CC BY
0УДК 575.852'113:575.858:57.082.13
А. Н. Верчук12, А. В. Кильчевский1
ТЕСТИРОВАНИЕ КОММЕРЧЕСКИХ НАБОРОВ И МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ
Тосударстенное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: a.n.verchuk@mail.ru 2Государственное учреждение
«Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь» Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Филимонова, 25
Дана оценка эффективности некоторых коммерческих наборов и классических методов выделения нуклеиновых кислот для получения качественных образцов ДНК, выделяемых из пыльцы растений. По результатам оценки качественных и количественных параметров образцов ДНК с помощью спектрофотометрии, флуори-метрии и ПЦР-РВ сделаны выводы об эффективности использования коммерческих наборов и классических методов для выделения ДНК из пыльцы растений. Сравнительный анализ результатов, полученных для различных видов растений, позволяет сделать заключение об эффективности того или иного коммерческого набора. Установлена высокая эффективность классического метода фенол-хлороформной экстракции и некоторых коммерческих наборов (Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit, PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kit, ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System) для выделения ДНК из пыльцы растений.
Ключевые слова: ДНК пыльцы, выделение ДНК, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), палинология, судебная экспертиза.
Введение
Совокупность пыльцы, которая в значительном количестве присутствует в воздухе, оседая на поверхности, образует сложную смесь пыльцевых зерен — «пыльцевой след». Установление качественной и количественной характеристики «пыльцевого следа» может предоставить необходимую информацию, которая применима в разных областях, включая судебную палинологию. Однако ограничения классической палинологии не дают в полной мере воспользоваться информацией, которую скрывает в себе пыльцевая смесь. По этой причине идея использовать молекулярно-генетические методы исследования пыльцы в качестве альтернативы или дополнения к световой микроскопии появились у разных исследователей [1-6].
Выделение качественной ДНК является одним из наиболее важных аспектов при проведении молекулярно-генетических исследований, от которого будет зависеть дальнейший
результат. Большинство растительных тканей считаются сложными объектами для выделения образца ДНК как по качественным показателям (ratio 260/280 и 260/230 нм), так и по количеству выделенной нуклеиновой кислоты. Содержание значительных количеств вторичных метаболитов, таких как фенолы, полисахариды, пигменты, и низкое содержание ДНК может препятствовать реакции ПЦР или заметно снижать ее эффективность.
В настоящее время не ясно, насколько сопоставимы различные методы экстракции, поскольку морфологическое строение внешней оболочки пыльцы, ее химический состав, содержание вторичных метаболитов в клетке и на ее поверхности у различных видов растений сильно отличается, что может оказывать значительное влияние на результат выделения ДНК по причине неполного лизиса клеток или частичного удаления ингибирующих веществ [4]. Стандартизированный и эффективный метод выделения ДНК пыльцы обе-
спечит сопоставимость результатов палинологических исследований [6].
В настоящее время нет специфических коммерческих наборов для выделения ДНК из пыльцевых зерен, однако для выделения ДНК из пыльцы некоторые исследователи использовали следующие коммерческие наборы: Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit [1, 3, 4, 5, 7], Qiagen DNeasy Plant Mini Kit [1, 4, 8], DNeasy Tissue Kit (Qiagen GmbH) [9], QIAamp DNA Mini Kit [10], MP Biomedicals FastDNA SPIN [3] и др.
Цель данной работы — изучить эффективности коммерческих наборов и классических методов экстракции нуклеиновых кислот для выделения ДНК из пыльцы разных видов растений и отбор наиболее пригодных из них.
Материалы и методы
Для оценки эффективности исследуемых коммерческих наборов и классических методов выделения нуклеиновых кислот (фенол-хлоро-формная экстракция и сорбция на силикагеле в суспензии) был сформирован план работ, который включал следующие этапы:
1. Выделение ДНК согласно протоколам производителей коммерческих наборов и описанным в научной литературе подходам [11].
