засоби (Szentpeteri et al., 2007; Danova et al., 2009). Сон лучний володае антивipyc-ною активнicтю проти деяких патогенних вipyciв люди-ни, зокрема, вipycy грипу типу А, рестраторно-синцип-ального вipycy, вipycy герпесу першого типу, людського pинoвipycy та шших (Glatthaar-Saalmuller and FallierBecker, 2001).
Одним iз пiдxoдiв до виявлення вipyciв рослин природно! флори може бути тотальне видшення вах вipyco-пoдiбниx частинок iз наступною !х iдентифiкацiею. Mut-hukumar et al. (2009) дослщили тотальну РНК iз вipyco-пoдiбниx частинок, видшених iз гoмoгенiзатy рослин природно! флори. У xoдi аналiзy вони встановили посль довносп, що належать не лише вipycам рослин, а i вipycам бактеpiй, безхребетних тварин, i навiть вipycам людини та хребетних тварин. KpiH того, видшено посль довносп, що належать баталиям i грибам. Загалом, за результатами такого тотального сиквенсу встановлено, що вipycнi пocлiдoвнocтi складають лише 9% загально! !х кiлькocтi, тoдi як багае^альш - 29%, i тшьки на
другому мiсцi рослиннi послвдовносп - 20%. Вщсоток посл1довностей тваринного походження та ретроеле-мент1в - по 5% кожний, найменше виявлено посл1довно-стей грибкового походження (2%). Для 29% дослщ-жених послщовностей досговiрно встановити належ-н1сть до будь-яко! з перерахованих категорiй не вдалося. Також iснуe 1% послвдовносгей, що мають еукарiотичне походження, але в1дм1нн1 в1д рослинних, тваринних або грибних. Цдкавий факт, що далеко не в ус1х рослин, i3 гомогенату яких вид1лено послiдовностi вiрусiв рослин, виявлено симптоми захворювань, подiбних до вiрусних (Muthukumar et al., 2009).
Значення вiрусних частинок полягае не лише у вели-чезнш !х к1лькост1, а й у досить значному !х видовому рiзноманiттi (Sandra Chibani-Chennoufi et al., 2004). По-ряд i3 великим рiзноманiттям фiтовiрусiв у природi, фаги - найчисельн^ бiологiчнi об'екти на Земл^ чи-сельнiсть яких сягае 1031 частинок (Wommack and Col-well, 2000). ТакГ !х присутнiсть у навколишньому сере-довищi обумовлюе необхщшсть змiни ставлення до вивчення процеав в екосистемах (Weinbauer and Ras-soulzadegan, 2004). Дослiдження властивостей фапв рiзних хазя!в, присутнiх одночасно у природа, дозволяе поршнювати !х мiж собою, всерединi певних груп i мiж ними. Дослiдження фаг^в рiзних родiв бакгерiй та фiто-вiрусiв, якi одночасно циркулюють у рослинних бюце-нозах, практично не проводилося. Виявлення властивостей фагiв дикого типу та вiрусiв рослин - необхщний етап вивчення процесiв з !х участю у зовнiшньому середовищi (Jones еt al., 2007).
Мета ще! статгi - виявити вiрусоподiбнi частинки з рослин P. pratensis природно! флори Укра!ни для !х наступно! iдентифiкацi! та характеристики.
MaTepia™ i методи досл1джень
Об'екти дослвджень - рослини P. pratensis, ввдбраш на територй' Канiвського природного заповщника. Рослини вiдбирали за наявшстю симпгомiв, подiбних до вiрусних, двiчi в одних i тих самих точках з штервалом один рш. Вiдiбрано чотири зразки у 2014 рощ, прону-мерованi 14-1, 14-2, 14-3, 14-4, та п'ять зразюв у 2015 роцi, пронумерованi 15-1, 15-2, 15-3, 15-4 та 15-5.
