CC BY
98
© Р.Ф. Еникеев, М.Г. Гордиев, М.С. Моммаева, 2012 УДК 616.24-006.6+575.224.22
ТЕСТИРОВАНИЕ EGFR-МУТАЦИЙ ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО. СОБСТВЕННЫЙ ОПЫТ
р.Ф. Еникеев, М.Г. Гордиев, М.с. Моммаева
EGFR MUTATION TESTiNG iN LUNG CANCER. OUR EXPERiENCE
R.F. Enikeyev, M.G.Gordiev, M.S. Mommayeva
ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ», Казань Приволжский филиал РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Казань
Реферат. Активизирующие мутации в гене EGFR, кодирующий рецептор эпидермального фактора роста, определяют чувствительность к препаратам, блокирующим тирозинкиназу, таких как гефетиниб и эрлотиниб, у пациентов с немел-коклеточным раком легкого. Подобное тестирование является необходимым для выбора тактики лечения. В статье мы рассматриваем собственный опыт в диагностике мутационного статуса гена EGFR. Ключевые слова: мутации, ген EGFR, тестирование.
Abstract. Activating mutations in the gene encoding epidermal growth factor receptor (EGFR) can confer sensitivity to EGFR tyrosine kinase inhibitors such as gefitinib and erlotinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer. Testing for mutations in EGFR is therefore an important step in the treatment-decision pathway. We reviewed our experience for EGFR mutation testing in patients with lung cancer, initially focusing on studies involving standard tumour tissue samples. Key words: mutation, gene EGFR, testing.
Рак легкого — одна из наиболее распространенных форм злокачественных онкологических заболеваний. В России заболевают раком легкого около 55 тыс. человек ежегодно. Так как начальные стадии этого заболевания протекают бессимптомно, на момент диагностики более 65% больных уже имеют распространенный опухолевый процесс, а трети больным диагноз ставится лишь на IV стадии болезни. Значительная часть пациентов с первично выявленным раком легкого остаются без специфического лечения. Это связано с поздним выявлением опухолевого процесса и соответственно со сниженными ресурсами организма больного. Поэтому проведение химиотерапии становится невозможным или крайне затруднительным, учитывая спектр ее осложнений. Как следствие, отмечается высокая летальность при раке легкого. Ежегодно в России от рака легкого погибают около 60 тыс. человек, что составляет 20% от всех умерших от злокачественных заболеваний.
Идентификация и расшифровка механизма действия рецептора эпидермального фактора роста опухоли (EGFR — Epidermal Growth Factor Receptor) стала одним из многообещающих открытий в онкологии.
EGFR — трансмембранный рецептор, активирующийся при связывании с эпидермальным фактором роста EGF.
За последние несколько лет изучение рецептора эпидермального фактора роста стало одним из актуальных аспектов современной онкологии. Установлено, что высокая частота гиперэкспрессии EGFR характерна для немелкоклеточного рака легкого (40—70%), рака яичников (35—70%), толстой кишки (25—77%) и др. Известно, что выявление повышенной экспрессии EGFR является фактором неблагоприятного прогноза течения болезни. Активация механизмов с участием EGFR приводит к усилению пролифератив-ной активности опухолевых клеток, неоангиогенезу, замедлению апоптоза, более раннему появлению метастазов.
Разработаны две стратегии блокады EGFR — терапия моноклональными антителами (цетуксимаб, панитумумаб) или ингибирование тирозинкиназы (гефитиниб, эрлотиниб).
Было показано, что активирующие мутации в экзонах с 18 по 21 гена EGFR коррелируют с наибольшей вероятностью с положительным ответом на терапию ингибиторами тирозинкиназы, но не
на моноклональные антитела. Статус EGFR у пациента может быть определен множеством способов, таких как иммуногистохимия и анализ FISH, но наиболее информативным методом является молеку-лярно-генетическое определение мутаций в гене EGFR.
Соматические мутации в гене EGFR
Большинство соматических мутаций гена EGFR, обнаруживаемых у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), локализованы в экзонах 18—21, кодирующих тирозинкиназный домен. Открытие этих мутаций немедленно связали с положительным ответом на терапию гефитинибом и эрлотинибом.
Наиболее частыми являются делеции в экзоне 19 (45% от всех мутаций), за ними следует нуклео-тидная замена Г на G в положении 2573 экзона 21, что приводит к аминокислотной замене лейцина на аргинин в положении 858 аминокислотной последовательности (L858R, 41%), на вставки в экзоне 20 и нуклеотидные замены в экзонах 18 и 20 приходится 14% мутаций. Данные мутации встречаются у 10% больных НМРЛ европеоидного происхождения и у 50% азиатов.