2. Измерение концентрации ДНК с использованием спектрофотометрии (качественная характеристика образцов — соотношения 260/230 и 260/280) и флуориметрии (количественная характеристика образцов, измерение концентрации двуспиральной нативной ДНК, являющейся основой для начальных циклов ПЦР);
3. Нормализация концентрации двуспиральной нативной ДНК для всей совокупности исследуемых образцов (концентрация была стандартизована до 1 нг/мкл) и проведение первой ПЦР-РВ для определения порогового цикла Ct. Основная задача данного этапа — сравнить усредненное значение Ct для десяти биологических видов (перечислены ниже) для всех анализируемых коммерческих наборов и классических методов выделения нуклеиновых кислот. На данном этапе были рассчитаны среднее значение Ct и его стандартное отклонение, на основании чего был сделан вывод о пригодности того или иного набора/подхода для выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований пыльцы растений в целом.
4. Проведение второй ПЦР-РВ для определения порогового цикла Ct к 30-му циклу на серии разведений ДНК, измеренной с использованием флуориметра. Данный цикл был выбран в качестве порогового в связи с тем, что на более поздних циклах ПЦР возрастает вероятность образования неспецифических ампликонов и артефактов. Основная задача данного этапа — определить минимальное количество двуспиральной нативной ДНК, достаточное для получения целевого ампликона.
5. Классификация исследуемых коммерческих наборов и классических методов выделения нуклеиновых кислот по эффективности для выделения ДНК с целью молекулярно-генетических исследований пыльцы растений.
В исследовании использовали 10 образцов пыльцы, собранных с различных видов растений, которые произрастали на территории г. Минска и Минской обл.: клен ясенелистный (Acer negundo), береза повислая (Betula pendula), дуб черешчатый (Quercus robur), сосна горная (Pinus mugo), ель обыкновенная (Picea omorika), одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale), каштан конский обыкновенный (Aesculus hippocastanum), тюльпан гибридный (Tulipa hybrida), кукуруза сахарная (Zea mays) и можжевельник обыкновенный (Juniperus communis). Видовой состав образцов пыльцы был выбран исходя из значительной распространенности данных растений, систематической принадлежности и их хозяйственного значения на территории Республики Беларусь. Пыльца различных видов растений исследовалась для оценки универсальности методов выделения ДНК, учитывая особенности морфологического строения наружной оболочки.
В зависимости от вида пыльцы навески варьировали по массе от 2,55 до 10,90 мг. В пределах вида повторности имели одинаковую массу (табл. 1). Измерения навесок проводились на аналитических весах Radwag AS/C/2/N 82/220 (Польша), дискретность которых составляет 0,01 мг.
Для выделения ДНК из исследуемых образцов использовали 13 коммерческих наборов и два классических метода выделения ДНК (фенол-хлороформная экстракция и сорбция на силикагеле), широко применяемых в судебной биологической экспертизе. Краткая харак-
Таблица 1
Масса навесок пыльцевого материала в каждой исследуемой пробе в зависимости от вида растений и предполагаемые размеры продуктов ПЦР
Вид образца Масса навески пыльцы (мг/образец) Размеры ампликона 18S рРНК GenBank
Acer negundo 5,83 245 U89909.1
Betula pendula 9,86 249 FJ011777.1
Quercus robur 4,22 218 AF098424.1
Pinus mugo 5,56 259 KR052986.1
Picea omorika 4,67 197 AJ243166.1
Taraxacum officinale 2,55 281 AJ633290.1
Aesculus hippocastanum 3,50 212 MK341794.1
Tulipa hibrida 7,56 197 HF952962.1
Zea mays 10,90 244 U46617.1
Juniperus communis 5,98 265 LC420950.1
теристика наборов и методов приведена в таблице 2. Коммерческие наборы отбирались по нескольким принципам: упоминание в научных публикациях об их использовании для выделения ДНК из пыльцы; предусмотренная производителем возможность выделения ДНК из растительных тканей или объектов судебной криминалистической экспертизы; частота
применения в экспертных исследованиях; доступность к приобретению на момент проведения эксперимента.
