CC BY
61
УДК: 582.28+581.19+576.345+615.15
ХІМІЧНИЙ СКЛАД ТА АНТИПРОЛІФЕРАТИВНА АКТИВНІСТЬ ФРАКЦІЙ МЕТАНОЛЬНОГО ЕКСТРАКТУ БАЗИДІОМ Lactarius pergamenus (Fr.)Fr
Л. В. Панчак1 О. Ю. Ключівська2
М. В. Цивінська3, 4 Р. С. Стойка2, 3 Р. Б. Лесик1 В. О. Антонюк1, 2
Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького 2Інститут біології клітини НАН України, Львів 3Львівський національний університет ім. Івана Франка 4Науково-дослідний експертно-криміналістичний центр при ГУМВС України у Львівській області
E-mail: [email protected]
Отримано 20.09.2011
Описано методику розділення метанольного екстракту із базидіом гриба Lactarius pergamenus за допомогою екстракції органічних розчинників і хроматографії на колонці із силікагелем. Ідентифікацію речовин в одержаних фракціях здійснювали за допомогою мас-спектрометрії. Антипроліферативну активність визначали із використанням культури мишачих лейкозних клітин лінії L1210. Встановлено, що найвищу антипроліферативну активність має фракція, яка містить речовину із жовто-зеле-ною флуоресценцією в УФ-світлі. Її було ідентифіковано як 3,14,15-триметилфуранолактаран-8-ол. Також помітну роль в цитотоксичному ефекті відіграють супутні вищі жирні кислоти та їхні ефіри. Токсична дія триметилфуранолактарану із L. pergamenus на культуру клітин лінії L1210 є в декілька разів слабшою порівняно з таким ефектом алантолактону із кореневищ Inula helenium. Однак він є більш ефективним цитостатиком порівняно з алантолактоном. Сесквітерпенові сполуки, що містяться у базидіомах грибів роду Lactarius, можуть бути перспективними антипроліферативними чинниками.
Ключові слова: Lactarius pergamenus, метанольна екстракція, мас-спектрометрія, 3,14,15-три-метилфуранолактаран-8-ол, цитотоксична дія, лейкозні клітини лінії L1210.
Гриби роду Lactarius відрізняються від інших грибів родини Russulaceae наявністю соку молочної консистенції, однією з функцій якого є захист базидіом від поїдання тваринами. У цьому сокові міститься комплекс речовин, одні з яких зумовлюють гіркоту або пекучий смак, а інші — забезпечують його стабільність. Дослідженнями останніх років показано, що цей сік містить речовини, яким притаманна цитотоксична активність. Цитотоксична дія може бути вибірковою щодо мікроорганізмів, патогенних грибів і пухлинних клітин. Її пов’язують із наявністю у грибах роду Lactarius Pers. сесквітерпенових сполук. Наприклад, сесквітерпен ізовелерал, виділений із Latarius vellereus (Fr.) Fr., пригнічував ріст грам-позитивних і грам-не-гативних бактерій у діапазоні концентрацій 0,5-5 мкг/мл і деяких грибів у діапазоні 0,1-5 мкг/мл. Сесквітерпен флавідулол А був високоактивним у дослідах in vitro щодо Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis та інших бактерій і грибів [1]. Сесквітерпени лактаровіолін і детерол виявляли помірну ци-
тотоксичність стосовно клітин асцитної форми карциноми Ерліха і клітин лінії L1210 мишачого лейкозу in vitro [2]. Цитотоксичні ефекти ізовелералу щодо цих самих клітин спостерігалися за його концентрації 2 мкг/мл [1]. Екстракт із плодових тіл Lactarius piperatus (Fr.) S. F. Gray, одержаний екстракцією гарячою водою, пригнічував ріст культури клітин легеневої аденокарциноми Льюїса у білих мишей [3].
Серед хрящів-молочників особливо пекучим смаком відзначаються свіжі гриби Lactarius vellereus, L. piperatus і L. pergamenus; останній став об’єктом цього дослідження. Хрящ-молочник пергаментний (Lactarius pergamenus (Fr.) Fr.) — пластинчастий ба-зидіомікотовий гриб, який доволі часто трапляється у листяних і мішаних лісах України в найгарячішу пору літа (липень-серпень).
Метою нашої роботи було дослідження хімічного складу метанольного екстракту базидіом хряща-молочника пергаментного на предмет виявлення речовин із цитотоксичною активністю та дослідження їх ан-типроліферативної активності.
