CC BY
8
УДК 576.342, 576.315.2, 577.214.4, 577.352.464, 615.277, 615.849.2, 616-097
Доставка биологически активных веществ в ядра клеток-мишеней для целей трансляционной медицины
А. С. Соболев1,2*
'Институт биологии гена РАН, Москва, 119334 Россия
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119234 Россия
*E-mail: alsobolev@yandex.ru
Поступила в редакцию 09.06.2020
Принята к печати 25.09.2020
DOI: 10.32607/actanaturae.11049
РЕФЕРАТ Создание средств внутриклеточной доставки биологически активных веществ с использованием естественных процессов внутриклеточного транспорта имеет значительные перспективы в области трансляционной медицины. В обзоре обобщены результаты работ лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта ИБГ РАН, позволивших создать модульные нанотранспортеры - базовую технологию, которая за счет доставки в наиболее чувствительный клеточный компартмент клеток-мишеней обеспечивает высокую эффективность и клеточную специфичность целому ряду противоопухолевых агентов и позволяет антителомиметикам проникать в нужный компартмент клеток-мишеней («ныряющие антитела»). Кроме того, разработаны и охарактеризованы комплексы поликатионных блок-сополимеров с ДНК (полиплексы), эффективные in vitro и in vivo и способные к преимущественной трансфекции активно делящихся клеток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА модульные нанотранспортеры, полиплексы, доставка лекарств, антителомиметики, ге-нотерапия, фотодинамическая терапия, радиотерапия.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АЧ - альфа-частицы; МНТ - модульные нанотранспортеры; MHTEGF - МНТ с EGF в качестве лигандного модуля; MHTF - МНТ с FA в качестве лигандного модуля; MHTMSH - МНТ с aMSH в качестве лигандного модуля; ПЭГ - полиэтиленгликоль; ПЭИ - полиэтиленимин; ФС - фотосенсибилизатор; ЭО - электроны Оже; ARE - элемент антиокислительного ответа; aMSH - a-меланоцитстимулирующий гормон; DTox - фрагмент транслокационного домена дифтерийного токсина; EC50 - концентрация полумаксимального эффекта; EGF - эпидермальный фактор роста; EGFR - рецептор EGF; FA - фолиевая кислота; HMP - гемоглобиноподобный белок E. coli; Kd - константа диссоциации; NLS - аминокислотная последовательность сигнала ядерной локализации; Nrf2 - фактор транскрипции, регулирующий, в частности, экспрессию генов антиокислительного ответа.
ВВЕДЕНИЕ
Ядро клетки, где находится основная программа ее функционирования, естественным образом служит мишенью для многих биологически активных веществ. Их можно подразделить на две большие группы [1]. К первой можно отнести агенты (например, цитотоксические), которые хотя и способны производить свое повреждающее действие, находясь в любом месте клетки, однако ядро является для них наиболее чувствительным компартментом. Иначе говоря, если эти вещества локализованы в ядре, то -по сравнению с другими локализациями - для проявления такого же эффекта требуется минимальная их концентрация. Вторую группу составляют вещества, проявляющие свое действие именно тогда, когда они оказываются в клеточном ядре, как, напри-
мер, ДНК. В настоящем обзоре будут рассмотрены обе эти группы.
Фотосенсибилизаторы (ФС) и радионуклиды, испускающие частицы с коротким пробегом, такие, как эмиттеры альфа-частиц (АЧ) или эмиттеры электронов Оже (ЭО), могут служить примерами веществ первой группы. И те и другие являются ци-тотоксическими агентами, широко используемыми в медицинской практике для лечения онкологических заболеваний, но не только их. К цитотоксиче-скому началу ФС - активным формам кислорода (т.е. к синглетному кислороду, гидроксильному радикалу и ряду других свободных радикалов) - чрезвычайно чувствительно клеточное ядро [2]. Что касается эмиттеров АЧ и ЭО, то уже более полувека известно, что именно клеточное ядро является наиболее чув-
А
Г Рецептор-опосредованный эндоцитоз
Связывание
МНТ МНТ
Рецептор-мишень
Эндосома
мрем
а/Р-импортины
^ ст-ч Ядерная Ядро
пора
Транспорт в ядро клетки
Выход МНТ из эндосомы
а/Р-импортины
Эндоцитоз
Я
Эндосома
Выход транспортера из »ч
эндосомы
и+
Эндосома
Ядерный транспорт
Функции модулей
чСЧ \\
Ядро
Схема транспорта МНТ в ядро
Схема строения модульного нанотранспортера
Рис. 1. Схема строения модульных нанотранспортеров (А) и их транспорта в клеточное ядро (Б) (по [15])
ствительным к ним клеточным компартментом [3]. При этом как ФС, так и эмиттеры АЧ/ЭО не только не обладают тропностью в отношении клеточного ядра, но и не имеют клеточной специфичности.
Не вызывает сомнений и необходимость доставки ДНК в клеточное ядро, если возникает потребность в ее экспрессии. К этой же, второй, группе биологически активных веществ следует отнести те регуляторные полипептиды, эффект которых проявляется при взаимодействии с макромолекулами клеточного ядра.
Таким образом, в целях трансляционной медицины биологически активные агенты необходимо доставить в ядра клеток-мишеней, чтобы их свойства могли проявиться, поскольку подавляющее большинство этих агентов не способны сами проделать этот путь.
Основная стратегия доставки макромолекул или иных биологически активных веществ (для краткости именуемых дальше «грузы») - использование естественных внутриклеточных транспортных процессов, таких, как, например, рецептор-опосредованный эндоцитоз или цитоплазменно-ядерный транспорт (они описаны в многочисленных книгах и обзорах, например, [4, 5]). Соответственно переносчик должен иметь необходимые для перемещения в желаемом направлении аминокислотные по-
следовательности или иные адресные молекулы и быть способным на пути к ядру преодолеть многочисленные барьеры как на пути к клетке-мишени [6], так и внутри нее.
