CC BY
41
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 11 No. 4 2015, pp. 113-117 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Zhivetev, Dudareva, Rudikovskaya, Graskova and Voinikov
ORIGINAL ARTICLE
The Daily Dynamics of Phenolic Compounds Content and Guaiacol-Peroksidase Activity in Leaves and Flowers of Alchemilla subcrenata and Veronica
chamaedrys
Zhivetev M.A.1, Dudareva L.V.1, Rudikovskaya E.G.1, Graskova I.A.1,2, Voinikov V.K.1
1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, Russia
2 The Irkutsk Scientific Center of SB RAS, Irkutsk, Russia
*E-Mail: [email protected]
Received October 27, 2015
The daily dynamics of peroxidase activity and the total content of phenolic compounds in leaves and inflorescences of Alchemilla subcrenata Buser and Veronica chamaedrys L. were studied. Significant changes in the content of phenolic compounds and activity peroksidase depending on the time of day was shown.
Key words: medicinal plants, Alchemilla subcrenata Buser, Veronica chamaedrys L.,
temperature, peroxidase, phenolic compounds
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
114
The Daily Dynamics of Phenolic Compounds Content...
В течение суток растения оказываются под полифенолоксидаза и пероксидаза. Sherman с
влиянием сильных флуктуаций условий соавторами (1991) показали, что накопление
окружающей среды, и в первую очередь полифенолоксидазы, широко распространенной в
температуры. На территории Сибири такие наземных растениях, но не водорослях, может
перепады особенно выражены и достигают вне происходить одновременно с адаптацией к
зависимости от времени года 15-20 ° С. окислительной атмосфере, где активность
Пероксидаза играет важную роль в стресс- полифенолоксидазы жизненно необходима в
адаптации, в том числе при гипотермическом фотосинтетическом аппарате, уязвимом к
влиянии (Rogozhin, 2004). Фермент использует атмосферному кислороду. Также фотосинтез
перекись в качестве акцептора водорода, в то может играть косвенную роль, снабжая перекисью
время как донором могут выступать различные водорода (побочным продуктом фотосинтеза)
соединения - цитохром с, нитриты, аскорбиновая реакцию полимеризации полифенолов
кислота, индол, амины, также фенольные пероксидазой, как предположено Yamasaki и др.
соединения (Dikson and Uebb, 1982; Fielder, 1976). (1997).
На сегодяшний день гистохимически показана Манжетка богата танинами и особенно
совместная локализация полифенолов и накапливает их к осени (Zorina, 2009), и обладает
пероксидазной активности на ряде видов развитыми клеточными стенками, что должно
растений, причем высокому содержанию фенолов давать ей адаптивные преимущества. Поэтому
сопутствуют конституционно высокие активности изучение в манжетке полифенолов и активности
пероксидазы (Lavid et al., 2001). Широко известно, ферментов, участвующих в их метаболизме,
что стресс-толерантные растения обычно представляется весьма интересным.
содержат высокий конститутивный уровень Соответственно целью наших исследований
защитных метаболитов, в то время как более было изучить динамику фенольных соединений и
чувствительные растения показывают их индукцию активности слабосвязанных с клеточной стенкой и
под стрессом. Фенолы, танины и пероксидазная растворимых гваяколпероксидаз в листьях
активность у многих растений участвуют в манжетки городковатой Alchemilla subcrenata
полимеризации полифенолов при защите от Buser в условиях суточных перепадов температур
стресса, вызванного тяжелыми металлами (Lavid et атмосферного воздуха в сравнении с другим
al., 2001) и у устойчивых растений при вторжении лекарственным растением - вероникой дубравной
патогена (Rogozhin, 2004). Ферменты, вовлекаемые Veronica chamaedrys L.
в полимеризационные процессы фенолов - это MATERIALS AND METHODS
фенолоксидазы: такие как лакказа, Исследовались листья и соцветия манжетки
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
Zhivetev et al.