Матеріали і методи
Матеріали
Базидіоми грибів заготовляли у період масової появи їх у липні-серпні в мішаному лісі Сколівського району Львівської області. Протягом 12 год після збору гриби доставляли в лабораторію і вміщували в сушильну шафу при +52 °С на 24-48 год. Більшу частину базидіом подрібнювали на м’ясорубці і вичавлювали сік під дією сильного пресу. Цей сік використовували для одержання лектину, а шрот, одержаний після вичавлювання соку, висушували в сушильній шафі при +52 °С.
У роботі застосовували силікагель для колонкової хроматографії фірми Chemapol (Чехія) L40/160 меш і розчинники: метанол, н-гексан, петролейний ефір (tRHH = +40-65 °С), ацетон, етилацетат, хлороформ, ізопропанол, димексид (усі ці реактиви мали кваліфікацію «ч. д. а.»).
Фракціонування за допомогою розчинників та хроматографії на силікагелі
Після висушування шрот і базидіоми подрібнювали до порошку (d < 0,5 мм), вміщували в апарат Соксклета і впродовж 3-6 год екстрагували різними розчинниками (метанол, хлороформ, метилен-дихлорид, вода). Із одержаних екстрактів відганяли до невеликого об’єму розчинник, рештки якого випаровували в сушильній шафі при +52 °С. Одержаний сухий залишок зважували на аналітичних терезах, а сумарні екстракти використовували для вивчення їхнього хімічного складу і дії на мишачі лейкозні клітини лінії L1210.
У зв’язку з тим, що за результатами попередніх досліджень найбільш виражену цитотоксичність має метанольна фракція, її розділяли на окремі субфракції послідовним екстрагуванням органічними розчинниками і водою у порядку збільшення їхньої полярності (табл. 1). Розчинник відганяли, а одержані витяжки досушували при +52 °С, після чого залишок зважували на аналітичних терезах. Одержані субфракції використовували для дослідження дії на клітини лінії L1210.
Найбільш виражену цитостатичну дію має перша фракція, одержана екстракцією гексаном. Тому надалі її розділяли на колонці силікагелю і досліджували хімічний склад методом тонкошарової хроматографії і мас-спектрометрії.
Під час екстракції гарячим метанолом в апараті Соксклета до метанольного екстракту переходили речовини, які після охолодження випадали в осад. Як показали наші попередні дослідження, осад, що випадав із метанольного екстракту, містив май-
же чисту стеаринову кислоту, яка не виявляла цитостатичної активності [4]. Тому за подальшого екстрагування матеріалу з грибів одержаний метанольний екстракт після часткового відганяння метанолу вміщували в морозильну камеру при -18 °С для виморожування основної маси стеаринової кислоти.
Далі розділення одержаної суміші речовин здійснювали за допомогою хроматографічних методів. Із цією метою 2,8 г темно-коричневої густої маси, одержаної екстракцією гексаном метанольного залишку, розчиняли в 12,0 мл н-гексану (ч. д. а.), наносили на колонку силікагелю Л 40/160 (висота 40 см, діаметр 2,0 см), яку було попередньо промито чистим н-гексаном. Потім колонку промивали послідовно такими розчинниками: н-гексан (200 мл), гексан — етилацетат 7,5:1 (300 мл), гексан — етилацетат — етанол 4:2:1 (300 мл), ізопропанол (160 мл) і метанол (200 мл). Після цього колонка повністю очищувалася від пігментних речовин. За результатами вимірювання оптичної густини елюйованого розчину за 300 нм і 450 нм було одержано 6 підфракцій, які позначили як підфракції від №1.1 до №1.6, відповідно. Аналіз отриманих підфракцій здійснювали за допомогою методів тонкошарової хроматографії на пластинках «Силу-фол» і мас-спектрометрії. Показано, що одержані підфракції не є індивідуальними речовинами, а становлять складну суміш речовин. Тому концентровані підфракції повторно (кожну окремо) було піддано розділенню на колонці із силікагелем.
Найбільша кількість речовин, що інтенсивно флуоресціювала в УФ-світлі, містилась у підфракціях 1.1-1.3. При цьому речовини із підфракцій 1.1 і 1.2 флуоресціювали синім або фіолетовим світлом, а речовини із підфракції 1.3. — жовто-зеленим або жовто-голубим світлом. Цитотоксична активність речовин фракції 1.3 проти лейкозних клітин лінії L1210 була значно вищою за активність підфракцій 1.1 і 1.2. Тому надалі основну увагу було приділено дослідженню саме цієї підфракції (1.3).