МОДУЛЬНЫЕ НАНОТРАНСПОРТЕРЫ
Этим условиям соответствуют разрабатываемые в нашей лаборатории модульные нанотранспортеры (МНТ), которые можно рассматривать как технологическую платформу для доставки терапевтических агентов в заданный компартмент клеток-мишеней желаемого типа [1, 7-16]. В основу этой платформы положено: а) использование естественных процессов специфического молекулярного распознавания, а также б) уже упомянутых процессов транспорта внутрь и внутри клетки и в) принципа модульности, т.е. возможности менять транспортные или распознающие блоки/модули, чтобы адаптировать МНТ к нужному типу клеток-мишеней, клеточных компартментов, внутриклеточных мишеней и доставляемого «груза». В типичном варианте МНТ (рис. 1) в их состав входят лигандный модуль, эндо-сомолитический модуль, модуль транспорта в ядро клетки и модуль-носитель. Лигандный модуль обеспечивает взаимодействие с поверхностным интер-
Б
нализуемым клеточным рецептором и тем самым узнавание клетки-мишени и транспорт внутрь этой клетки путем рецептор-опосредуемого эндоцито-за. Эндосомолитический модуль выполняет функцию pH-зависимого порообразования в эндосомах, чем обеспечивает выход МНТ с доставляемым активным компонентом в цитозоль клетки-мишени из этих компартментов со слабокислым содержимым. Модуль транспорта в ядро клетки-мишени включает аминокислотную последовательность, представляющую собой сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), который специфически взаимодействует с комплексом импортинов в цитозо-ле и обеспечивает транспорт через ядерную пору. Модуль-носитель служит для объединения остальных модулей в единое целое и присоединения «груза». Помимо четырех перечисленных модулей в состав МНТ могут быть включены и другие модули, если нужно дополнительное взаимодействие с еще какими-то внутриклеточными и внеклеточными компонентами. К настоящему времени наиболее детально исследованы свойства in vitro и in vivo:
• МНТ с эпидермальным фактором роста (EGF) в качестве лигандного модуля (MHTEGF), обладающие специфичностью по отношению к клеткам1, сверхэк-спрессирующим рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) [9, 19, 20],
• МНТ с а-меланоцитстимулирующим гормоном в качестве лигандного модуля (МНТЫ8Н), специфичные к клеткам2 со сверхэкспрессией рецепторов ме-ланокортина первого типа [8, 12, 22],
• МНТ с фолиевой кислотой в качестве лигандного модуля (МНТр), нацеленные на клетки3 со сверхэкспрессией рецепторов фолата [23, 24].
Состав модулей этих МНТ:
MHTEGF: DTox-HMP-NLS-EGF; MHTMSH: DTox-HMP-NLS-aMSH; МНТ,: DTox-HMP-NLS-ror-FA,
где DTox - фрагмент транслокационного домена дифтерийного токсина (эндосомолитический модуль); НМР - гемоглобиноподобный белок E. coli (модуль-носитель); NLS - оптимизированная последовательность ядерной локализации большого ядерного Т-антигена вируса SV40 (модуль доставки в ядро); EGF, aMSH, FA - эпидермальный фактор роста, a-меланоцитстимулирующий гормон, фолиевая кислота соответственно (лигандные модули); ПЭГ - бифункциональный полиэтиленгликоль.
1 Примеры: клетки рака мочевого пузыря, рака головы и шеи, глио-бластомы, колоректального рака [17, 18].
2 Пример: клетки меланомы [21].
3 Примеры: клетки рака шейки матки, рака яичников [10].
Разработаны и разрабатываются другие варианты МНТ, которые будут рассмотрены в следующих разделах.
Когда в одну молекулу объединяются фрагменты других молекул, как при создании МНТ, то не очевидно, что свойства этих фрагментов сохранятся у создаваемой химерной молекулы: например, ее домены могут пространственно экранировать друг друга и препятствовать необходимому для функционирования химеры взаимодействию с клеточными белками; тем самым у создаваемой искусственной молекулы не будет желаемых свойств. Для проверки функциональности МНТ исследована как структура МНТ, так и способность их модулей осуществлять свои функции.
По данным динамического светорассеяния МНТМ8Н и МНТЮ1, имеют размеры 8.3 ± 0.6 и 10.6 ± 0.5 нм [19] соответственно.
Неоднократные попытки кристаллизовать МНТ с целью последующего изучения их структуры с высоким разрешением методом рентгеновской дифракции оказались безрезультатными. Однако применение методов малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, атомно-силовой и электронной микроскопии [25] позволило получить представление о структурах МНТ и МНТ . Один из важных выводов из этого
МЬМ Е^г
структурного исследования состоит в том, что эндо-сомолитический и лигандный модули хорошо пространственно разнесены, что исключает их взаимное экранирование и, тем самым, потерю своих функций.
Это заключение убедительно подтверждено тестами, проведенными для оценки функционирования модулей МНТ всех разработанных типов. Для экономии места ограничимся примерами. Так, константа диссоциации (Кй) комплексов МНТЕ&1, с EGFR составила 29 нМ, что близко к К комплексов EGF с EGFR ' d
[9], а для комплексов МНТМ8И с меланокортиновыми рецепторами - около 20 нМ [8]. Исследуемые МНТ обладали мембранолитической активностью в двух диапазонах рН: в интервале 5.5-6.5, который близок к рН эндосом и обусловлен DTox, и при рН от 3 до 4, обусловленный действием НМР [8, 9]. Поры в мембранах, создаваемые МНТ, охарактеризованы электрохимически и с помощью атомно-силовой микроскопии [7, 9, 22]. После добавления полноразмерных МНТМ8И (т.е. со всеми четырьмя модулями) к плоскому липидному бислою при рН 5.5 выявлено возникновение ионных каналов с проводимостью ~2-5 нСм, тогда как МНТМ8И без эндосомолитического модуля при рН 5.5 не образовывали ионных каналов. Не появлялись каналы и при действии полноразмерных МНТМ8И при нейтральных значениях рН 7.0, что доказывало проявление мембранной активности эн-досомолитического модуля именно при закислении
среды. Спустя 5-15 мин после закисления среды до рН 5.5 МНТЮ1, образовывали в липидном бислое кольцевые структуры диаметром 30-50 нм, что выявлено с помощью атомно-силовой микроскопии. По прошествии 40-60 мин в липидном бислое можно было обнаружить флуктуирующие отверстия диаметром 50-200 нм, пронизывающие бислой. Работу эндосомолитического модуля показали и на живых клетках (меланома мышей Клаудмана S91 (клон М3)) [8], измерив рН внутриклеточного микроокружения МНТМ8И методом видеомикроскопии отношения изображений: МНТМ8И без эндосомолитического модуля DTox находился в везикулах со слабокислым и кислым содержимым, тогда как полноразмерный МНТМ8И (с модулем DTox) оказывался в нейтральном микроокружении. Полученный результат указывал на способность полноразмерных МНТ выходить из закисляемых эндоцитозных компартментов живых клеток. Несколькими методами (поверхностный плазмонный резонанс и термофорез) охарактеризовано взаимодействие модуля с NLS в составе различных МНТ с а/Р-импортиновыми димерами, обеспечивающими доставку белков с NLS в клеточное ядро [9, 26]. Измеренные значения констант сродства МНТ к импортиновым димерам были близки к значениям констант свободного природного полипептида с этим же NLS. Таким образом показали, что все модули сохранили свои функции в составе искусственной химерной молекулы МНТ.