Для классических методов выделения ДНК использовали лизирующий буфер на основе SDS (10mM трис-HCl; 10mM ЭДТА; 100 mM NaCl; 2% SDS) с добавлением 20 мкл 1М DDT на образец. При выделении фенол-хлороформ-
Таблица 2
Краткая характеристика коммерческих наборов и классических методов выделения ДНК
№ способа Название набора /каталожный № /производитель Характеристика набора / метода Способ сорбции нуклеиновых кислот
1 АртДНК MiniSpin эксперт / VEMS / АртБиоТех (Беларусь) Предназначен для выделения ДНК из образцов, содержащих малое количество ДНК, а также с высоким содержанием ДНК животного, растительного и микробного происхождения Мембрана на основе диоксида кремния
2 Фенол-хлороформная экстракция Выделение ДНК из широкого спектра образцов различного происхождения Спиртовое осаждение ДНК
3 АртДНК / VD / АртБиоТех (Беларусь) Универсальный набор, применимый для экстракции ДНК из тканей животных и человека, растительного сырья, продуктов питания, биологических добавок, кормов и других биологических образцов Связывание ДНК с силикатными сорбентами
4 «Нуклеосорб» комплектация «С» / 005c.2 / Праймтех (Беларусь) Набор предназначен для выделения ДНК из гомогенизированных тканей, а также из пищевых продуктов, биологических добавок, кормов для животных или растительного сырья Связывание ДНК с силикатными сорбентами
5 GeneJET Plant Genomic DNA Purification Kit / K0792 / Thermo Fisher Scientific (США) Набор предназначен для очистки геномной ДНК разных типов тканей и видов растений Мембрана на основе диоксида кремния
Окончание таблицы 2
№ способа Название набора /каталожный № /производитель Характеристика набора / метода Способ сорбции нуклеиновых кислот
6 LumiPure from AnySample для выделения геномной ДНК универсальный / 11573 / Lumiprobe (Россия) Набор предназначен для быстрого и высокоэффективного выделения геномной ДНК из широкого спектра биологических образцов, в том числе тканей растений Мембрана на основе диоксида кремния
7 PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kit / 4463352 / Thermo Fisher Scientific (США) Набор разработан для извлечения ДНК из кальцинированных тканей Магнитные частицы
8 PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit / 4463351 / Thermo Fisher Scientific (США) Набор разработан для извлечения ДНК из большинства типов судебно-медицинских образцов как обычных, так и сложных Магнитные частицы
9 QIAamp DNA Investigator Kit / 56504 / QIAGEN (Германия) Набор предназначен для выделения геномной ДНК из широкого спектра образцов судебно-медицинской экспертизы Мембрана на основе диоксида кремния
10 Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit / 740945.50 / Macherey-nagel (Германия) Набор предназначен для получения высокочистой геномной ДНК из пищевых продуктов и кормов Мембрана на основе диоксида кремния
11 Plant DNA Preparation -Solution Kit / PP-207 / Jena Bioscience (Германия) Набор разработан для удобного и быстрого выделения геномной ДНК из растительной ткани Спиртовое осаждение ДНК
12 MasterPure-Complete DNA & RNA Purification Kit / MC89010 / Lucigen (США) Набор предназначен для выделения высокомолекулярной геномной ДНК из различных типов образцов Спиртовое осаждение ДНК
13 ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System / A2351 / Promega (США) Набор разработан для очистки геномной ДНК из фиксированных в формалине тканей, пропитанных парафином Мембрана на основе диоксида кремния
14 Выделение с помощью силикагеля в суспензии / S5631-100G / Honeywell (США) Предназначен для выделения ДНК из лизата широкого спектра образцов [11] Связывание ДНК с силикатными сорбентами
15 Genomic DNA Purification Kit / K0512 / Thermo Fisher Scientific (США) Набор предназначен для выделения ДНК из бактерий, клеток, растений, крови Спиртовое осаждение
ным методом фенол добавляли к лизирующейся пыльце за 1 ч до основного этапа выделения и оставляли на термошейкере при температуре окружающей среды. Выделение ДНК с помощью силикагеля (метод № 14) проводили согласно описанной в литературе методике [11].
Каждым набором была выделена ДНК из 10 образцов пыльцы, которые происходили от разных видов растений. Объем элюата во всех случаях был одинаков (50 мкл).
Измерение концентрации выделенных об-
разцов ДНК проводили с помощью спектрофотометра DS-11 (Denovix, США) и флуориметра Quantus (Promega, США). ПЦР проводили с помощью амплификатора QuantStudio 5 (Thermo Scientific, США) при следующих условиях: 95 °С — 5 мин, 40 циклов: 95 °С — 15 сек, 60 °С — 60 сек. В качестве ПЦР-смеси использовали мастер-микс ArtMix Low ДНК-по-лимераза (АртБиоТех, Беларусь) с интеркали-рующим красителем EvaGreen PCR-379 (Jena Bioscience, Германия). Итоговая концентрация
праймеров в смеси — 0,2 пмоль/мкл, общий объем ПЦР-смеси составлял 20 мкл. Каждая ПЦР проводилась в двух проворностях, оценка специфичности ПЦР проводилась на этапе плавления ампликонов.