Із цією метою 1,4 г підфракції №1.3 розчиняли в 7 мл н-гексану при +30 °С і після розчинення знову вміщували в морозильну камеру для виморожування стеаринової кислоти. Після видалення стеаринової кислоти (=0,85 г) розчин згущували випаровуванням до об’єму 2 мл і наносили на колонку силікагелю Л 40/160 (висота — 10 см, діаметр — 1,2 см). Колонку промивали послідовно н-гексаном (20 мл), сумішшю н-гексан — ацетон 10:1 (30 мл) і сумішшю
н-гексан — ацетон — етилацетат 4:2:1 (50 мл), збираючи фракції об’ємом 3 мл.
За допомогою тонкошарової хроматографії (ТШК) на пластинках «Силуфолу» у підфрак-ціях виявляли речовину, що дає жовто-зелену флюоресценцію. Підфракції, що містили цю речовину, об’єднували, а розчинник випаровували.
Очищену підфракцію повторно наносили на колонку силікагелю Л 40/160 (висота — 10 см, діаметр — 1,2 см). Колонку промивали послідовно н-гексаном (20 мл), сумішшю н-гексан — етилацетат 16:1 (20 мл), сумішшю н-гексан — етилацетат 8:1 (20 мл) і метанолом (30 мл). Підфракції, які за даними ITHX містили лише речовину із жовто-зеленою флюорес-ценцією, відбирали і розчинник випаровували.
Ідентифікацію одержаної речовини здійснювали за допомогою мас-спектрів на мас-спектрометрі 6C/MS Agilent Technologies 6890 N/5975 B і ЯМР-спектрів. ЯМР 1Н-спект-ри вивчали за допомогою приладу Varian Gemini 300 MHz із використанням тетраме-тилсилану (TMS) як внутрішнього стандарту за умов,описаних у попередній роботі [4].
Коли попередньо мас-спектрометричному аналізу було піддано очищену фракцію, що містила близько 15,9% речовини із жовто-зе-леною флюоресценцією, відповідно до наявної бази даних мас-спектрометрії було встановлено, що мас-спектр одержаної речовини на 90% збігався з еудезма-5,11(13)-дієн-8,12-олідом або алантолактоном, який у значній кількості міститься в кореневищі дев’ясилу (Inula hele-nium L.). Для порівняння фізико-хімічних і біологічних властивостей флуоресціюючої речовини ми також здійснили очищування алан-толактону з кореня дев’ясилу.
Із цією метою 150 г кореня дев’ясилу екстрагували в апараті Соксклета. Метанол з екстракту відігнали до невеликого об’єму, залишок випарували у сушильній шафі при +45 °С. Одержану в’язку жовто-коричневу рідину з приємним запахом тричі екстрагували низько-киплячим петролейним ефіром. Петролейний ефір відганяли на водяній бані до =1/4 початкового об’єму, фільтрували й охолоджували до -25 °С. Білий кристалічний осад, що випадав, відфільтровували і промивали холодним петролейним ефіром. Після цього його ще раз перек-ристалізували із гарячого петролейного ефіру.
Подальше очищення речовини із жовто-зеленою флюоресценцією з базидіом L. per-gamenus здійснювали за допомогою хроматографії підфракції 1.3 на колонці із силікагелем. Із цією метою розчинену в н-гексані підфракцію наносили на попередньо промиту н-гексаном колонку із силікагелем Л 40/160, яку після нанесення
розчину послідовно промивали н-гексаном, н-гексан — ацетоном (10:1), н-гексан — ацетон — етилацетатом (4:2:1). Одержані підфракції аналізували за допомогою ITOX. Пробірки, що містили речовину із жовто-зе-леною флюоресценцією об’єднували, розчинник видаляли і ще раз здійснювали хроматографію на колонці із силікагелем. Фракції, які за даними ТШX були найчистішими, аналізували за допомогою мас-спектрометра і ЯМР-спектрометрії. Згодом їх використовували для дослідження цитотоксичної дії на клітини лінії L 1210 мишачого лейкозу. Їхню дію порівнювали з дією алан-толактону, виділеного з кореня дев’ясилу.