Для бютестування використовували рослини-щдика-тори: Chenopodium amaranticolor Coste and Reyn. (лобо-да рiзнокольорова), Datura stramonium L. (дурман зви-чайний), Cucumis melo L. (диня звичайна), C. sativus L. (опрок посiвний) та Brassica rapa L. subsp. pekinensis (капуста пешнська).
y gocgig^eHHi BUKopncragH KygbTypn ^iTonaroreH-hhx 6aKTeprn, oTpHMaHi 3 KogeKqii' My3eK> iHCTHryTy MiKpo6iogorii Ta Bipycogorii iM. ,3,.K 3a6ogoTHoro HAH yKpai'HH (Biggig ^iTonaroreHHHx 6aKrepm).
KoH^HTpaqiK) Ta ohh^hhh BipycHHx npenapaTiB npo-Bogngn 3a craHgapTHHMH MerogHKaMH MeTogoM gn^epeH-^agbHoro ^HrpH^yryBaHHH. Mop^ogoriro BipioHiB BHBna-gn MeiogoM ipaHCMiciHHoi egeKTpoHHoi MiKpocKonii' 3a gonoMororo e^eKipoHHoro MiKpocKona JEOL-1400 (3no-Hia) 3a iHcrpyMemagbHoro 36igbmeHHa 40 000 Ta 60 000. npenapaTH KompaciyBam 2% BogHHM po3hhhom ypamg-aцeтaтy (Budzanivska, 2009).
,3gH Bnpo^yBaHHH 6aKreprn Ta THTpyBaHHa $ariB bhko-pncToByBa^H roToBi KoMep^nm araprooBarn ^HBHgbHi cepegoBH^a Ha ocHoBi pn6Horo rigpogi3aTy (bhpo6hhk -O6ogeHcbK, rPM-arap, rPM-6ygböoH). KoH^mpyBaHHa Ta ohh^hhh $ariB npoBogugn MerogaMH BncoKomBHgKic-Horo ^rnpH^yryBaHHH y rpagiemi rycTHHH CsCl.
,3gH BngigeHHa 6aKrepio$ariB BHKopncraHo 3pa3KH poc-gnH P. pratensis i3 CHMnroMaMH 6aKTepiagbHoro ypa^eHHa (n^HMHCTicTb, HeKpo3H, rHngi, 3iB'aHeHHa Ta no^oBTiHHa gHcra) Ta npnKopeHeBHH ipyHr. ®arn Bugigagn mgaxoM npaMoro BHciBy. Trapn BH3HanagH y 6gamKoTBipHnx ognHH^x Ha Mg (EyO/Mg) MeTogoM gBomapoBoro arapy 3a Гpaцia (Adams, 1961).
^Hcri grnii 6aKTepio$ariB oTpnMyBagn mgaxoM mecra-pa3oBoro nacHByBaHHa 3 HacTynHHM BHKogroBaHHHM oKpe-mhx HeraTHBHHx Kogomn. OrpHMaHi i3ogarn $ariB BHKopn-CToByBagn Hagagi gga HaKonrneHHa ix y npenapaTHBHnx KoH^mpaqiHx i o6'eMax.
EgeKTpo^opeTHHHe gocgig^eHHa noginenTngHoro CKgagy 6igKiB $ariB npoBogngn MeTogoM .HeMMgi 3 bhko-pncTaHHaM 14% po3gigbHoro Ta 5% KoH^mpyBagbHoro nogiaKpngaMigHoro regro 3 nogagbmnM 3a6apBgeHHHM Ky-Maci 6gaKHTHHM (Laemmli, 1970). O6giK pe3ygbTariB egeK-Tpo$ope3y npoBogngn 3a gonoMororo nporpaMH TotalLab TL120 (Nonlinear Dynamics) (Peakall and Smouse, 2006).
Po3paxoByBagn cepegHi 3HaneHHa (m) Ta CTaHgapTHe BigxngeHHa (SD) ko^hoi xapaKTepncTHKH.