115
городковатой Alchemilla subcrenata Buser и вероники дубравной Veronica chamaedrys L., собранные в пойме реки Выдринная, в шестистах метрах от уреза оз. Байкал, левый берег реки на территории стационара СИФИБР «Речка Выдриная», разнотравный луг. Учитывая динамику температурного режима, пробы отбирались в третьей декаде июня в 8-9 часов после суточного минимума температур, в 14-15 во время максимально высокой температуры и в 20-21 ч на вечернем спаде температуры. Отбирались средневзвешенные образцы в трех повторностях в течение суток утром, в обед и вечером. Все биохимические исследования проводили в трех аналитических повторностях. С целью уменьшения возможных автолитических изменений образцы фиксировали в жидком азоте. Выделение гваяколпероксидаз осуществляли так, как описано в работе (Graskova, 2004). Выделение фенольных соединений осуществляли тройным
экстрагирования кипящим 80% метанолом и очисткой объединенного экстракта хлороформом от липофильных пигментов по стандартной методике с последующей экстракцией фенольного комплекса этилацетатом. Общее содержание определяли спектрометрическим методом с помощью реактива Фолина-Дениса при 720 нм (Zaprometov, 1971) с помощью SPECORD S 100 («Analytikjena», Германия). Для построения калибровочной кривой использовали коммерческий препарат кверцитина («Sigma», США). Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием
компьютерных программ StatSoft (Statistica 6,0).
RESULTS AND DISCUSSION
Средние значения и стандартные отклонения общего содержания фенольных соединений и активности слабосвязанной с клеточной стенкой, растворимой и общей гваякол-зависимых пероксидаз в 9, 14 и 21 ч в листьях и соцветиях манжетки городковатой и вероники дубравной приведены в табл. 1.
Нами установлено, что содержание фенольных соединений и активность пероксидаз зависит не только от вида и органа растения, но и от времени суток. При этом во всех случаях наблюдается повышение активности общей гваякол-зависимой пероксидазы в полуденную жару, что может свидетельствовать о высокотемпературном стрессе растений в это время суток.
Как правило, активность слабосвязанной с клеточной стенкой фракции пероксидаз ниже, чем общей и растворимой пероксидазы, однако динамика их суточных изменений чаще всего одинакова. Активность пероксидаз в генеративных органах (соцветиях) заметно отличается от активности в вегетативных органах (листьях).
В цветках манжетки активность растворимой и общей пероксидазы выше, чем в листьях, а активность пероксидазы слабосвязанной с клеточной стенкой, наоборот, ниже. Активность пероксидаз у вероники заметно ниже, чем у манжетки, и в ее листьях значения активности пероксидазы выше, чем в цветках, что свидетельствует о значительных видовых различиях этих растений.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
116
The Daily Dynamics of Phenolic Compounds Content...
Динамика содержания фенольных соединений также демонстрировала выраженную видо- и тканеспецифичность. У вероники содержание фенольных соединений в соцветиях в каждый временной отрезок было стабильно выше, чем в листьях, но при этом их динамика совпадала и максимум приходился на 9 ч утра с последующим уменьшением в течение дня. Соцветия манжетки продемонстрировали наряду с высокой
активностью гваякол-пероксидазы стабильно
высокие содержания фенольных соединений в течение всех суток, в то время как в листьях этого растения в 15 ч наблюдалось скачкообразное увеличение содержание полифенолов с
последующим минимумом в 21 ч при относительно слабом росте активности фермента, окисляющего фенолы.
Table 1. Активность гваякол-зависимых пероксидаз и общее содержание фенольных соединений в листьях и соцветиях манжетки городковатой и вероники дубравной в разное время суток.