Поскольку эффективность ПЦР варьирует в зависимости от праймеров и матрицы, эффективность комбинации праймер-матрица оценивается в эксперименте по титрованию с последовательными разведениями ДНК-ма-трицы для создания стандартной кривой, отражающей изменения Ct при каждом разведении.
В ПЦР-РВ использовали праймеры 18S [12]. Праймеры 18S синтезированы к участку ри-босомальной 18S рРНК, которая входит в состав малой субъединицы рибосом эукариот и является основным компонентом всех эукариотических клеток. Более того, участок 18S находится вблизи /Г£-региона, который является одним из наиболее часто использующихся ДНК-штрихкодов растений. Размеры ампликонов (табл. 1), которые образованы используемыми маркерами, были установлены с помощью NCBI Primer BLAST. Размер получаемых продуктов был сопоставим между собой для всех исследуемых видов, что дает возможность проводить сравнительное исследование.
Результаты и обсуждение
Концентрации образцов ДНК, измеренные методом спектрофотометрии, находились в диапазоне от 6,23 до 581,55 нг/мкл в зависимости от используемого набора. Значения концентраций, близкие к пороговым для применяемого спектрофотометра, имеют высокую погрешность, что отражается на точности измерения. То же самое касается показателей чистоты препарата, определяемых по отношению поглощения волны при 260/230 и 260/280 нм. Если концентрация ДНК при измерении на спектрофотометре составляет <20 нг/мкл, то возможны погрешности в измерении показателей отношения 260/230 и 260/280 [13]. Показатель отношения 260/280 был оптимальным у 8 из 15 вариантов выделения, а отношение 260/230 находилось в оптимальной зоне только для набора Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit (№ 10) (табл. 3).
Абсолютные значения результатов флуори-метрии были заметно ниже, чем при исполь-
зовании спектрофотометрии, и составляли от 0,78 до 44,2 нг/мкл (табл. 3). Флуорофор связывается только с двухцепочечной ДНК, поэтому измерение концентрации на флуо-риметре более корректно, т. к. не учитываются сильно деградированные молекулы ДНК и примеси вторичных метаболитов со схожей длиной поглощения волны. Наиболее высокие значения концентрации ДНК, измеренные с помощью флуориметра, были получены при выделении пыльцы фенол-хлороформ-ной экстракцией (№ 2) и наборами QIAamp DNA Investigator Kit (№ 9) и MasterPure-Complete DNA & RNA Purification Kit (№ 12), а наименьшие — при использовании наборов АртДНК MiniSpin эксперт (№ 1), GeneJET Plant Genomic DNA Purification Kit (№ 5) и LumiPure from AnySample (№ 6). Результаты измерения концентрации выделенной ДНК на спектрофотометре и флуориметре скоррелированы, R = 0,918 (p <0,01).
Высокие значения стандартного отклонения, характерные для измерения концентраций по каждому способу, объясняются тем, что выделялись навески пыльцы, принадлежащие к разным видам. В этой связи анализировались значения медианы и процентилей (25, 75%), поскольку наблюдалось распределение, не соответствующее нормальному для полученных результатов.
Измерение концентрации ДНК при помощи ПЦР-РВ позволяет оценить эффективную концентрацию ДНК, которая учитывает только те фрагменты ДНК, которые пригодны для ПЦР — неповрежденные цепи достаточной длины. Эффективная концентрация ДНК может отличаться от концентраций, измеренных спектро- и флуориметрически. С одной стороны, в ПЦР могут вступать и одноцепочечные фрагменты, с другой стороны, наличие примесей, особенно фенольной природы, оказывает ингибирующее действие на ПЦР [14]. Количество ДНК в образце оценивается по минимальному числу циклов амплификации исследуемого локуса, превышающему пороговое значение. Низкое значение порогового числа циклов (Ct) может указывать на высокий уровень содержания целевой ДНК в образце. Если значение Ct оказывается больше 30 циклов, возрастает вероятность неспецифической амплификации.