Біотестування на культурі клітин
Мишачі лейкозні клітини лінії L1210 було одержано з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України (Київ). Клітини вирощували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (ДМЕМ, Sigma, США) за присутності 10%-ї декомп-лементованої сироватки крові ембріонів великої рогатої худоби (СК) і 50 мкг/мл ген-таміцину (Sigmа, США). Для визначення цитотоксичності алантолактону і речовини із жовто-зеленою флюоресценцією (одержаної, як описано нижче, з базидіом L. perga-menus, ідентифікованої як триметилфура-нолактаран), клітини висівали у 24-лункові пластикові планшети в середовищі ДМЕМ за присутності 10% СК. Через 24 год до середовища з клітинами додавали вищезазначені препарати в різній концентрації. Підрахунок кількості клітин здійснювали в гемоци-тометричній камері Горяєва через певні проміжки часу. Густину клітинної суспензії визначали за формулою: с = 12 500 n, де с — кількість клітин в 1 мл суспензії, n — середня кількість клітин у п’яти великих квадратах камери Горяєва. Відсоток мертвих клітин визначали після їх фарбування 0,1% (w/v) розчином трипанового синього, підрахувавши зафарбовані й незафарбовані клітини у світловому режимі мікроскопа МикМед 12 (ЛОМО, Російська Федерація). Трипанпозитивні клітини позначали як некротичні, оскільки в них було ушкоджено цілісність плазматичної мембрани. Відсоток апоптичних клітин визначали після фарбування їх акридиновим оранжевим (0,3 мкг/мл, 10 хв) і перегляду в люмінесцентному режимі мікроскопа. Критеріями зарахування клітин до апоптичних були конденсація ядерного хроматину, фрагментація ядер і/або клітин, утворення апоптичних тілець.
Статистичний аналіз Кожен експеримент виконували тричі з трьома паралелями. Значення різниці результатів у типових експериментах оцінювали за критерієм Стьюдента, вважаючи вірогідною різницю за значення Р < 0,05.
Результати та обговорення
У попередніх наших дослідженнях показано, що метанольний екстракт, одержаний із базидіом Lactariuspergamenus, має досить високу антипроліферативну активність [5]. Тому вважали за доцільне фракціонувати метанольний залишок різними розчинниками й аналізувати хімічний склад отриманих субфракцій за допомогою ГРХ-мас-спектромет-рії, а також перевірити антипроліферативну
активність очищених субфракцій. У процесі екстрагування метанольного залишку (1 г) органічними розчинниками в порядку зростання їхньої полярності було одержано 8 субфракцій та незначний залишок, який не піддавався розчиненню. Результати кількісного і якісного аналізу одержаних субфракцій та попереднє оцінювання їхньої антипроліферативної активності подано в табл. 1. Оскільки в усіх суб-фракціях було виявлено високий вміст стеаринової кислоти, його виділено в окрему графу.
Наведені в табл. 1 дані вказують на те, що найвищу цитотоксичність у культурі досліджуваних клітин має субфракція, одержана екстракцією гексаном. Тому саме її було взято для подальших досліджень. Стеаринова кислота, розчин якої також було досліджено як контроль, цитотоксичної дії не
Таблиця 1. Хімічний склад метанольного екстракту базидіом L. pergamenus та оцінка антипроліферативної активності його субфракцій
№ суб- фрак- ції Екстрагент Маса після висушу- вання Хімічний склад одержаних субфракцій Оцінка дії на клітини мишачого лейкозу лінії Ь,1210
Основні ідентифіковані речовини та їх кількість У т. ч. стеаринової к-ти (у% до загальної маси)
1 Гексан 247,0 мг Понад 60 речовин, у т. ч. сесквітерпенові сполуки ? Кількість мертвих клітин більше 60%, багатоядерних клітин немає
2 Хлороформ 55,5 мг Пальмітинова к-та 1,79% Олеїнова кислота 2,83% (усього 6 речовин) 85,8 Кількість мертвих клітин більше 50%, багатоядерних клітин немає
3 Діетиловий ефір 16,5 мг Містить понад 30 неіден-тифікованих речовин ? Кількість мертвих клітин становить 30-40%, є невелика кількість багатоядерних клітин
4 Етилацетат 10,0 мг Гліцерол 6,3% Пальмітинова к-та 1,03% (містить 5 речовин) 87,6 Кількість мертвих клітин становить 25-35%, є невелика кількість багатоядерних клітин
5 Бутанол 30,0 мг Гліцерол 21,51% Гліцеролу триацетат 14,12% Гліцеролу а-моноацетат 3,34% (містить 4 речовини) 61,0 Кількість мертвих клітин незначна, є рештки зруйнованих клітин і багатоядерні клітини (містять 3-4 ядра)
6 Ізопропанол 20,0 мг Гліцерол 40,2% 59,8 Кількість живих клітин — на рівні контролю, присутні великі агрегати аглютинованих клітин
7 Метанол 95,0 мг Понад 30 неідентифікова-них речовин ? Кількість живих клітин — на рівні контролю
8 Дистильована вода 483,5 мг Маніт 85,26% 14,7 Кількість живих клітин — на рівні контролю, є тенденція до стимуляції проліферації клітин
9 Нерозчинний залишок 3,5 мг Аналіз не проводили Аналіз не проводили
Сума 961,0 мг
Примітка. У таблицю не внесено речовини, ідентифікація яких за даними хімічних досліджень виявилася недостовірною.