Соответственно все полноразмерные МНТ проникали в клетки-мишени путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, что подтверждалось ингибирова-нием их проникновения специфическими лигандами соответствующих рецепторов, и локализовались в их клеточных ядрах [8, 9, 14, 23, 26-28] (рис. 2), как это
Рис. 2. Внутриклеточная локализация МНТЕер в клетках эпидермоидной карциномы человека А431 (по [9] с разрешения). Клетки инкубировали в течение 4 ч в среде с МНТЕер, после отмывали и инкубировали 3 ч в среде без МНТЕер. Одна и та же группа клеток: А -иммуноцитохимическое выявление МНТЕер, Б - окраска ядерной ДНК (ТоРго-3)
и планировалось авторами для решения задачи внутриядерной доставки «грузов».
ФС, обычно применяемые для фотодинамической терапии злокачественных опухолей (хотя известны и другие направления их использования), генерируют свое цитотоксическое начало - активные формы кислорода - при освещении в оксигенируе-мой среде [2]. Как отмечено во «Введении», клеточное ядро является клеточным компартментом, наиболее чувствительным к поражающему действию как активных форм кислорода, так и эмиттеров АЧ и ЭО, применяемых в радиотерапии злокачественных опухолей [29, 30]. Поскольку МНТ показали свою способность проникать в клетки рецептор-опосредованным путем, а значит проникать в те клетки, где эти рецепторы представлены, т.е. специфически, и, главное, аккумулироваться в их ядрах, предстояло проверить, способна ли доставка эмиттеров АЧ и ЭО, а также ФС в ядра с помощью МНТ усилить их ци-тотоксичность.
Действительно, такие ФС, как хлорин е6 и бактери-охлорин p, присоединенные к MHTEGF или к MHTmsh, оказывались в сотни и тысячи раз более цитотоксич-ными, чем в свободном состоянии. Например, в опытах на клетках А431, сверхэкспрессирующих EGFR, концентрация полумаксимального цитотоксическо-го эффекта (ЕС50) МНТЮ1,-хлорин е6 составила 0.53 нМ, тогда как ЕС50 свободного хлорина е6 равна 1780 нМ, т.е. в 3360 раз больше [9]. Иными словами, тот же цитотоксический эффект ФС хлорина е6 можно обеспечить, используя в 3360 раз меньшие его концентрации, переместив с помощью МНТ этот ФС в ядро. В этих же экспериментах показано, что МНТЕСТ придавали ФС клеточную специфичность: если свободный хлорин е6 был одинаково цитотоксичен как в отношении клеток-мишеней А431, так и немишенных фибробластов NIH 3T3, лишенных EGFR, то МНТЕ^-хлорин е6 поражали лишь клетки-мишени.
Качественно сходные результаты получены и в опытах с МНТмж [8], где также показана необходимость наличия всех четырех модулей в МНТ: так МНТ, лишенный эндосомолитического модуля, был в 5.3 раза менее активным, чем полноразмерный МНТ, а МНТ без модуля с NLS оказывался еще менее цитотоксичным.
В опытах in vivo на мышах-опухоленосите-лях убедительно показана эффективность доставки ФС в ядра раковых клеток с помощью МНТ [19, 31]. Иммуноцитохимический анализ распределения МНТЕСТ и МНТмж после внутривенного введения мышам-опухоленосителям выявил их преимущественное накопление в раковых клетках, а внутри них - в ядрах. Применение МНТмж для терапии
двух экспериментальных меланом (внутривенное введение) показало, что ФС бактериохлорин р, доставляемый МНТМ8И, ингибировал рост опухоли В16-Г1 на 85-89% эффективнее, чем свободный бактериохлорин р, а меланомы Клаудмана Б90 - на 93%. Отношение концентраций ФС в опухоли и коже достигало 9.8, что в 4.5 раза лучше, чем свободного бак-териохлорина р [32]. Значительный терапевтический эффект наблюдали и при внутривенном введении МНТЕСТ с ФС хлорином е6 на модели эпидермоидной карциномы человека А431, привитой мышам с иммунодефицитом: 75% мышей выжили к 92 суткам при 20% выживаемости животных, получавших свободный хлорин е6 (положительный контроль) и полной гибели нелеченого контроля к 23 суткам.
АЧ и ЭО, вызывая плотную ионизацию и тем самым эффективно повреждая молекулы вдоль своих треков, обладают весьма небольшим пробегом в тканях: АЧ - 50-100 мкм, т.е. несколько клеточных диаметров, ЭО - порядка десятков и сотен нанометров, т.е. практически в пределах размеров клеточного ядра. Эти особенности эмиттеров АЧ и ЭО привлекательны тем, что в случае их избирательной доставки в клетки-мишени можно рассчитывать на минимальное повреждение окружающих нормальных клеток. При этом оба типа излучений вызывают множественные и трудно репарируемые двухцепочечные разрывы ДНК. Собственно, ядерная ДНК и является главной мишенью цитотоксического действия этих излучений [33, 34]. У них практически не происходит резкого уменьшения цитотоксичности при снижении содержания кислорода [35] (так называемого «кислородного эффекта», характерного для редкоионизи-рующих излучений), что дает им особое преимущество для поражения гипоксических раковых клеток. А эмиттеры ЭО интересны еще и тем, что на каждый распад продуцируют до нескольких десятков ЭО (в зависимости от природы эмиттера), что и обеспечивает их высокую биологическую эффективность, если распад происходит в непосредственной близости от ДНК [36]. С учетом перечисленных особенностей АЧ и особенно ЭО представляют интерес для терапии злокачественных опухолей, расположенных в местах, где повреждение окружающих нормальных тканей должно быть сведено к минимуму (например, опухолей мозга, особенно у детей) [37], либо для лечения микрометастазов [38].