Таблица 3
Показатели концентраций ДНК, измеренные на спектрофотометре и флуориметре, и Ct для маркеров 18S в зависимости от способов выделения для 10 видов
№ способа выделения (табл. 1) Среднее значение отношения 260/280* Среднее значение отношения 260/230** Средняя концентрация ДНК, нг/мкл (флуориметр) Среднее количество ДНК, нг Медианное значение концентрации ДНК, (нг/мкл) при анализе на флуориметре [25-75%] Среднее Ct 18S с стандартным отклонением (SD)
1 1,92 0,40 0,89 44,5 0,82 [0,16-1,37] 16,33 ± 5,03
2 1,88 1,14 43,05 2 152,5 47,25 [16,38-65,75] 18,24 ± 9,05
3 1,36 0,83 4,17 208,5 1,41 [0,40-4,64] 16,10 ± 4,25
4 2,28 0,04 5,97 298,5 3,25 [1,13-6,63] 15,41 ± 5,13
5 3,30 0,96 0,78 39,0 0,97 [0,08-1,35] 16,61 ± 3,7
6 2,98 0,56 0,91 45,5 0,17 [0,04-2,13] 17,73 ± 2,95
7 1,99 0,93 23,76 1 188,0 16,75 [7,85-44,13] 14,81 ± 4,91
8 2,05 0,93 28,42 1 421,0 21,00 [9,84-44,13] 15,56 ± 4,14
9 2,34 1,03 44,20 2 210,0 29,00 [2,45-86] 16,86 ± 4,05
10 2,11 1,95 25,90 1 295,0 42,00 [4,97-111,25] 17,19 ± 5,26
11 1,99 1,44 24,45 1 222,5 18,82 [7,38-36,95] 18,06 ± 3,76
12 2,15 1,39 30,52 1 526,0 18,24 [3,59-47,32] 20,16 ± 3,82
13 1,80 0,53 8,74 437,0 2,22 [0,3-10,19] 13,69 ± 3,83
14 2,29 0,52 9,76 488,0 4,36 [2,13-13,83] 17,75 ± 4,21
15 0,76 0,29 2,40 120,0 0,42 [0,17-2,80] 22,26 ± 5,04
Примечание. полужирным шрифтом выделены наилучшие значения показателей; * — оптимальное соотношение 260/280 находится в диапазоне 1,8-2,2; ** — оптимальное соотношение 260/230 должно быль больше 1,8
Наилучшие значения показателя Ct (табл. 3) наблюдались для наборов «Нуклеосорб» комплектации «С» (№ 4), PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kit (№ 7), PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (№ 8), ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (№ 13), а наихудшие — для метода выделения фенол-хло-роформная экстракция (№ 2) и наборов Plant DNA Preparation - Solution Kit (№ 11), MasterPure-Complete DNA & RNA Purification Kit (№ 12), Genomic DNA Purification Kit (№ 15). К интерпретации Ct стоит подходить осторожно, поскольку его значение зависит от большого количества факторов. Например, ингибирование ПЦР может происходить из-за внесения большого количества матрицы
ДНК в ПЦР-смесь, что, возможно, и наблюдается для метода выделения фенол-хлорофор-мная экстракция (№ 2) и наборов Plant DNA Preparation - Solution Kit (№ 11), MasterPure-Complete DNA & RNA Purification Kit (№ 12), поскольку ранее были установлены высокие значения концентраций ДНК для данных ме-тодов/наборов. С другой стороны, наборы, показавшие наилучшие значения, возможно, позволяют выделить оптимальное количество чистой ДНК для проведения ПЦР без дополнительной пробоподготовки.
Для определения эффективной концентрации ДНК для каждого способа выделения (табл. 2) было выполнено три этапа последовательных разведений ДНК (1/3, 1/9, 1/27). Та-
ким образом, было подготовлено 450 образцов для ПЦР-РВ. Отсутствие продукта амплификации наблюдалось в 60% случаев для образцов без разведения и при разведениях 1/3, выделенных фенол-хлороформным методом (№ 2). Увеличение разведения до 1/9 снижало количество «неудачных» ПЦР до 10%, а при разведении 1/27 ПЦР продукт появлялся во всех образцах, что может указывать на ингибирование ПЦР большим количеством ДНК. По этой причине для фенол-хлороформного метода была выполнена еще одна серия разведения (1/81, 1/243, 1/729, 1/2 187), в которой целевой ПЦР продукт присутствовал во всех образцах, что подтверждает предположение об ингибировании реакции большим количеством ДНК и позволило достоверно построить стандартную кривую. Неполное удаление ингибиторов ПЦР для данного метода не критично, поскольку обязательное разведение образца выделенной ДНК приведет не только к снижению ее концентрации, но и ингибиторов, что положительно скажется на протекании ПЦР. Ингибирование ПЦР избыточным количеством ДНК характерно и для наборов QIAamp DNA Investigator Kit (№ 9), Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit (№ 10), но было выражено заметно слабее и проявлялось в завышении Ct при амплификации неразведенных образцов, что может указывать на более высокие значения показателей чистоты выделенной ДНК по сравнению с фенол-хлороформ-ным методом (№ 2).