виявляла і згодом її видаляли з метанольно-го екстракту шляхом виморожування (див. розділ «Матеріали і методи»).
Після виморожування стеаринової кислоти метанольний екстракт — темно-коричневу в’язку рідину — розділяли на 6 під-фракцій за допомогою хроматографії на колонці із силікагелем Л 40/160 (Chemapol).
Одержані підфракції далі аналізували за допомогою ГРX-мас-спектрометрії і досліджували їхню антипроліферативну активність. Отримані дані наведено в табл. 2.
Наступним етапом у дослідженні було розроблення методу очищення з підфракції 1.3 речовини, яку за допомогою мас-спектрометра було ідентифіковано як еудезма-5,11(13)-дієн-8,12-олід. Із цією речовиною ми й пов’язували основну цитотоксичну дію на клітини лінії L1210 мишачого лейкозу.
Відомо, що в коренях дев’ясилу міститься низка сполук, дуже близьких до цієї структури і відомих за тривіальною назвою
як алантолактон та ізоалантолактон. Згідно
з даними літератури, вони також справляють цитотоксичну дію [6]. Тому нами з кореня дев’ясилу було очищено кристалічну речовину, яка за даними мас-спектрометрії виявилася сумішшю алантолактону (42,5%) та ізоалантолактону (55,5%) із невеликою домішкою 4-а-епоксіалантолактону (0,32%), і її використали як контроль у цитологічних дослідженнях. Усього зі 150 г повітряно-сухих коренів дев’ясилу після трикратної перекристалізації з метанолу було одержано 0,708 г білої кристалічної речовини. Вона мала температуру плавлення +72-74 °С і під час хроматографії на силікагелі у системі петролейний ефір — етилацетат (5:1) після зрошування сумішшю 1%-й ванілін — сульфатна к-та — етанол (4:1) давала фіолетову пляму зі значенням Rf = 0,6. За даними літератури, це відповідає алантолактону [7].
Ідентифікація речовини з подібною структурою у базидіомах гриба L. pergamenus
Таблиця 2. Якісний і кількісний склад підфракцій метанольного екстракту базидіом гриба L. pergamenus та загальна оцінка їхньої дії на клітини мишачого лейкозу
№ під-фракції Масова частка під-фракції (%) Хімічний склад одержаних підфракцій (основні речовини, ідентифіковані за допомогою мас-спектро-метрії, і кількість виявлених речовин) Загальна оцінка дії 1%-го розчину підфракції на клітини лінії Ь,1210 мишачого лейкозу
1.1 0,07% 1. Біс (2-етилгексил) фталат — 50,6% 2. Діізобутилфталат — 4,4% 3. 2,2,4-триметилфуроазулен — 7,36% 4. 2,6,10-триметил-1,5,9-ундекатрієн — 13,64% 5. Метилстеарат — 13,9% Низька цитостатична дія у дозах вище 5 мкг/мл
1.2 0,6% 1. Біс (2-етилгексил) фталат — 1,1% 2. Олеїнова кислота — 10,4% 3. Метилстеарат — 15, 6% 4. Етилпальмітат — 3,2% 5. 9,12-октадекандієнової кислоти метиловий ефір — 6,8% 6. Стеаринова кислота — 62,9% Низька цитостатична дія у дозах вище 5 мкг/мл
1.3 51,73% 1. Еудезма-5,11(13)-дієн-8,12-олід — 15,91% 2. 9-октадеканової кислоти 2,3-дигідропропіло-вий ефір — 43,1% 3. Нафто-(2,3-Ь) фуран 2,3Н-он — 2,95% 4. Стеаринової кислоти 2-гідрокси-1-метил-пропіловий ефір — 19,35% 5. 9,17-октадекадієналь — 2,16% Усього — 24 речовини Найбільш виражена цитотоксична дія у дозі ~ 2 мкг/мл
1.4 42,85% Понад 60 речовин, у т. ч. сесквітерпенові сполуки Активна фракція, цитотоксична дія якої більш виражена у разі розчинення в ДМСО, ніж в етанолі
1.5 2,24% 1. 3-етил-4-метилпентанол (листковий альдегід) — 25,6% 2. «-нонанал (пеларгонієвий альдегід) — 21,3% 3. 7-метокси-5-етокси-2,2-диметилхроманон — 53,1% Цитотоксична дія виявляється за розчинення фракції у ДМСО
1.6 2,51% 1. Бета-нафтиламін — 35,7% 2. Ліноленової кислоти хлорид — 64,3% Цитотоксична дія виявляється за розчинення фракції у ДМСО
Примітка. Курсивом у таблиці позначено речовини, ступінь імовірності правильної ідентифікації яких за допомогою мас-спектрометрії був нижчим за 50%.