Pe3ymTara Ta ix oßroBopeHHH
iH^eKqiÖHicTb naToreHiB mgTBepg^yBagn MeTogoM 6ioTecTyBaHHa. OcKigbKH xapaKTep peaKqii pocgnHH 3age®HTb Big ii reHeranHoi npnpogn Ta Tnny iH^eKqü', aKa BHocHTbca, y HamoMy gocgig^eHHi hk pocgHHH-iHgnKa-Topn BHKopncTaHo Bngn, aKi pearyroTb Ha onncaHi paHime 3 P. pratensis Bipycn. nepm, Hm rnoKygroBara pocgnHH-iHgHKaTopn cokom Bigi6paHnx 3pa3KiB, npoBegn nepBHHHHH CKpnHiHr ocTaHHix MerogoM egeKTpoHHoi MiKpocKonii. y nogagbmoMy BHKopncroByBagH gnme Ti 3pa3KH, b hkhx BHHBHgn Bipyconogi6Hi nacTHHKH. y xogi gocgig^eHHa CHMnToMH 3'HBHgnca gnme Ha Ch. amaranticolor, iHoKy-gboBaHnx cokom 3i 3pa3KiB 2014 poKy Ta C. sativus, iHoKy-gboBaHnx cokom 3i 3pa3KiB 2015 poKy. Ha pocgnHax, ypa^eHnx cokom 3i 3pa3KiB 14-1 Ta 14-2, cnocrepiragn nogi6Hi cHMnToMH no6ypiHHa gHcTKoBoi ngacTHHKH, xgopo3H Ta HeKpo3H, ^o Bigpi3HagHca gnme cTyneHeM npoaBy. PocgnHH, ypa^em cokom 3i 3pa3Ka 14-3, pearyBagn KpamaCTicrro, xgopo3aMH Ta HeKpo3aMH, a 3i 3pa3Ka 14-4 -gnme cga6Koro KparnacriCTro. naToreHH, BngigeHi y
2015 рощ, не викликали жодних симптом1в на Ch. amaranticolor, незважаючи на те, що точки в1дбору та ознаки ураження P. pratensis збталися. На шокуляцтю соком вдабраних у 2015 роц1 зразюв, рослини C. sativus реагували переважно некротичною реакцieю. Зокрема, 1нфекц1йн1 агенти 3i зразка 15-1 викликали утворення др1бних некрозiв, зi зразка 15-2 - хлоротичну та некро-тичну реакц1ю, 15-3 - слабке пожовтшня та некрози, 15-4 - пожовтшня по краю та деформаци листково1 пластинки, 15-5 - мозашу, некрози та всихання листково1 пластинки. Bei симптоми на рослинах-iндикаторах були системними та не могли бути викликат вiрусами Cherry leaf roll virus, Arabis mosaic virus, Strawberry latent ringspot virus або Scrophularia mottle virus (King et al., 2011). Проте розмри видшених патогенш значно перевищува-ли розмри перелчених вiрусiв (рис. 1, 2).
Уа видiленi частинки були iзометричними, проте вiдрiзнялися розмiрами. У зразках 14-1-14-3 дiаметр частинок становив 57 ± 1, 47 ± 1 та 50 ± 2 нм. Потрiбно зазначити, що вiрiони зi зразка 14-1, iмовiрно, мали складну будову. У зразку 14-4 виявлено вiрусоподiбну частинку iкосаедричноï симетрй', розмiром 107 ± 3 нм, що не характерно для фп^руав.
Розмiри частинок, видiлених у 2015 рощ такт у зразку 15-1 - 36 ± 1 нм, у 15-2 - 55 ± 2, у 15-3 - 43 ± 2 та 34 ± 1, у 15-4 - 43 ± 2, у 15-5 - 34 ± 1 нм. Незважаючи на подiбнiсть розмiрiв частинок у зразках 15-3, 15-4 та 15-5, iмовiрно, даш вiруси не 1дентичш. Адже ï\ симптоми на C. sativus вiдрiзнялися. На жаль, видшет вiруси в рос-линах-1ндикаторах накопичувалися у незначних концен-трацiях i швидко втрачали iнфекцiйнiсть, через що ми не мали змоги остаточно & iдентифiкувати та детально охарактеризувати.
