CC BY
159
УДК 581.143.6:631.436
О. А. Рожанская, Л. И. Инишева, Н. С. Строева, Т. В. Шилова
ТЕСТИРОВАНИЕ IN VITRO РЕГУЛЯТОРНОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО СТИМУЛЯТОРА РОСТА ИЗ ТОРФА
Протестирована биологическая активность препарата TTC, полученного из торфа. Показано значительное ускорение развития in vitro побегов и корней люцерны (Medicago varia). Определены эффективные концентрации (0.5-1 мл/л) для использования TTC в качестве стимулятора микроклонального размножения в биотехнологии люцерны.
Ключевые слова: стимулятор роста, торф, биологическая активность, культура тканей, микроклоналъное размножение, люцерна, Medicago varia.
Торф является практически неограниченным источником дешевого сырья для производства высокоэффективных удобрений, стимуляторов роста и лекарственных средств [1—3]. Новый биостимулятор ТТС произведен в лаборатории агроэкологии ТГПУ из низинного торфа. Он представляет собой водный раствор высокомолекулярных веществ с концентрацией ГК 0.0875 %. Структурные особенности препарата представлены в виде спектральных коэффициентов (ОН/С=С - 0.87; С=О/С=С - 0.97; Салк/С=С - 0.85; Он/Салк - 1.02; С=О/Салк - 1.14). Количество парамагнитных центров 3.1-1016 спин/г
Для определения биологической активности новых препаратов используется культура растительных тканей. Методы дифференцированного тестирования in vitro разрабатываются биотехнологами Сибирского НИИ кормов и Института биологических проблем криолитозоны [4, 5]. Перспективным тест-объектом для определения характера регуляторной активности являются стеблевые узлы люцерны (Medicago varia Mart.). Включая изучаемые препараты в состав питательной среды и заменяя ими стандартные фитогормоны, по направлению и скорости морфогенеза можно убедиться в наличии или отсутствии биологической активности.
Цель исследования - тестирование in vitro регуляторной активности препарата ТТС и определение эффективных доз для использования в биотехнологии.
Методика
Экспланты стеблевых узлов растений-регенеран-тов люцерны пассировали для развития и укоренения на среды с минеральной основой Г амборга В5 [6] половинной концентрации ( 12 В5). В контрольном варианте отсутствовали фитогормоны, в экспериментальные среды перед автоклавированием добавляли изучаемый препарат в дозах от 0.5 до 5 мл/л. Опыты имели 3 повторности во времени, объем выборки в каждом варианте составлял 20-30 эксплантов. В качестве тест-функций использовали показатели морфогенеза: частоту образования морфогенных структур (побегов, корней, каллусов), количество их и размеры. Различия средних оценивали с помощью критерия Фишера или непараметрических критериев статистики.
Результаты исследований
В опытах по микроклональному размножению люцерны выявилось сильное стимулирующее действие TTC в дозе 0.5 мл/л: частота побегообразования и ризогенеза увеличилась на 20 %, значительно ускорился рост побегов и корней (рисунок). Под действием TTC в дозе 1 мл/л заметно возрастали высота побегов и длина корней, число листьев и корней. Доза 5 мл/л в первые недели культивирования быша менее эффективной, а в дальнейшем ингибировала развитие растений. Доза 10 мл/л с самого начала сильно %
□ 0.5 мл/л DD1 мл/л В 5 мл/л ■ 10 мл/л
Эффективность влияния разных доз TTC на развитие побегов из стеблевых узлов люцерны in vitro, % к контролю (среда 1/2 В5, контроль - без гормонов)
угнетала рост побегов и особенно корней снижала частоту ризогенеза.
Таким образом, экспериментально установлена эффективность препарата TTC в дозе 0.5-1 мл/л в качестве стимулятора микроклонального размножения люцерны.
Для тестирования ауксиновой активности TTC в специальном опыте проведено сравнительное изучение влияния препарата в дозе 1 мл/л и ауксинов ИУК (3-индолилуксусной кислоты) и НУ К (1-нафтилук-
О. А. Рожанская, Л. И. Инишева, Н. С. Строева, Т. В. Шилова. Тестирование in vitro.
Влияние TTC и ауксинов на морфогенез в культуре стеблевых узлов люцерны in vitro
Показатель морфогенеза 1/2 В5 без гормонов (контроль) 1/2 В5+ ТТС 1 мл/л 1/2 В5+ ИУК 1 мг/л 1/2 В5+ НУК 1 мг/л
Период инкубации, дней 30 73 30 73 30 73 30 73
Частота побегообразования, % 100 100 100 100 85 100 100 100
Число побегов на эксплант 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.2
Высота побега, мм 31 86 34 105* 30 85 25* 58*
Число листьев на побег 4.2 9.2 4.1 9.0 4.3 9.2 3.1* 6.6*
Частота ризогенеза, % 20 75 25 95* 10* 95* 0* 15*
Число корней на эксплант 2.5 2.7 1.4* 2.5 3.5* 2.5 0.0* 4.0*
Длина корня, мм 1.6 3.2 3.9* 2.9 0.5* 1.7* 0.0 1.6*
Частота каллусогенеза, % 0 0 0 0 90* 90* 55* 95*
* Разница средних арифметических с контролем достоверна на 5% -м уровне.