полегшувалася тим, що в УФ-світлі за тонкошарової хроматографії на пластинках «Силуфол» вона має жовто-зелену флюорес-ценцію. За даними хроматографічних і спектрометричних досліджень (ТШX на силікагелі, мас-спектрометрія і ЯМР-спект-рометрія), чистота одержаної речовини становила близько 98%. Ця світло-жовта олієподібна речовина застигає у тверду масу при температурі -17(±1) °С і розчиняється в метанолі, етанолі, гексані, ацетоні, димек-сиді, але нерозчинна у воді.
У ЯМР-спектрі отриманої сполуки виявлено характерний субспектр важкодиферен-ційованих аліфатичних протонів у ділянці слабкого магнітного поля за 1,29-2,40 м. ч. Сигнали метильних груп утворюють шести-протонний синглет за 1,29 м. ч. і трипротон-ний — за 1,34 м. ч. Xарактерним є сигнал вторинної гідроксильної групи у вигляді однопротонного дублета за 4,20 м. ч. Протони анельованого фуранового циклу утворюють двопротонний широкий синглет за 5,39 м. ч. ЯМР 1Н (300 MHz, CDCl3): 8 [ppm] 1,29с (6H, 2CH3); 1,34c (3H, CH3); 1,63-1,69м,
2,00-2,10м, 2,36-2,40м (8Н, 3СН2, 2СН); 4,20д (1Н, ОН); 5,39шс (2Н =СН).
Дані мас-спектроскопії і ЯМР 1Н-аналізу дають підстави припустити, що одержана речовина є 6,6,8-триметил-4,4a,б,6,7,9-гек-сагідро-2-оксациклопента^]азулен-4-олом, або 3,14,15-триметилфуранолактаран-8-олом із такою структурою:
Біотестування триметилфуранолактарану, одержаного з гриба Lactarius pergamenus, проведене паралельно із тестуванням алантолак-толактону з Inula helenium на мишачих лей-козних клітинах лінії L1210, показало, що біологічна дія триметилфуранолактарану з L^ergamenus виявляється починаючи з 8-ї год від додавання його до клітин у дозі 5 мкг/мл. Через 24 год його дія посилюється і виявляється вже в дозі 0,5 мкг/мл. При цьому спостерігається суттєве зростання відсотка три-панпозитивних клітин, що досягає ~80% за дії цього чинника в дозі 10 мкг/мл на 2-гу год або в дозі 5 мкг/мл — на 8-му год експерименту.
Загалом вплив сесквітерпену з гриба L. pergamenus упродовж перших 5 діб у діапазоні концентрацій 0,5-5,0 мкг/мл можна класифікувати як цитостатичний. У вищих концентраціях і за більшої тривалості дії пе-
реважає токсичний ефект, що призводить до повного відмирання клітин у популяції (рис. 1).
Триметилфуранолактаран
■ живі
Концентрація, мкг/мл 2 г 8 г 24г/1д 2 д 3 д 5 д Час, години (г) і доби (д)
7 д
Рис. 1. Дія триметилфуранолактарану із базидіом гриба Lactarius pergamenus на клітини лінії L1210 мишачого лейкозу
Алантолактон із Inula helenium починає діяти на 4-ту год від початку експерименту (мінімальна діюча концентрація — 0,1 мкг/мл). На 24-ту год його токсичний ефект досягає максимуму (мінімальна діюча концентрація — 0,05 мкг/мл) і на 5-ту добу спостерігається майже повна елімінація клітин із популяції (рис. 2).