Таким чином, у зразках P. pratensis прироgноï' флори Украши виявлено iзометричнi вiрусоподiбнi частинки рiзного дiаметра (34-57 нм). У вigiбраних у 2014 рощ зразках виявлено не характерт для вiрусiв рослин частинки, iкосаедричноï' симетрiï' дiаметром 107 нм (рис. 1). Ми припускаемо, що щ частинки можуть належати бак-терiофаговi, а симптоми на рослинах Ch. amaranticolor викликав iншiй вiрус, концентрация якого була незнач-ною, нижче порога чутливостi електронноï' мшроскопп. Для перевiрки цього припущення у подальших дослig-женнях зосередилися на одночасному видiленнi вiрусiв рослин i бактерюфапв.
Бактерiофаги поширенi в уж екосистемах, де е бактерiï (Vos et al., 2009). Еволюцшний пigхig дозволяе розглядати ï^ за впливу природного середовища, де важ-ливi як титр фаг^в в екосистем^ так i щiльнiсть бакте-рiальноï популяцiï та фiзiологiчний стан мшрооргашз-м1в. Дослigження взаемодiï у системi популяцiй бакте-рiофагiв i бактерш в умовах природного середовища дае можливють дослigити динамiку процесу взаемоди та розвитку популяц1й, а також ï\ зв'язок iз факторами нав-колишнього середовища (Clokie et al., 2011).
Для видшення бактерiофагiв використовували рослини, змиви з навколокореневого грунту та кореневищ Р. pratensis. Спектр лггично1 активност1 та титри виgiле-них фаг1в визначали методом накапування на агар (от-римання зон лiзису). Всього виявлено п'ять iзолятiв фаг^в (табл.).
14-1
Рис. 1. Електронограма в1русопод1бних частинок 31 зразкв 14-1 - 14-4
Рис. 2. Електронограма в1русопод1бних частинок 31 зразкв 15-1 - 15-5
У результата експерименту визначено чyтливi бакте-pi! для вcix зразк1в (S. marcescens), а також для зразюв 1 та 5 (P. fluorescens). Фаги зi зразк1в на культурах бакте-piй накопичуються до таких титрв: зразок 1 на кyльтypi S. marcescens - 106 БУО, на кyльтypi P. fluorescens -106 БУО; зразок 2 на кyльтypi S. marcescens - 107 БУО; зразок 3 на кyльтypi S. marcescens - 107 БУО; зразок 4 на кyльтypi S. marcescens - 109 БУО; зразок 5 на кулыуи S. marcescens - 1011 БУО, на культур P. fluorescens -1011 БУО. Встановлено морфологтю негативних колонш. На кyльтypi S. marcescens yci фаги формували дуже дpiбнi бляшки з чтткими краями, на P. fluorescens бактерюфаги зi зpазкiв 1 i 5 - дpiбнi бляшки з нечеткими краями.
Далi дослвджували морфолопю вipioнiв вipyciв бак-теpiй за допомогою методу електронно! мiкpocкoпii (King et al., 2011). Серед iзoлятiв переважали фаги з косаед-ричною гсшвкою та довгим хвостовим ввдростком. Диаметр гoлiвки та довжина хвостового вщростка варшвали (рис. 3). Найбшьшими були вipioни з готвкою дiаметpoм 97 ± 2 нм i хвостовим вщростком довжиною 157 ± 3 нм (зразок 2). Близькими за poзмipами виявилися вipioни фагтв зi зpазкiв 3 та 4, даметр гсшвки та довжина хвостового вщростка яких становили 84 ± 3 i 87 ± 2 нм та 83 ± 1 i 91 ± 1 нм, ввдповвдно. У зразку 5 виявлено вipioни двох тиЩв: (1) iз дiаметpoм гсшвки 94 ± 2 i довжиною хвостового ввдростка 206 ± 4 нм та (2) iз довжиною хвостового вщростка 117 ± 1 i дiаметpoм гoлiвки 63 ± 4 нм.