сусной кислоты) в дозах 1 мг/л на морфогенез люцерны при микроклональном размножении (таблица).
На безгормональной среде (контроль) и на средах с добавками TTC и ИУК стеблевые почки люцерны сформировали по 1 побегу, и только на среде с НУК возникали адвентивные почки. Добавка в среду TTC увеличила частоту ризогенеза и высоту побегов на 20 %, причем листья на них были крупнее, чем в других вариантах. Оба ауксина угнетали рост и развитие побегов, и особенно - ризогенез в первый месяц инкубации, но индуцировали образование каллусов в базальной части эксплантов. Добавка НУК обеспечила особенно активную пролиферацию каллусной ткани и наибольший ингибирующий эффект в отношении корнеобразования.
Результаты экспериментов говорят о высокой биологической активности препарата TTC. В дозах 0,5 и 1 мл/л он стимулировал рост побегов и корней в процессе микроклонального размножения люцерны, при повышении концентрации до 5 и 10 мл/л эффект стимуляции постепенно снижался и сменялся ингибированием.
Анализируя характер морфогенетических ответов люцерны на регуляторную активность TTC в сравнении с ауксинами, можно квалифицировать изучаемый препарат как эффективный стимулятор роста дифференцированных тканей побегов и корней, лишенный способности индуцировать дедифференцировку (кал-лусообразование).
Работа поддержана грантом РФФИ (09-0500235) и Госконтрактом (02.740.11.0325).
Список литературы
1. Инишева Л. И. Рациональное использование торфяных ресурсов России как фактор устойчивого развития // Мат-ды междунар. науч.-практ. конф. 12—15 марта 2003 г. Томск, 2003. С. 27—41.
2. Горовая А. И., Орлов Д. С. Гуминовые вещества. Киев: Наукова думка, 1995. 303 с.
3. Юдина Н.В. и др. Оценка биологической активности гуминовых кислот торфов // Химия твердого топлива. 1996. № 5. С. 31-34.
4. Рожанская О. А., Королев К. Г., Юдина Н. В. и др. Биотехнологическое тестирование регуляторной активности продуктов механохими-ческой обработки торфа и древесных отходов // Докл. Россельхозакадемии. 2008. № 3. С. 16-19.
5. Рожанская О. А., Дарханова В. Г., Строева Н. С и др.. Применение нанобиокомпозитов для стимуляции роста растений in vitro / Мат-лы II Междунар. форума по нанотехнологиям (М., 6-8 окт. 2009 г.). URL: http://rusnanotech09.rusnanoforum.ru/Post.aspx/Show/23686
6. Gamborg O. L. et al. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cell // Exp. Cell Res. 1968. Vol. 50. P. 151-158.
Рожанская О. А., доктор биологических наук, зав. лабораторией. Сибирский научно-исследовательский институт кормов СО РАСХН
Пос. Краснообск, Новосибирская область, Россия, 630501.
E-mail: olgarozhanska@yandex.ru
Инишева Л. И., доктор сельскохозяйственных наук, чл.-корр. РАСХН, зав. лабораторией. Томский государственный педагогический университет.
Ул. Киевская, 60, г. Томск, Томская область, Россия, 634061.
E-mail: inisheva@mail.ru
Строева Н. С., ст. научный сотрудник.
Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН.
Пр. Ленина, 41, г. Якутск, Республика Саха (Якутия), Россия, 667980.
Шилова Т. В., ст. научный сотрудник.
Сибирский научно-исследовательский институт кормов СО РАСХН.
Пос. Краснообск, Новосибирская область, Россия, 630501.
Материал поступил в редакцию 04.01.2010
O. A. Rozhanskaya, L. I. Inisheva, N. S. Stroeva, T. V. Shilova IN VITRO TESTING BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE NEW GROWTH STIMULATOR OBTAINED FROM PEAT
There has been tested the biological activity of growth stimulator TTS, obtained from peat. The considerable acceleration of alfalfa (Medicago varia) stalks and roots development in vitro has been shown. The effective concentrations (0.5-1 ml/l) have been determined for using TTS as microclonal propagation stimulator in alfalfa biotechnology.
Key words: growth stimulator, peat, biological activity, tissue culture, microclonal propagation, alfalfa, Medicago varia.
Rozhanskaya O. A.
Siberian Research Institute of Fodder Crops, Russian Academy of Agricultural Sciences, Siberian Branch.
Krasnoobsk, Novosibirskaya oblast, Russia, 630501.
E-mail: olgarozhanska@yandex.ru
Inisheva L. I.
Tomsk State Pedagogical University.
Ul. Kievskaya, 60, Tomsk, Tomskaya oblast, Russia, 634050.
E-mail: inisheva@mail.ru
Stroeva N. S.
Institute of Biological Problems of Cryolitozone SB RAS.
Pr. Lenina, 41, Yakutsk, Russia, 667980.
Shilova T. V.
Siberian Research Institute of Fodder Crops, Russian Academy of Agricultural Sciences, Siberian Branch.
Krasnoobsk, Novosibirskaya oblast, Russia, 630501.