Альфа-эмиттер 211А^ использованный как источник АЧ в экспериментах с МНТ, рассматривают как один из радионуклидов, наиболее перспективных для терапевтических целей [30]. Альфа-эмиттер 211А1 имеет относительно короткий период полураспада (7.2 ч), пробег испускаемых им АЧ - до 70 мкм, дающий высокий выход двухцепочечных разрывов
ДНК [39]. 211А1-МНТЮ1, в экспериментах на клетках эпидермоидной карциномы человека А431, а также на двух линиях глиобластомы человека (D247MG и U87MG.wtEGFR) были в 8-18 раз более цито-токсичными, чем 211А^ не транспортируемый МНТ в ядра этих клеток [40]. Причем оказалось, что доставка этого эмиттера АЧ в клеточные ядра позволила проявиться эффектам ядер отдачи, которые из-за очень короткого пробега не выявляются при иных внутриклеточных локализациях.
В экспериментах с МНТ использовали следующие эмиттеры ЭО, широко применяемые в медицине в качестве источников гамма-излучения: 1251, 6^а и 1111п. Они испускают в среднем 24.9, 4.7 и 14.7 ЭО на 1 распад соответственно [41], причем выход двухцепочечных разрывов ДНК, вызываемых ЭО, существенно зависит от расстояния между ДНК и эмиттером ЭО [42].
1251 или 6^а, доставляемые МНТЮ1,, весьма интенсивно накапливались в ядрах клеток эпидермоидной карциномы человека А431 [27, 28]: к первому часу инкубации около 60% радиоактивности, доставленной в клетки, оказывалось в их ядрах. 1251-МНТЮ1, был в 3500 раз более цитотоксичным для клеток А431, чем 1251-иодированный контрольный полипептид, не проникающий в клетки [27]. Похожие результаты по резкому усилению цитотоксичности эмиттеров ЭО за счет их доставки в ядра получены с 6^а [28] и 1111п [20]. В этих опытах на трех клеточных линиях (А431, D247MG и U87MG.wtEGFR) сравнили цитотоксич-ность 1251 и 6^а, доставленных в ядро с помощью МНТ, с их цитотоксичностью при доставке преимущественно в цитоплазму. Как и следовало ожидать, доставка этих эмиттеров в ядро обеспечивала значительно большую цитотоксичность (от 20 до 400 раз в зависимости от радионуклида и клеточной линии) [15].
Проверки безопасности МНТ, проведенные в рамках доклинических испытаний, осуществленных в «Национальном медицинском исследовательском радиологическом центре» Минздрава России, показали, что исследованные МНТ при внутриопу-холевом введении обладают весьма незначительной токсичностью для мышей и крыс (как острой, так и хронической), малой иммуногенностью/аллер-генностью для мышей и морских свинок и непиро-генны для кроликов [19, 43-45]. В целом, посчитали, что этот терапевтический подход безопасен при вну-триопухолевом введении МНТ [46].
т1п-МНТЮ1,, однократно введенный в раковую опухоль мочевого пузыря человека EJ, привитую подкожно иммунодефицитным мышам Ва1Ь/с пи/ пи, удерживался внутри опухоли весьма продолжительное время (время полуудержания составило 4.1 ± 0.5 сут) [20], при этом в кровь поступало не более 0.5% введенной дозы. При внутриопухолевом введе-
Л
день 0
день 7
Б
350
X
н
2 ^300 ¡=
I го
1= 250 го 2 1 200
^ ГО
со I
а 5 *
^ О
к *
то ш
1 2
I а
Ф с
* о
ф С
£0 о
50
«•— легкие а- сердце печень почки кости + опухоль
В 800
700
600
500
2 4 6
Время после введения, сут
1111п-МНТЕОр, 9.2 МБк (4 мкг) 1111п, 9.2 МБк
МНТ , 4 мкг
ЕОг
0.9% ЫаС1
с
о
¡л 400 оп
<и р
ю
О 200
300
5 20 25 30 35 Время, сут
Рис. 3. 1111п-МНТеСР после введения внутрь опухоли (рак мочевого пузыря человека EJ), привитой подкожно иммунодефицитным мышам Ва1Ь/с пи/пи (по [20] с изменениями). Л - визуализация удержания радиоактивности в опухоли методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии; Б - кинетика удержания радиоактивности в опухоли и нормальных тканях; В - противораковая эффективность 1111п-МНТеОР при внутриопухолевом введении
нии 111In-МНТEGF оказывал выраженный дозозави-симый терапевтический эффект на опухоли EJ (до 90% по сравнению с нелеченым контролем: как немеченым МНТEGF, так и свободным т1п в той же дозе) [20] (рис. 3).
Похожую терапевтическую эффективность продемонстрировал другой вариант МНТ - МНТF с П11п [23, 24]. 111In-МНТF обеспечил дозозависимое торможение роста опухолей, привитых подкожно (клетки HeLа рака шейки матки) иммунодефицитным мышам (вплоть до 80%), при этом выживаемость животных достигла 60% (на 90-е сут) при полной гибели нелеченого контроля к 21 дню.
Результаты, полученные с различными цитотокси-ческими агентами (двумя ФС, одним эмиттером АЧ, тремя эмиттерами ЭО), побудили взглянуть на МНТ как на потенциальных доставщиков значительно более широкого спектра биологически активных молекул. В этом смысле особенно привлекательны биоактивные полипептиды, поскольку сами МНТ являются химерными полипептидами, и включение в их состав дополнительных полипептидных фрагментов - вопрос, решаемый генно-инженерными методами.
Один из первых вариантов таких МНТ - МНТ с фрагментом белка р21: р21-МНТEGF. Белок р21 обладает широким спектром действия, образуя комплекс с белком РСЫА, он влияет на процессы репарации ДНК, контролирует репликационную вилку ДНК, а взаимодействуя с циклинами и циклинза-висимыми киназами, регулирует клеточный цикл [47]. Это делает р21 или его фрагменты, которыми он связывается с РСЫА, привлекательным инструментом для модификации действия средств повреждения ДНК, используемых, например, в терапии рака. Исходя из этих отправных моментов, синтезированы р21-МНТEGF, которые содержали С-концевой фрагмент белка р21 (аминокислотные остатки 87-164) с участком, которым р21 связывается с РСЫА [48]. ДНК повреждали блеомицином - противораковым агентом, вызывающим ее двухцепочечные разрывы [49], а для анализа повреждений ДНК и ее репарации использовали метод ДНК-комет в щелочной среде, позволяющий выявлять все типы разрывов ДНК. Предварительная инкубация клеток А431 с р21-МНТ^ТЛ показала, что р21-МНТ^т, вызывают
EGг EGг
статистически значимое ингибирование репарации ДНК по сравнению с контрольными МНТEGF, т.е. аналогичными МНТ, но без фрагмента р21 [14].