Таким чином, нами проведено дослідження антипроліферативної дії різних під-фракцій метанольного екстракту базидіом грибів L. pergamenus щодо клітин мишачого лейкозу лінії L1210. Найвищу антипроліфе-
Алантолактон
■ живі • некротичні
■ * - »-*
Концентрація, мкг/мл 2 г 8 г 24г/1д 2 д 3д 5д 7д Час, години (г) і доби (д)
Рис. 2. Дія алантолактону із кореневища дев’ясилу на клітини лінії L1210 мишачого лейкозу
ративну активність виявлено у підфракцій, які містять сесквітерпени, зокрема у речовини із жовто-зеленою флуоресценцією. Цю речовину ідентифіковано як 3,14,15-триметил-фуранолактаран-8-ол. Вона дуже близька або ідентична за структурою до речовини, одержаної екстракцією гарячим метанолом із морфологічно подібного виду гриба L. vellereus [8, 9]. Слід відзначити, що у вегетуючих базидіомах L. vellereus міститься нестійка на повітрі речовина з пекучим смаком (стеарилвелютинал), яка в процесі екстракції метанолом та контакту з киснем повітря відщеплює стеаринову кислоту та перетворюється на триметилфуранолак-таран [9, 10]. Остання вже є достатньо стійкою під час зберігання, не має пекучого смаку і структурно дуже близька або ідентична речовині, одержаній нами. Стеарилвелютинал значною мірою відповідальний за те, що молоді вегетуючі базидіоми майже не ушкоджуються мікроорганізмами, личинками комах та тваринами, але через його виняткову нестійкість він не має широкої перспективи застосування в медицині. Триметилфуранолактаран, який можна одержати з базидіом L. pergamenus без особливих технологічних складнощів, як виявилось у результаті поставленого експерименту, також виявляє сильну біологічну дію.
Незважаючи на слабшу цитотоксичну дію триметилфуранолактарану із гриба L. perga-menus порівняно з алантолактоном із кореневища дев’ясилу Inula helenium, він є більш ефективним цитостатиком. Ці дані можуть
ЛІТЕРАТУРА
1. Vidari G., Vita-Finzi P. Sesquiterpenes and other secondary metabolites of genus Lacta-rius (Basidiomycetes): Chemistry and biological activity // Stud. Nat. Prod. Chem. — 1995. — V. 17. — P. 153-206.
2. Anke H., Bergendorff O., Sterner O. Assays of the biological activities of guaiane sesquiter-penoids isolated from the fruit bodies of edible lactarius species // Food Chem. Toxicol. — 1989. — V. 27, N 6. — P. 393-397.
3. Dulger B. Yilmaz F., Gucin F. Antimicrobial а^гу^ of some Lactarius species // Pharmac. Biol. — 2002. — V. 40, N 4. — P. 304-306.
4. Панчак Л. В., Цивінська М. В., Антонюк В. О., Стойка Р. С. Аналіз хімічного складу вимороженого метанольного екстракту із бази-діом справжніх грибів // Біотехнологія. — 2011. — Т. 4, № 5. — С. 90-96.
5. Ключівська О. Ю., Панчак Л. В., Цивінська М. В. та ін. Дослідження антипроліферативної активності сесквітерпенового лактону з плодових тіл Lactarius pergamenus // Матеріали X Укр. біохім. з’їзду. — Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 4. — С. 262-263.
становити певний інтерес для подальших досліджень сесквітерпенових сполук, що містяться в базидіомах грибів роду Lactarius, на предмет їхньої антинеопластичної дії.
Отже, в підсумку можна зазначити, що метанольний екстракт, одержаний із висушених базидіом гриба Lactarius pergamenus, характеризується високим вмістом стеаринової кислоти, основну масу якої можна видалити шляхом виморожування.
Наступне послідовне оброблення отриманого метанольного екстракту гексаном і хлороформом призводить до екстрагування речовин, що мають антипроліферативну активність. Цитостатична дія метанольного екстракту пов’язана в основному з наявністю сесквітерпенів, однак вищі жирні кислоти та їхні ефіри також можуть відігравати важливу роль у цитотоксичному ефекті цього екстракту.
Нами вперше досліджено дію окремих фракцій метанольного екстракту та очищеного триметилфуранолактарану із гриба L.perga-menus на клітини мишачого лейкозу лінії L1210. Виявлено, що її токсичний ефект у декілька разів слабший порівняно з таким ефектом алантолактону з кореневища дев’яси-лу Inula helenium. Водночас триметилфурано-лактаран є більш ефективним цитостатиком, ніж алантолактон. Подальше дослідження сесквітерпенових сполук базидіом грибів роду Lactarius може бути перспективним на предмет виявлення їхньої антинеопластичної дії.
6. Konishi T., Shimada Y., Nagao T. et al. Antiproliferative Sesquiterpene Lactones from the Roots of Inula helenium // Biol. Pharm. Bull. — 2002. — V. 25, N 10. — P. 1370-1372.
7. Li Tong, Huanli Xu, Rezengcaidan Y. et al. A rapid identification of Radix inulae and its active component alantolactone in the Tibetan medicine Manuxitang // BioScience Trends. — 2008. — V. 2, N 2. — P. 64-67.