Время суток, ч Активность пероксидаз, у.е./мг сырого веса Содержание фенольных соединений, мг/г сырой массы
Слабосвязанная с клеточной стенкой пероксидаза Растворимая пероксидаза Общая пероксидаза
Alchemilla subcrenata, листья
9.00 0,075 ± 0,006 0,176 ± 0,039 0,165 ± 0,022 3,28 ± 0,73
14.00 0,099 ± 0,005 0,161 ± 0,040 0,194 ± 0,025 5,31 ± 0,57
21.00 0,095 ± 0,004 0,191 ± 0,053 0,192 ± 0,033 1,25 ± 0,06
Alchemilla subcrenata, соцветия
9.00 0,041 ± 0,005 0,201 ± 0,012 0,227 ± 0,003 3,95 ± 0,43
14.00 0,085 ± 0,005 0,365 ± 0,049 0,406 ± 0,015 3,81 ± 0,18
21.00 0,041 ± 0,003 0,248 ± 0,038 0,289 ± 0,027 3,12 ± 0,15
Veronica chamaedrys, листья
9.00 0,011 ± 0,001 0,021 ± 0,001 0,049 ± 0,001 4,10 ± 0,27
14.00 0,016 ± 0,001 0,026 ± 0,003 0,059 ± 0,006 2,29 ± 0,14
21.00 0,012 ± 0,002 0,020 ± 0,000 0,041 ± 0,004 1,69 ± 0,11
Veronica chamaedrys, соцветия
9.00 0,012 ± 0,001 0,012 ± 0,001 0,034 ± 0,002 4,22 ± 0,29
14.00 0,018 ± 0,002 0,016 ± 0,000 0,043 ± 0,002 2,79 ± 0,40
21.00 0,012 ± 0,001 0,011 ± 0,001 0,032 ± 0,007 2,30 ± 0,26
CONCLUSIONS
Исследовались листья и соцветия манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser и вероники дубравной Veronica chamaedrys L. собранные в пойме реки Выдриная, в шестистах метрах от уреза оз. Байкал. На примере двух видов
лекарственных растений показаны существенные изменения содержания фенольных соединений и активности пероксидаз в зависимости от времени суток.
ACKNOWLEDGMENT
Работа выполнена при поддержке
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
Zhivetev et al.
117
Интеграционной программы «Фундаментальные исследования и прорывные технологии как основа опережающего развития Байкальского региона и его межрегиональных связей».
REFERENCES
Dikson M. and Uebb E. (1982) Fermenty. M.: Mir, 1, 322 s. (in Russian).
Fielder M.R. (1976) Genetic control of four cathodal peroxidase isozymes in barley. J. Heredity, 67(1), 39-42.
Graskova I.A., Borovskij G.B., Kolesnichenko A.V. and Voinikov V.K. (2004) Peroksidaza kak komponent signalynoj sistemy kletok kartofelya pri patogeneze kolyzevoj gnili. Fiziologija rastenij, 51(5), 692-697. (in Russian).
Lavid N., Schwartz A., Yarden O. and Tel-Or E. (2001) The involvement of polyphenols and peroxidase activities in heavy-metal accumulation by epidermal glands of the waterlily
(Nymphaeaceae). Planta, 212, 323-321.
Rogozhin V.V. (2004) Peroksidaza kak komponent antioksidantnoj sistemy zhivyh organizmov. SPb.: GIORD, 240 s. (in Russian).
Sherman T.D., Vaughn K.C. and Duke S.O. (1991) A limited survey of the phylogenetic distribution of polyphenol oxidase. Phytochemistry, 30, 24992506.
Yamasaki H., Sakihama Y. and Ikehara N. (1997) Flavonoid-peroxidase reaction as a detoxification mechanism of plant cells against H2O2. Plant Physiol, 115, 1405-1412.
Zaprometov M.N. (1971) Fenolnye soedineniya i metody ih issledovaniya. Biohimichecheskije metody v fiziologii rastenij. (pod. red. O.A. Pavlinoj). M.: Nauka, 185-197. (in Russian).
Zorina E.V. (2009) Farmagnosticheskoe izuchenie vidov roda Alchemilla L. Permskogo kraya. Avtoref. diss. na soisk. uch. st. kand. farmats. Nauk, Perm, 21 s. (in Russian).
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