Следует отметить, что существуют мутации, ассоциированные с устойчивостью опухоли к терапии ингибиторами тирозинкиназы (например, T790M). Рано или поздно почти у всех пациентов, получающих данную терапию, развивается устойчивость к препарату и в половине случаев обнаруживается мутация T790M, которая до терапии присутствует только лишь в очень малом количестве клеток опухоли. Вероятно, что эта мутация (и ряд других) отвечает за резистентность опухоли к ингибиторам тирозинкиназы, но на данный момент не накоплено достаточно данных, чтобы однозначно утверждать, что обнаружение этой мутации у пациента однозначно приведет к выраженной устойчивости к терапии.
Таким образом, для персонализированного подхода к выбору терапии абсолютно необходимо моле-кулярно-генетическое тестирование статуса мутаций, имеющих практическую значимость; это, в первую очередь, делеции экзона 19 и мутации L858R и L861Q, определяющие около 90% спектра мутаций тирозинкиназного домена гена EGFR.
На рис. 1 представлена схема рецептора EGFR и положения основных мутаций.
материал и методы
Изучение мутаций в генах EGFR проводили в молекулярно-диагностической лаборатории РКОД МЗ РТ на архивном формалинфиксированном материале. ДНК из формалинфиксированной ткани выделяли с помощью наборов для выделения ДНК производства ООО «Тест-Ген».
Для детекции ДНК использовались смеси прайме-ров и зондов для мутаций L858R, L861Q и делеций гена EGFR. Использовались праймеры производства ООО «Тест-Ген». В работе использовали различные концентрации положительных плазмидных контролей. Амплификацию проводили на термоцик-лере «RotorGene» (Qiagen) в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис^О; pH 8,8; 16,6 мМ сульфат аммония; 0,01% Твин-20; 2 мМ хлорид магния; 200 нМ каждого dNTP; 100—1000 нМ праймеров; 50—500 нМ зондов; 1,0 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95°а2 мин — 1-й цикл; 94°а10 с, 60°а90 с — 40 циклов.
В табл. 1 представлены характеристики прайме-ров.
На рис. 2 представлен график накопления флуоресценции при отсутствии мутации L858R гена EGFR.
На рис. 3 представлен график накопления флуоресценции при наличии мутации L858R гена EGFR.
На рис. 4 представлена делеция в экзоне 19.
Экзон I 18 Г 19 120 1 21 I 221 23 I 24
рис 1. Схема рецептора EGFR и положения основных мутаций
поволжский
ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ
ВЕСТНИК 4'2012
Таблица 1. Характеристики праймеров ПЦР к экзонам 18—21 гена EGFR
Ген Мутация dbSNP Праймеры и зонды
EGFR Leu858Arg rs121434568 EGFR-858-SA2: FAM-ACCGCGGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACCGCGGT(BHQ1)-HEG-
L858R ss256302281 GCACCCAGCAGTTTGGCTC
CTG/CGG EGFR-858-SA1: VIC-ACCGCGGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACCGCGGT(BHQ2)-HEG-GCACCCAGCAGTTTGGCTA
Leu861Gln rs121913444 EGFR-861-SA2: FAM-ACCGCGGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACCGCGGT(BHQ1)-HEG-
L861Q ss275515311 gattttgggctggccaaact
CTG/CAG EGFR-861-SA1: VIC-ACCGCGGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACCGCGGT(BHQ2)-HEG-gattttgggctggccaaaca
E746-A750del — EGFR-del-F, GTAACATCCACCCAGATC EGFR-del-R, CAAAGCAGAAACTCACAT
Delta Rn vs Cycle
28006-005
2 400e*005 -----------------------
2 000e*005 -----------------------
1.600e*005 ------------------------
С Cd
ГО 1200e*005 ------------------------
"ф
О
8.000e*004 -------------------------
4.0006*004 -----------------------
0.0006*000 - - -- -- = = --
-4.0006*004 I—I---1—I--1—I-1—I—I-1 I I I I I I I I I--l__l--l__l-!__l__l-1 I I I I I I I-l__L
1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Cycle Number
Selected Detector All Well(s): A1
Document 20 01 2012-60 sds (Standard Curve)
Рис. 2. График накопления флуоресценции при отсутствии мутации L858R гена EGFR. Краситель FAM (зеленая кривая) — сигнал мутации, краситель VIC (желтая кривая) — сигнал нормы
Delta Rn vs Cycle
6 000e*005
50008*005
3 0006*005
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Cycle Number
Selected Detector All Well(s): C1
Document 20 01 2012-60 sds (Standard Curve)
Рис. 3. График накопления флуоресценции при наличии мутации L858R гена EGFR. Краситель FAM (зеленая кривая) — сигнал мутации, краситель VIC (желтая кривая) — сигнал нормы
рис. 4. Делеция в экзоне 19. Справа налево — 4 лунки с ДНК без делеции, две последние — с делецией в экзоне 19
Клиническая часть исследования результатов лечения НмрЛ
Все пациенты с НМРЛ получали лечение в период с 2010 по 2012 г. на базе Республиканского клинического онкологического диспансера Министерства здравоохранения Республики Татарстан.