Подход к количественному определению ДНК с помощью ПЦР-РВ основан на построении графика зависимости флуоресценции от
числа циклов в логарифмической шкале [15]. По графикам линейной регрессии (рис. 1), построенным на основании зависимости порогового значения Ct от разведений образцов ДНК, определены уравнения прямой, значения R2 и количество ДНК для Ct 30 (табл. 4)
Среди исследуемых образцов минимальное количество ДНК, которое должно вноситься в ПЦР-смесь для получения стабильного результата, было отмечено у ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (№ 13), QIAamp DNA Investigator Kit (№ 9) и фенол-хлороформной экстракции (№ 2). Для большинства методов/ наборов количество ДНК в ПЦР для Ct 30 было в диапазоне 0,0234-0,1888 нг, за исключением выделения ДНК с использованием MasterPure-Complete DNA & RNA Purification Kit (№ 12), силикагеля (№ 14) и Genomic DNA Purification Kit (№ 15). Полученные результаты указывают на сильное влияние выбранного варианта для выделения, отношение по вносимой ДНК худшего подхода к лучшему составило 53,94. Таким образом, влияние на эффективность выделения оказывается через лизис клеточной стенки, эффективное избавление лизата от вторичных метаболитов и максимальное сохранение молекулы ДНК.
Образцы всех наборов имели относительно небольшие эффективные количества ДНК, способные амплифицировать целевой продукт, а риск получения неспецифического продукта был минимален. Таким образом, несмотря на значительные различия между наборами, все они могли бы использоваться для выделения ДНК из пыльцы при необходимости. По значению коэффициента детерминации (R2)
График линейной регрессии
20,50 19,13 25.00 20.00 15,12
16,56 13,48
у = -ЗД172х + 13,835 R* = 0,9928 10,00 12,09 9,78
0,00
■2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5
Log концентрации ДНК (разведения)
Рис. 1. График линейной регрессии одного из образцов, выделенного фенол-хлороформной экстракцией
Таблица 4
Значения R2 и количество ДНК для Ct 30 по серии разведений образцов ДНК
№ способа выделения (табл. 1) Значение R2 Среднее значение k Расчетное значение количества ДНК (нг) для О 30
1 0,9938 -3,1517 0,0268
2 0,953 -2,0893 0,0130
3 0,9672 -2,6279 0,0186
4 0,9643 -2,8282 0,0298
5 0,9711 -3,3446 0,0466
6 0,9782 -2,9260 0,0234
7 0,9566 -2,6215 0,0527
8 0,9459 -3,9914 0,1168
9 0,9538 -1,8670 0,0095
10 0,9173 -2,1271 0,0286
11 0,9714 -3,2535 0,1888
12 0,9508 -3,2287 0,3560
13 0,9457 -2,2819 0,0066
14 0,9253 -5,2448 0,2671
15 0,9715 -4,0676 0,2109
можно судить о достоверности полученных результатов. В нашем исследовании разведения всех образцов имели значения R2, близкие к «1», что свидетельствует о корректности полученных данных.
ДНК, выделенная из пыльцы, будет использоваться для дальнейшего исследования с помощью секвенирования, поэтому оптимальным будет тот способ выделения, образцы ДНК которого будут успешно амплифициро-ваться в широком диапазоне концентраций. Общее уравнение построенных прямых имеет вид y = k х x + b, где k — угловой коэффициент, равный тангенсу угла, образованного данной прямой к оси Х. Значение k (табл. 4), отражающее угол наклона калибровочной прямой к оси Х, демонстрирует характер изменения показателя Ct в зависимости от концентрации образца, т. е. характеризует устойчивость ПЦР к разведению, которая будет снижаться при ухудшении качества матрицы или ее слишком низкой концентрации в исследуемом образце.