8. Sterner O., Bergman R., Kesler E. et al. Velutinal esters of Lactarius vellereus and L. necator. The preparation of free velutinal // Tetrahedron Lett. — 1983. — V. 24, N 13. — P. 1415-1418.
9. Kamo T., Matsue M., Kashiwabara M., Hirota M. 1,2-Dehydrolactarolide A, a New Plant Growth Regulatory Lactarane Sesquiterpene from Lactarius vellereus // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2006. — V. 70, N 9. — P. 2307-2309.
10. Hansson T., Pang Z., Sterner O. The Conversion of [12-2H3]-Labelled Velutinal in Injured Fruit Bodies of Lactarius vellereus. Further Insight into the Biosynthesis of the russulaceae Sesquiterpenes //Acta Chem. Scand. — 1993. — V. 47. — P. 403-405.
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАКЦИЙ МЕТАНОЛЬНОГО ЭКСТРАКТА БАЗИДИОМ Lactarius pergamenus (Fr.)Fr
Л. В. Панчак1 О. Ю. Ключивская2 М. В. Цивинская3 4 Р. С. Стойка2, 3 Р. Б. Лесин1 В. О. Антонюк1, 2
1Львовский национальный медицинский университет им. Данила Галицкого
2Институт биологии клетки НАН Украины, Львов
3Львовский национальный университет им. Ивана Франко
4Научно-исследовательский экспертно-криминалистический центр при ГУМВД Украины во Львовской области
E-mail: [email protected]
В работе описана методика разделения ме-танольного экстракта из базидиом гриба Lactarius pergamenus с помощью экстракции органическими растворителями и хроматографии на колонке с силикагелем. Идентификацию веществ в полученных фракциях осуществляли с помощью масс-спектрометрии. Антипролиферативную активность определяли с использованием культуры мышиных лей-козных клеток линии L1210. Обнаружено, что наивысшей антипролиферативной активностью обладает фракция, содержащая вещество с желто-зеленой флуоресценцией в УФ-свете, которое было идентифицировано как
3.14.15-триметилфуранолактаран-8-ол. Также заметную роль в цитотоксическом эффекте играют сопутствующие высшие жирные кислоты и их эфиры. Токсическое действие триме-тилфуранолактарана из L. pergamenus на культуру клеток линии L1210 мышиного лейкоза в несколько раз слабее по сравнению с таким эффектом алантолактона из корневищ Inula hele-nium. Однако триметилфуранолактаран является более эффективным цитостатиком по сравнению с алантолактоном. Сесквитерпено-вые соединения, содержащиеся в плодовых телах грибов рода Lactarius, могут быть перспективными антипролиферативными агентами.
Ключевые слова: Lactarius pergamenus, мета-нольная экстракция, масс-спектрометрия,
3.14.15-триметилфуранолактаран-8-ол, цито-токсическое действие, лейкозные клетки линии L1210.
THE CHEMICAL COMPOSITION AND ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY OF FRACTIONS OF THE METHANOL EXTRACT FROM THE BASIDIOMES OF Lactarius pergamenus (Fr.)Fr
L. V. Panchak1 O. Yu. Klyuchivska2 M. V. Tsivinska3, 4 R. S. Stoika2, 3 R. B. Lesyk1 V. O. Antonyuk1, 2
1Danylo Halytsky Lviv National Medical University
2Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv 3Ivan Franko Lviv National University 4Scientific and Research Criminal Expertise Centre of Ministry of Internal Affairs of Ukraine in Lviv region
E-mail: [email protected]
The method of fractionation of the methanol extract from basidiomes of Lactarius perga-menus mushroom by the organic solvents and chromatography on the silica gel column is described. Identification of substance in the obtained fractions was carried out by mass-spec-trometry. Antiproliferative activity was defined in the culture of murine leukemia cells of L1210 line. It was found that the fraction containing a substance with yellow-green fluorescence under UV light possessed the highest antiproliferative activity. This substance was identified as
3,14,lб-trimethylfuranolactaranе-8-ol. Concomitant higher fatty acids and their ethers also play a noticeable role in cytotoxic effect. The toxic effect of trimethylfuranolactaran of L. pergamenus towards the cultured murine leukemia cells of L1210 line was many times weaker as compared to such effect of the alanto-lactone of the Inula helenium rhizomes. However, trimethylfuranolactaran is more effective cytostatic as compared to alantolac-tone. Thus, the sesquiterpen substances of fruit bodies of Lactarius mushrooms be perspective antiproliferative agents.
Key words: Lactarius pergamenus, methanol extraction, mass-spectrometry, 3,14,15-trime-thylfuranolactarane-8-ol, cytotoxic effect, murine leukemia cells of L1210 line.