Ободряющие результаты этого исследования способствовали дальнейшему продвижению по пути направленной внутриклеточной доставки биологически активных полипептидов. В ходе работ по гранту РНФ № 17-14-01304 [50] были созданы МНТ, несущие в качестве эффекторной части антителомиметик
0
0
анти-Кеар1 монободи, активирующий сигнальный путь Nrf2/ARE за счет конкуренции с эндогенным Nrf2 за связывание с белком-ингибитором Кеар1. Транскрипционный фактор Nrf2 регулирует несколько сотен генов, часть которых участвует в защите клетки от окислительного стресса (т.е. в антиок-сидантной защите), другая - в защите от токсичных ксенобиотиков и в ряде других жизненно важных процессов [51]. Окислительный стресс сопровождает или участвует в патогенезе многих заболеваний, таких, как болезни Паркинсона и Хантингтона, сахарный диабет, атеросклероз, в старении клеток, их радиационном поражении и др. [51, 52]. В отсутствие окислителей Nrf2, находящийся в цитоплазме в комплексе со своим ингибитором Кеар1, подвергается убиквитинированию и последующей деградации в протеасомах. Появляющиеся в клетке окислители, ксенобиотики взаимодействуют с тиоль-ными группами «цистеиновых сенсоров» в составе Кеар1, что приводит к высвобождению Nrf2 и его накоплению в ядре с последующим взаимодействием с «элементом антиокислительного ответа» (ARE -antoxidant response element) в области промоторов контролируемых генов, активируя их транскрипцию [51, 53]. Эксперименты с МНТ, содержащими анти-Кеар1 монободи, выявили статистически значимое увеличение экспрессии ряда генов антиоксидантной защиты и защиту клеток от окислительного стресса, индуцированного трет-бутилгидропероксидом. На мышиной модели окислительного стресса, индуцированного гепатотоксином ацетаминофеном, показано, что предварительное введение МНТ с анти-Кеар1 монободи, активирующего сигнальный путь Nrf2/ARE, препятствует гепатотоксическому действию ацетаминофена, выявляемому по увеличению активности аспартат-аминотрансферазы и аланин-аминотрансферазы в сыворотке крови [50]. Эти результаты свидетельствуют о возможности применения МНТ для доставки антителомиметиков не только in vitro, но и in vivo.
ПОЛИПЛЕКСЫ (КОМПЛЕКСЫ КАТИОННЫХ БЛОК-СОПОЛИМЕРОВ С ДНК) ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Перспектива изменять функционирование клеток, модифицируя их генетическую программу, уже не первое десятилетие стимулирует многих исследователей, ставящих своими конечными целями генотерапию (например, онкологических или наследственных заболеваний) или биотехнологию для продукции нужных макромолекул и т.п. Как нередко бывает при решении подобных значительных проблем, состоящих из нескольких крупных задач, нахождение оптимального варианта решения какой-то из них оказывается
не столь быстрым, как того хотелось бы. Задача направленной доставки генетического материала - одна из таких. Напрашивающимся вариантом решения могли быть вирусы как надмолекулярные структуры, наиболее приспособленные для преодоления ор-ганизменных и клеточных барьеров при направленной доставке собственного генетического материала. Наибольшее число доклинических и клинических испытаний по генотерапии осуществлено именно с ними. Однако над вирусными векторами, по-видимому, надолго нависла угроза неожиданных и нередко тяжелых побочных эффектов [54, 55]. Поэтому параллельно с конструированием вирусных векторов для доставки генетического материала разрабатываются невирусные методы, привлекающие все больший интерес и число исследователей.
Один из вариантов невирусной доставки - применение поликатионов, образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами, называемые полиплексами. В полиплексах ДНК (или РНК) упакована и защищена от действия гидролитических ферментов, что обеспечивает достаточную стабильность в биологических средах. Полиплексы непатогенны, многие из них неиммуногенны и малотоксичны. Модифицируя исходные полимеры, можно получать различные по свойствам частицы, а также присоединять различные функциональные компоненты для придания им, например, клеточной специфичности или иных желаемых свойств [56].
Очевидно, что к позитивным качествам собственно полимерных носителей в составе полиплексов необходимо как добавление упомянутых выше функциональных компонентов, так и оптимизация состава самих полимеров для приближения свойств поли-плексов к свойствам вирионов доставлять генетический материал.
Рассмотрим это на примере хорошо известных полиплексов на основе полиэтиленимина (ПЭИ). При смешивании ПЭИ с ДНК в разных соотношениях, выражаемом как отношение N/P (где N - число аминогрупп ПЭИ, а P - число фосфатных групп ДНК), образуются частицы разного размера и заряда. Для увеличения времени циркуляции полиплексов в крови и снижения токсичности ПЭИ к нему присоединяют ПЭГ, получая блок-сополимеры ПЭГ-ПЭИ. Поскольку варьировать можно не только соотношения N/P, но и ПЭГ/ПЭИ, то возникает задача нахождения оптимальных соотношений компонентов в составе полиплекса. Для ее решения на 11 клеточных линиях протестированы варианты полиплексов с различными соотношениями компонентов, а эффективность транс-фекции оценивали по активности экспрессируемого репортерного гена [57]. Показано, что получаемые зависимости эффективности трансфекции от соот-
ношений N/P и ПЭГ/ПЭИ немонотонны, но близки по форме для всех исследованных клеток, и, что важно, максимумы эффективности трансфекции разных клеточных линий наблюдаются при одних и тех же отношениях N/P и ПЭГ/ПЭИ. При этом для всех исследованных линий клеток показана значимая положительная корреляция между эффективностью трансфекции и долей наночастиц полиплексов с размерами 50-75 нм. Такой результат, полученный более чем на 10 клеточных линиях человека и животных, дает возможность трансфицировать разные линии клеток с максимальной эффективностью. Однако при сходстве зависимостей трансфекции от соотношений N/P и ПЭГ/ПЭИ для всех изученных клеточных линий замечено и существенное отличие: максимально достижимая эффективность трансфекции варьировала от почти 100% (HeLa, HEK293, меланома Клаудмана, меланома B16-F1) до 4.4% (ВТ-474). Эти различия можно было объяснить либо различиями в экспрессии репортерного гена, либо различиями в процессах транспорта и распаковки полиплексов у разных клеточных линий. Экспериментальная проверка [57] показала правомочность второго предположения: эффективность трансфекции положительно коррелировала со скоростью входа полиплексов в клетки и отрицательно - со скоростью их распаковки в эндоцитозных компартментах.