Нами определен перечень критериев, на основании которых определены лучшие способы выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований пыльцы растений:
- соотношение 260/280 (2 балла, если значение находится в диапазоне 1,8-2,2; 0 баллов, если значение <1 или >3; 1 балл — все остальные случаи);
- соотношение 260/230 (1 балл, если значение >1,8; 0 баллов — все остальные случаи);
- коэффициент k (2 балла, если значение >2,8; 0 баллов, если значение <-3,9; 1 балл все остальные случаи).
Результаты классификации представлены в таблице 5.
Таким образом, все исследуемые способы выделения, исходя из количества баллов, можно разделить на три группы:
- высокоэффективные (4-5 балла): Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit (№ 10), ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (№ 13), PrepFiler BTA Forensic dNa Extraction Kit (№ 7), фе-нол-хлороформная экстракция (№ 2);
- наборы, проявившие среднюю эффективность (3 балла): АртДНК (№ 3), «Нуклеосорб» (№ 4), QIAamp DnA Investigator Kit (№ 9), Plant DNA Preparation - Solution Kit (№ 11), MasterPure-Complete DNA & RNA Purification Kit (№ 12);
- низкоэффективные (<2 баллов): LumiPure
Таблица 5
Бальная классификация способов выделения ДНК для молекулярно-генетических
исследований пыльцы растений
№ способа выделения 260/280 Балл 260/230 Балл Коэффициент k Балл Сумма баллов
1 1,92 2 0,40 0 -3,1517 1 3
2 1,88 2 1,14 0 -2,0893 2 4
3 1,36 1 0,83 0 -2,6279 2 3
4 2,28 1 0,04 0 -2,8282 2 3
5 3,30 0 0,96 0 -3,3446 1 1
6 2,98 1 0,56 0 -2,9260 1 2
7 1,99 2 0,93 0 -2,6215 2 4
8 2,05 2 0,93 0 -3,9914 0 2
9 2,34 1 1,03 0 -1,8670 2 3
10 2,11 2 1,95 1 -2,1271 2 5
11 1,99 2 1,44 0 -3,2535 1 3
12 2,15 2 1,39 0 -3,2287 1 3
13 1,80 2 0,53 0 -2,2819 2 4
14 2,29 1 0,52 0 -5,2448 0 1
15 0,76 0 0,29 0 -4,0676 0 0
from AnySample (№ 6), PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (№ 8), GeneJET Plant Genomic DNA Purification Kit (№ 5), выделение с помощью силикагеля (№ 14), Genomic DNA Purification Kit (№ 15).
Заключение
По результатам проделанной работы можно сделать несколько основных выводов:
1. Выбранный способ экстракции оказывает сильное влияние на эффективность выделения ДНК.
2. При необходимости выделить максимально чистый (отношения 260/230 и 260/280 — 1,95 и 2,11 соответственно) образец ДНК из пыльцы с минимальной пробоподготовкой, наилучшим способом выделения будет использование набора Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit.
3. Фенол-хлороформная экстракция позволяет выделить значительное количество ДНК, данный метод продемонстрировал свою эффективность в эксперименте с разведениями ДНК, а также высокие значения концентрации выделенной ДНК при измерении как спектро-
фотометром, так и флуориметром. Таким образом, фенол-хлороформный метод подтвердил свое звание «золотого стандарта» для выделения ДНК. В то же время фенол-хлороформный способ выделения ДНК потребует дополнительного этапа исследования, связанного с поэтапным разведением образцов для успешного проведения ПЦР Основным недостатком при выделении ДНК фенол-хлороформным методом является использование токсичных веществ, применение которых в судебно-экспертных лабораториях стараются при возможности минимизировать.
4. Для молекулярно-генетических исследований пыльцы растений не рекомендуется использовать наборы для выделения ДНК LumiPure from AnySample, PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit, GeneJET Plant Genomic DNA Purification Kit, Genomic DNA Purification Kit, т. к. они показали низкую эффективность при молекулярно-генетических исследований пыльцы растений.
Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского республиканского фон-
да фундаментальных исследований, грант № Б22М-068.
Список использованных источников
1. A DNA Barcoding Approach to Characterize Pollen Collected by Honeybees / A. Galimberti [et al.] // PLoS ONE. - 2014. - Vol. 9, № 10. -P. e109363.