Таблиця
Л1тична активность фаг1в до шдикаторних бактерий
Индикаторы бактери Зразок 1 Зразок 2 Зразок 3 Зразок 4 Зразок 5
Pseudomonas syringae pv. tabaci - - - - -
P. syringae pv. aptata - - - - -
P. syringae pv. lachrymans - - - - -
P. syringae pv. atrofaciens - - - - -
P. syringae pv. syringae - - - - -
P. savastanoi pv. phaseolicola - - - - -
P. viridiflava - - - - -
P. clororophis - - - - -
P. alliicola - - - - -
P. fluorescens + - - - +
Xanthomonas axonopodis pv. beticola - - - - -
Paenibacillus polymyxa - - - - -
Erwinia carotovora - - - - -
E. carotovora subsp. atroseptica - - - - -
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum - - - - -
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus - - - - -
Serratia marcescens L-2 + + + + +
Прим1тки: «-» - вiдсутнiсть, «+» - наявшсть зон лiзису.
Рис. 3. Електронограма бактерюфаг1в 3i зразкв 2-5
Щд час дослвдження зразшв за допомогою ЕМ видь лено чотири морфотипи бактерюфапв, як1 р1знилися за розм1рами. У подальшому використано лише чогири зразки (1, 3, 4 та 5). Для пор1вняння б1лкового складу отриманих i очищених 1золяг1в фапв проведено електро-форез бшюв, результати якого наведено на рисунку 4.
-
Рис. 4. Електрофореграма бтшв бактерюфаг1в
i3 вГибраних зразшв: цифрами позначено номери зразюв; М - маркери 66, 45, 36, 24 та 14,2 кДа
Визначення бiлкового складу вiрiонiв дало можли-вiсть установити 1х специфiчm особливостг Бактерю-фаги зi зразюв рiзнилися сво!м бiлковим складом. 1золя-ти зi зразк1в 3 та 4 мали подiбний бiлковий склад. Iншi зразки вiдрiзнялися як вщ попереднix, так i мгж собою. У зразках 3 та 4 виявлено 19 бшюв, у зразку 5 - 25 бш-к1в, у зразку 1 - 4 бшки. Припускаемо, що вплив на фапв
могли мати першi пасаж1 на певних бактер1ях-хазяях. Як видно з наведено! на рисунку 4 електрофореграми, за бiлковим складом фаги утворювали три умовнi шд-групи, вщповщно до штаму, на якому вони видiленi (першу групу утворили зразки 3 та 4). Значт вiдмiнностi спостер1гали у 1- та 5-му зразках (в основному за складом мшорних полшептцщв). Рiзноманiття структурних бiлкiв характерне для вiрусiв мiкроорганiзмiв, до складу яких може входити до дек1лькох десятшв бiлкiв. Таке рiзноманiття характерне, в першу чергу, для таких складнооргашзованих фагiв, як Т-парнi (Kruger and Bickle, 1983). У той же час для вiрусiв рослин, навпаки, част1ше за все характерна наявшсть единого структурного бiлка. Електрофорез бiлкiв досл1джуваних фаг1в показав 1х неоднорiднiсть.
Таким чином, рiзнi iзоляти фаг^в, видiленi на однiй фггопатогеннш бактерй', мають подiбний бiлковий склад за кшькютю бiлкiв та 1х молекулярною масою.
Висмовки
Проведено скритнг вiрусiв на рослинах P. pratensis природно! флори Укра!ни. Встановлено наявшсть змь шано! iнфекцil у рослин, зумовлено! вiрусними та бакте-рiальними патогенами. Описано морфолог1ю вiрусiв рослин i бактерiофагiв, видiлениx зi зразюв P. pratensis iз патолог1ями вiрусноl та бактерiальноl ет1ологй'.
Видiленi вiруси рослин iдентифiкувати та детально охарактеризувати не вдалося, оск1льки iснуючi тест-системи розроблялися до вiрусiв культурних рослин. Важко оц1нити все рiзноманiття вiрусiв певного виду рослин, адже вiруси, як1 циркулюють у природнш флорi, залишаються практично недосл1дженими.