Модификация блок-сополимеров лигандами к интернализуемым рецепторам на клетках-мишенях позволяет придавать полиплексам клеточную специфичность. Например, полиплексы с aMSH приобретали специфичность по отношению к клеткам меланомы, сверхэкспрессирующим меланокор-тиновые рецепторы 1-го типа (aMSH - их лиганд), и намного более эффективно трансфицировали эти раковые клетки in vivo [58].
Размер наиболее эффективно трансфицирующих полиплексов на основе ПЭИ (50-75 нм; см. выше) заставляет сомневаться, что наночастицы такого размера способны проникнуть через ядерные поры в ядро неделящейся клетки, поскольку их известный предел даже для частиц, имеющих NLS, - около 40 нм [59]. Эксперименты по исследованию транс-фекции флуоресцентно меченными полиплексами клеток показали, что около 90% клеток, экспрессиру-ющих репортерный ген, доставляемый этими нано-частицами, были трансфицированы именно в ходе своего деления [60], что позволяет рассматривать по-липлексы как средство, подходящее для трансфек-ции активно делящихся, в первую очередь раковых, клеток. В этом же исследовании [60] оценено среднее число интактных молекул ДНК, приходящихся на одно ядро успешно трансфицированной клетки; оно оказалось равным примерно трем, что указыва-
ет на немалую эффективность полиплексов. В пользу целесообразности использования полиплексов в генотерапии рака говорят и их физические свойства: раковые опухоли, точнее их сосуды, обладают свойством так называемого эффекта «усиленной проницаемости и удерживания» наночастиц [61]. Полиплексы на основе ПЭИ, модифицированные аМ^Н, с разной эффективностью трансфицировали клетки меланомы В16^1 и Клаудмана S91: первые лучше, чем вторые. Как показано, причина различий состоит в том, что опухоли В16^1 более васкуляри-зованы, и в их эндотелии больше фенестр, что способствует более выраженному эффекту «усиленной проницаемости и удерживания» [62]. Тем не менее опухолевые ткани представляют собой определенный барьер для наночастиц полиплексов. Эти нано-частицы, хотя и проникают в опухолевые ткани в отличие от нормальных, но глубина их проникновения невелика: не более 20 мкм [63] (рис. 4А). Поэтому, если есть необходимость в доставке полиплексов на большую глубину в опухоль, то нужны дополнительные воздействия на нее. Один из вариантов, позволяющий как увеличить глубину проникновения полиплексов, так и их концентрацию в опухоли, - модифицировать ее интерстиций, например, подавив продукцию коллагена типа I [62, 64] (рис. 4Б).
Полиплексы на основе ПЭИ продемонстрировали терапевтическую эффективность в случае экспериментальных опухолей (саркома мышей S37 [65] и меланома Клаудмана S91, клон М3 [58]). В более ранних экспериментах при трансфекции молочных желез мышей и овец полиплексами удалось получить с их молоком желаемый белок [66]. Такими же полиплек-сами можно было осуществить трансгеноз ранних эмбрионов мышей и кроликов [67].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подытоживая результаты проведенных работ можно сделать следующие выводы.
max
Л.
50 200
Время, мин
Время, мин
Рис. 4. Проникновение полиплексов в опухоль (по [62] с разрешения); А - без воздействий; Б - после ингиби-рования продукции коллагена I лозартаном
о
А) По доставке цитотоксических агентов с помощью модульных нанотранспортеров с целью терапии рака: разработаны модульные нанотранспортеры -технологическая платформа (т.е. базовая технология, служащая основой для решения отдельных конкретных задач), позволяющая придавать клеточную специфичность и высокую эффективность целому ряду противоопухолевых агентов путем доставки их в клеточное ядро за счет использования естественных процессов внутриклеточного транспорта.
Б) По доставке биологически активных полипептидов: на основе модульных нанотранспортеров созданы проникающие в живую клетку антитело-миметики, которые можно назвать «ныряющими антителами», способные влиять на функции молекул-мишеней, а также новый тип модульных нано-транспортеров, воздействующих на функционирование транскрипционных факторов как в клетках in vitro, так и in vivo. Мы полагаем, что разрабатываемый подход может стать прорывным направлением как в создании инструментов для изучения функционирования живых клеток, так и, возможно, для разработки терапевтических средств.
В) По доставке генетического материала с помощью полиплексов: показана преимущественная трансфекция полиплексами делящихся клеток, что должно учитываться при их возможном практическом применении; эффективность трансфекции полиплексами показана in vitro и in vivo.
В перспективе планируется расширение спектра доставляемых биологически активных агентов, в первую очередь - антителомиметиков (создание новых «ныряющих антител»), а также гуманизация МНТ для возможного системного их применения. Эти работы уже начаты [68, 69]. •
Автор благодарен своим коллегам А.А. Розенкранцу, Ю.В. Храмцову и А.В. Уласову за пожелания, сделанные в процессе подготовки рукописи.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 17-14-01304).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sobolev A.S. // Herald Russ. Acad. Sci. 2013. V. 83. № 4. P. 324-335.
2. Sobolev A.S., Jans D.A., Rosenkranz A.A. // Progress Biophys. Mol. Biol. 2000. V. 73. № 1. P. 51-90.
3. Hall E.J., Giaccia A.J. Radiobiology for the Radiologist. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2019. 1161 p.
4. Baade I., Kehlenbach R.H. // Curr. Opin. Cell Biol. 2019. V. 58. P. 1-7.
5. Targeted Intracellular Drug Delivery by Receptor Mediated Endocytosis. / Ed. Devarajan P.V. et al. Cham: Springer, 2019. 560 p.
6. Ferrati S., Streiff A.K., Srinivasan S., Alexander J.F., Bhargava N., Peters A.M., Song N.E., Tasciotti E., Godin B., Ferrari M., et al. // Intracellular Delivery. Fundamentals and Applications. / Ed. Prokop A. Dordrecht, Heidelberg, London, New York: Springer, 2011. P. 3-56.