2. A DNA barcoding approach to identify plant species in multiflower honey / I. Bruni [et al.] // Food Chemi stry. - 2015. - Vol. 170 - P. 308-315.
3. Applying Pollen DNA Metabarcoding to the Study of Plant-Pollinator Interactions / K. L. Bell [et al.] // Applications in Plant Sciences. - 2017.
- Vol. 5, № 6. - P. 1600124.
4. Detection of airborne genetically modified maize pollen by real-time PCR / S. Folloni [et al.] // Molecular Ecology Resources. - 2012.
- Vol. 12, № 5. - P. 810-821.
5. Review and future prospects for DNA barcoding methods in forensic palynology / K. L. Bell [et al.] // Forensic Science International: Genetics. - 2016. - Vol. 21 - P. 110-116.
6. Pollen DNA barcoding: current applications and future prospects / K. L. Bell [et al.] //Genome.
- 2016. - Vol. 59. - P. 629-640. - DOI: 10.1139/ gen-2015-02002016
7. Evaluating multiplexed next-generation sequencing as a method in palynology for mixed pollen samples / A. Keller [et al.] // Plant Biol J.
- 2015. - Vol. 17, № 2. - P. 558-566.
8. Using DNA Metabarcoding to Identify the Floral Composition of Honey: A New Tool for Investigating Honey Bee Foraging Preferences
/ J. Hawkins [et al.] // PLoS ONE. - 2015. -Vol. 10, № 8. - P. e0134735. - DOI:10.1371/ journal.pone.0134735
9. Valentini, A. DNA Barcoding for Honey Biodiversity / A. Valentini, C. Miquel, P. Taberlet // Diversity. - 2010. - Vol. 2, № 4. - P. 610-617.
10. Efficient and sensitive identification and quantification of airborne pollen using next-generation DNA sequencing / K. Kraaijeveld [et al.] // Mol Ecol Resour. - 2015. - Vol. 15, № 1.
- P. 8-16.
11. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom [et al.] // Journal of Clinical Microbiology. - 1990. -Vol. 28, № 3. - P. 495-503.
12. Molecular aspects of Anthocyanin fruit tomato in relation to high pigment-1 / M. Sapir [et al.] // J Hered. - 2008. - Vol. 99, № 3. -P. 292-303. - DOI: 10.1093/jhered/esm128
13. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers / G. Koetsier, E. Cantor // New England Biolabs Technical Note.
- 2019. - Vol. 7. - P. 1-8.
14. Балановский, О. П. Методы измерения концентрации ДНК: совпадение относительных величин и различия абсолютных / О. П. Балановский, Ж. А. Кагазежева, М. В. Олькова // ВЕСТНИК РГМУ - 2019, № 3. - С. 27-33.
15. Carr, A. C. Robust quantification of polymerase chain reactions using global fitting / A. C. Carr, S. D. Moore // PLoS ONE. - 2012. -Vol. 7, № 5. - P. e37640.
A. N. Viarchuk1,2, A. V. Kilchevskiy1
TESTING OF COMMERCIAL KITS AND DNA ISOLATION METHODS FOR MOLECULAR GENETIC STUDIES OF PLANT POLLEN
'State Scientific Institution
“Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus”
27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: a.n.verchuk@mail.ru 2State Institution
“Scientific and Practical Center of the State Forensic Examination Committee of the Republic of Belarus” 25 Filimonova St., 220114 Minsk, the Republic of Belarus
The effectiveness of some commercial kits and the classical methods of nucleic acid isolation for obtaining high-quality DNA samples isolated from plant pollen was evaluated. Based on the evaluation results of the qualitative and quantitative parameters of DNA samples using spectrophotometry, fluorimetry and real-time PCR, conclusions were drawn about the effectiveness of using commercial kits and classical methods for DNA isolation from plant pollen. A comparative analysis of the results obtained for different plant species allows us to conclude about the effectiveness of a particular commercial set and the principle of isolation depending on the species of pollen grains. The high efficiency of the classical method of phenol-chloroform extraction and some commercial kits (Machery-Nagel NucleoSpin Food Kit, QIAamp DNA Investigator Kit, ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System) for DNA extraction from plant pollen was established.
Keywords: pollen DNA, DNA isolation, real-time PCR, palynology, forensic examination.
Дата поступления в редакцию: 30 января 2024 г.