З огляду на це, вважаемо доцшьним проводити ком-плексне вивчення вiрусiв рослин та вiрусiв бактерiй. Проведене таким чином дослвдження може мати ваго-мий вплив на подальший розвиток вiрусологiчноl науки, стати поштовхом до розширення нашого уявлення про всесвiт вiрусiв.
Ei6.iorpa$iHrn iiocii. lamm
Adams, M., 1961. Bakteriofagi [Bacteriophage]. Medgiz, Moscow (in Russian).
Budzanivska, I.H., 2009. Diahnostyka virusnykh infektsii [Diagnosis of viral infections]. Ukrainskyi Fitosotsiolohichnyi Tsentr, Kyiv (in Ukrainian).
Clokie, M.R.J., Millard, A.D., Letarov, A.V., Heaphy, S., 2011. Phages in nature. Bacteriophage 1, 31-45.
Danova, K., Bertoli, A., Pistelli, L., Dimitrov, D., Pistelli, L., 2009. In vitro culture of Balkan endemic and rare Pulsatilla species for conservational purposes and secondary metabolites production. Botanica Serbica 33(2), 157-162.
Diduh, Y.P., 2009. Chervona knyga Ukrajiny. Roslynnyi svit [Red Book of Ukraine. Flora]. Globalkonsalting, Kyiv (in Ukrainian).
Glatthaar-Saalmuller, B., Fallier-Becker, P., 2001. Antiviral action of Euphorbium compositum and its components. Forsch Komplementarmed Klass Naturheilkd 8(4), 207-212.
Jones, J.B., Jackson, L.E., Balogh, B., 2007. Bacteriophages for plant disease control. Annu. Rev. Phytopathol. 45, 245-262.
King, A.M.Q., Adams, M.J., Carstens, E.B., Lefkowitz, E.J. (Eds.), 2011. Virus taxonomy. Classification and nomenclature of viruses. Ninth report of International Committee on the Taxonomy of viruses. Academic Press, San Diego.
Kruger, D.H., Bickle, T.A., 1983. Bacteriophage survival: Multiple mechanisms for svoiding the deoxiribonucleic acid restribution system of their hosts. Microbiol. Rev. 47(3), 345-360.
Laemmli, U., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 5259, 680-685.
Martonfiova, L., 2004. Karyotype studies in Pulsatilla zimmer-mannii. Biologia Bratislava 59(1), 61-64.
Muthukumar, V., Melcher, U., Pierce, M., Wiley, G.B., Roe, B.A., Palmer, M.W., Thapa, V., Ali, A., Ding, T., 2009. Non-cultivated plants of the Tallgrass Prairie Preserve of northeastern Oklahoma frequently contain virus-like sequences in particulate fractions. Virus Res. 141, 169-173.
Peakall, R., Smouse, P., 2006. GENALEX 6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Mol. Ecol. Notes. 6, 288-295.
Chibani-Chennoufi, S., Bruttin, A., Dillmann, M.-L., Brussow, H., 2004. Phage-host interaction. Ecological Perspective Journal of Bacteriology 186(12), 3677-3686.
Szentpeteri, J.L., Szego, B., Szente, S., 2007. Biogeographical studies and taxonomic review of Pulsatilla pratensis var. flavescens. Acta Bot. Hung. 49, 163-178.
Vos, M., Birkett, P.J., Birch, E., Griffiths, R.I., Buckling, A., 2009. Local adaptation of bacteriophages to their bacterial hosts in soil. Science 325, 833.
Weinbauer, M., Rassoulzadegan, F., 2004. Are viruses driving microbial diversification and diversity? Environ. Microbiol. 6(1), 1-11.
Wommack, K.E., Colwell, R.R., 2000. Virioplankton: Viruses in aquatic ecosystems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 69-114.
Hadiumna do редкonегii 21.03.2016