7. Sobolev A.S. // Bioessays. 2008. V. 30. № 3. P. 278-287.
8. Rosenkranz A.A., Lunin V.G., Gulak P.V., Sergienko O.V., Shumiantseva M.A., Voronina O.L., Gilyazova D.G., John A.P., Kofner A.A., Mironov A.F., et al. // FASEB J. 2003. V. 17. № 9. P. 1121-1123.
9. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khramtsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., et al. // Cancer Res. 2006. V. 66. № 21. P. 10534-10540.
10. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. // Curr. Pharm. Design. 2015. V. 21. № 9. P. 1227-1238.
11. Sobolev A.S., Aliev R.A., Kalmykov S.N. // Russian Chem. Rev. 2016. V. 85. № 9. P. 1011-1032.
12. Slastnikova T., Rosenkranz A., Morozova N., Vorontsova M., Petriev V., Lupanova T., Ulasov A., Zalutsky M., Yakubovskaya R., Sobolev A. // Internat. J. Nanomed. 2017. V. 12. P. 395-410.
13. Sobolev A.S. // Encyclopedia of Cancer. / Ed. Schwab M. Berlin, Heidelberg: Springer, 2017. P. 2891-2894.
14. Kamaletdinova T.R., Rosenkranz A.A., Ulasov A.V., Khramtsov Y.V., Tsvetkova A.D., Georgiev G.P., Sobolev A.S. // Doklady Biochem. Biophys. 2018. V. 479. № 1. P. 95-97.
15. Sobolev A.S. // Front. Pharmacol. 2018. V. 9. P. 952.
16. Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Georgiev G.P., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. // Nucl. Med. Biol. 2020. V. 80. P. 45-56.
17. Haddad J., Slika S., Mahfouz R. // Meta Gene. 2017. V. 11. P. 157-163.
18. Xu M.J., Johnson D.E., Grandis J.R. // Cancer Metastasis Rev. 2017. V. 36. № 3. P. 463-473.
19. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Schiffelers R.M., Lupanova T.N., Khramtsov Y.V., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. // Internat. J. Nanomed. 2012. V. 7. P. 467-482.
20. Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Karmakova T.A., Vorontsova M.S., Morozova N.B., Petriev V.M., Abrosimov A.S., Khramtsov Y.V., Lupanova T.N., Ulasov A.V., et al. // Front. Pharmacol. 2018. V. 9. P. 1331.
21. Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Durymanov M.O., Sobolev A.S. // Biochemistry (Moscow). 2013. V. 78. № 11. P. 1228-1237.
22. Khramtsov Y.V., Rokitskaya T.I., Rosenkranz A.A., Trusov G.A., Gnuchev N.V., Antonenko Y.N., Sobolev A.S. // J. Controlled Release. 2008. V. 128. № 3. P. 241-247.
23. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Khramtsov Y.V., Karyagina T.S., Ovechko S.A., Sobolev A.S. // Drug Design. Dev. Therapy. 2017. V. 11. P. 1315-1334.
24. Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Khramtsov Y.V., Karyagina T.S., Georgiev G.P., Sobolev A.S. // Doklady Biochem. Biophys. 2017. V. 473. № 1. P. 85-87.
25. Khramtsov Y.V., Vlasova A.D., Vlasov A.V., Rosenkranz A.A., Ulasov A.V., Ryzhykau Y.L., Kuklin A.I., Orekhov A.S., Eydlin I.B., Georgiev G.P., Gordeliy V.I., Sobolev A.S. // Acta Cryst. 2020. V. D76. № 12. P. 1270-1279.
26. Karyagina T.S., Ulasov A.V., Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Lupanova T.N., Khramtsov Y.V., Georgiev G.P., Sobolev A.S. // Front. Pharmacol. 2020. V. 11. P. 176.
27. Slastnikova T.A., Koumarianou E., Rosenkranz A.A., Vaidyanathan G., Lupanova T.N., Sobolev A.S., Zalutsky M.R. // EJNMMI Res. 2012. V. 2. № 1. P. 1-10.
28. Koumarianou E., Slastnikova T.A., Pruszynski M., Rosenkranz A.A., Vaidyanathan G., Sobolev A.S., Zalutsky M.R. // Nucl. Med. Biol. 2014. V. 41. № 6. P. 441-449.
29. Ku A., Facca V.J., Cai Z., Reilly R.M. // EJNMMI Radiopharm. Chem. 2019. V. 4. P. 1.
30. Vaidyanathan G., Zalutsky M.R. // Curr. Radiopharm. 2011. V. 4. № 4. P. 283-294.
31. Slastnikova T., Rosenkranz A., Lupanova T., Gulak P., Gnuchev N., Sobolev A. // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2012. V. 446. № 1. P. 235-237.
32. Mironov A.F., Grin M.A., Pantushenko I.V., Ostroverkhov P.V., Ivanenkov Y.A., Filkov G.I., Plotnikova E.A., Karmakova T.A., Starovoitova A.V., Burmistrova N.V., et al. // J. Med. Chem. 2017. V. 60. № 24. P. 10220-10230.
33. Buchegger F., Perillo-Adamer F., Dupertuis Y.M., Delaloye A.B. // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2006. V. 33. № 11.
P. 1352-1363.
34. Baidoo K.E., Yong K., Brechbiel M.W. // Clin. Cancer Res. 2013. V. 19. № 3. P. 530-537.
35. Chadwick K.H., Leenhouts H.P. // Molecular Theory of Radiation Biology. Monographs on Theoretical and Applied Genetics. V. 5 / Ed. Frankel R., et al. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1981. 377 p.
36. Kassis A.I. // Rad. Protect. Dosimetry. 2011. V. 143. № 2-4. P. 241-247.
37. Raghavan R., Howell R.W., Zalutsky M.R. // Biomed. Phys. Engin. Express. 2017. V. 3. P. 035005.
38. Falzone N., Lee B.Q., Able S., Malcolm J., Terry S., Alayed Y., Vallis K.A. // J. Nucl. Med. 2019. V. 60. № 2. P. 250-258.
39. Claesson A.K., Stenerlöw B., Jacobsson L., Elmroth K. // Radiat. Res. 2007. V. 167. № 3. P. 312-318.
40. Rosenkranz A.A., Vaidyanathan G., Pozzi O.R., Lunin V.G., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. // Internat. J. Radiat. Oncol. Biol. Physics. 2008. V. 72. № 1. P. 193-200.
41. Howell R.W. // Med. Phys. 1992. V. 19. № 6. P. 1371-1383.
42. Balagurumoorthy P., Xu X., Wang K., Adelstein S.J., Kassis A.I. // Internat. J. Radiat. Biol. 2012. V. 12. P. 998-1008.
43. Воронцова М.С., Морозова Н.Б., Кармакова Т.А., Панкратов А.А., Андреева Т.Н., Плотникова Е.А., Розенкранц А.А., Сластникова Т.А., Лупанова Т.Н., Соболев
A.С. // Рос. биотерапевт. журн. 2016. T. 15. № 1. C. 20-21.
44. Vorontsova M.S., Morozova N.B., Karmakova T.A., Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Petriev V.M., Smoryzanova O.A., Tischenko V.K., Yakubovskaya R.I., Kaprin A.D., et al. // AIP Conf. Proc. V. 1882. AIP Publ., 2017. P. 0200781-1-020078-1-4.
45. Воронцова М.С., Морозова Н.Б., Кармакова Т.А., Тищенко
B.К., Сморызанова О.А., Петриев В.М., Розенкранц
A.А., Сластникова Т.А., Лупанова Т.Н., Якубовская Р.И. и др. // Исследования и практика в медицине. 2017. T. 4 (спецвыпуск). C. 37.
46. Соболев А.С., Розенкранц А.А., Сластникова Т.А., Кармакова Т.А., Воронцова М.С., Морозова Н.Б., Петриев
B.М., Лупанова Т.Н., Храмцов Ю.В., Уласов А.В. и др. // Исследования и практика в медицине. 2018. Т. 5 Спецвыпуск 2). С. 266.
47. Karimian A., Ahmadi Y., Yousefi B. // DNA Repair (Amst.). 2016. V. 42. P. 63-71.
48. Bruning J.B., Shamoo Y. // Structure. 2004. V. 12. № 12. P. 2209-2219.
49. Liddle P., Lafon-Hughes L., Di Tomaso M.V., Reyes-Abalos A.L., Jara J., Cerda M., Härtel S., Folle G.A. // Chromosome Res. 2014. V. 22. № 4. P. 463-481.
50. Sobolev A.S., Ulasov A.V., Georgiev G.P., Khramtsov Y.V., Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Lupanova T.N., Karyagina T.S. The development of new types of modular nanotrans-porters carrying biologically active macromolecules as a tool for selective adjustment of specified functions of living cells. RSF Grant #17-14-01304. 2019. URL: https://rscf.ru/contests/ search-projects/17-14-01304/ (Access date: 26.05.2020).
51. Cuadrado A., Rojo A.I., Wells G., Hayes J.D., Cousin S.P., Rumsey W.L., Attucks O.C., Franklin S., Levonen A.L., Kensler T.W., et al. // Nat. Rev. Drug Discovery. 2019. V. 18. № 4.
P. 295-317.
52. Sekhar K.R., Freeman M.L. // Free Rad. Biol. Med. 2015. V. 88 (Pt B). P. 268-274.
53. Hayes J.D., Dinkova-Kostova A.T. // Trends Biochem. Sci.
2014. V. 39. № 4. P. 199-218.
54. van der Eb M.M., de Leeuw B., van der Eb A.J., Hoeben R.C. // Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews / Ed. Springer C.J. Totowa: Humana Press, 2004. P. 479-490. doi: 10.1385/1-59259-429-8:479.
55. Liu T.C., Kirn D.H. // Gene Therapy for Cancer / Ed. Hunt K.K., et al. Totowa: Humana Press, 2007. P. 351-385.
56. Rosenkranz A.A., Sobolev A.S. // Russ. Chem. Bull. 2015. V. 64. № 12. P. 2749-2755.
57. Ulasov A.V., Khramtsov Y.V., Trusov G.A., Rosenkranz A.A., Sverdlov E.D., Sobolev A.S. // Mol. Therapy. 2011. V. 19. № 1. P. 103-112.
58. Durymanov M.O., Beletkaia E.A., Ulasov A.V., Khramtsov Y.V., Trusov G.A., Rodichenko N.S., Slastnikova T.A., Vinogra-dova T.V., Uspenskaya N.Y., Kopantsev E.P., et al. // J. Controlled Release. 2012. V. 163. № 2. P. 211-219.
59. Pante N., Kann M. // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. № 2. P. 425-434.
60. Durymanov M.O., Yarutkin A.V., Khramtsov Y.V., Rosenkranz A.A., Sobolev A.S. // J. Controlled Release. 2015. V. 215. P. 73-81.
61. Wong A.D., Ye M., Ulmschneider M.B., Searson P.C. // PLoS One. 2015. V. 10. № 5. P. e0123461.
62. Durymanov M.O., Yarutkin A.V., Bagrov D.V., Klinov D.V., Kedrov A.V., Chemeris N.K., Rosenkranz A.A., Sobolev A.S. // J. Controlled Release. 2016. V. 232. P. 20-28.
63. Durymanov M.O., Slastnikova T.A., Kuzmich A.I., Khramtsov Y.V., Ulasov A.V., Rosenkranz A.A., Egorov S.Y., Sverdlov E.D., Sobolev A.S. // Biomaterials. 2013. V. 34. № 38. P. 10209-10216.
64. Durymanov M.O., Rosenkranz A.A., Sobolev A.S. // Ther-anostics. 2015. V. 5. № 9. P. 1007-1020.
65. Alekseenko I.V., Snezhkov E.V., Chernov I.P., Pleshkan V.V., Potapov V.K., Sass A.V., Monastyrskaya G.S., Kopantzev E.P., Vinogradova T.V., Khramtsov Y.V., et al. // J. Translat. Med.
2015. V. 13. P. 78.
66. Sobolev A.S., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A., Neugodova G.L., Naroditsky B.S., Shilov I.N., Shatski I.N., Ernst L.K. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 14. P. 7928-7933.
67. Ivanova M.M., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A., Sobolev A.S., Landa V., Naroditsky B.S., Ernst L.K. // Mol. Reprod. Dev. 1999. V. 54. № 2. P. 112-120.
68. Ulasov A.V., Khramtsov Y.V., Lupanova T.N., Tsvetkova A.D., Rosenkranz A.A., Slastnikova T.A., Georgiev G.P., Sobolev A.S. // Doklady Biochem. Biophys. 2018. V. 479. № 1. P. 62-65.
69. Khramtsov Y.V., Ulasov A.V., Tsvetkova A.D., Rosenkranz A.A., Georgiev G.P., Sobolev A.S. // Doklady Biochem. Biophys. 2017. V. 472. № 1. P. 81-83.