Анализ на наличие мутации EGFR проведен у 150 пациентов с диагнозом НМРЛ, из них только у 40 (26,6%) выявлены мутации. Результаты распределения больных по частоте обнаружения мутации EGFR среди наших пациентов соответствуют данным других авторов по России. Распределение по полу и возрасту представлено в табл. 2.
Таблица 2. Распределение больных НМРЛ по полу и возрастным группам
Возраст, лет 31 —40 41 —50 51 —60 61 —70 71 —80 Всего
Пол м ж м ж м ж м ж м ж м ж
Кол-во чел. 1 3 2 6 2 9 2 12 1 2 8 32
у женщин встречалась чаще [32 (75/%)], чем у мужчин [8 (25%)], что составило 4:1.
В нашем исследовании все пациенты с НМРЛ с мутацией EGFR имели гистологический диагноз опухоли — аденокарциному.
Из 40 положительных пациентов делеция в экзоне 19 гена EGFR наблюдалась у 28 (65%) больных, мутация в экзоне 21 гена EGFR наблюдалась у 12 (35%) пациентов, что соответствует мировому распределению.
Из 40 пациентов с мутацией EGFR только один пациент был курильщиком.
В соответствии с классификацией TNM [Международный противораковый союз (2002 г., 6-е изд.)] распределение больных НМРЛ с мутацией EGFR представлено в табл. 3.
Таблица 3. Распределение больных НМРЛ по классификации TNM
Стадия !а !Ь !!а !!Ь !!!а !!!Ь | N
Количество больных 4 9 5 6 2 5 9
Возраст пациентов колебался от 37 до 72 лет (средний возраст — 63,3 года). Мутации в гене EGFR
Таким образом, большинство пациентов с диагнозом НМРЛ имели стадию !Ь или IV стадию (45%).
Тактика лечения пациентов с IV стадией НМРЛ выбиралась индивидуально. Учитывая, что у пятерых пациентов состояние не позволяло начать лечебную химиотерапию, решено было начать с таргентной терапии. Двум пациентам проведена химиотерапия по стандартной схеме (этопозин+цисплатин), на фоне чего состояние ухудшилось, по данным обследования отмечено прогрессирование процесса, решено было начать таргентную терапию. Все больные с IV стадией, получающие таргентную терапию гефетинибом, переносили ее без побочных эффектов.
Больным с I—IIa стадиями НМРЛ выполнялась радикальная операция в объеме лобэктомии с дальнейшим наблюдением. Пациентам с IIb—III b стадиями на первом этапе выполнялась радикальная операции с последующей адъювантной ПХТ. При прогрессирова-нии процесса во время или после ПХТ всех пациентов с НМРЛ и наличием EGFR переводили на таргентную терапию гефетинибом.
Выводы
Разработан и внедрен в клиническую практику метод диагностики мутаций в гене EGFR в экзонах 19 и 21 на основе Real-Time ПЦР.
Мутации гена EGFR, выявленные в экзонах 19 и 21, встречаются исключительно у больных адено-карциномой легкого независимо от пола. Делеции экзоны 19 обнаружены в 65%, а точечные замены Leu858Arg — в 35% аденокарцином легкого.
Мутации EGFR являются маркером эффективности терапии НМРЛ тирозинкиназными ингибиторами — гефитинибом и эрлотинибом.
Исследование мутаций EGFR у пациентов с НМРЛ на запущенных стадиях позволяет проводить таргентную терапию у ослабленных больных, а также при неэффективности стандартных схем.
Использование генных мутаций позволяет выбрать оптимальную схему лечения на основании анализа чувствительности опухоли к препаратам.
Литература
1. Нидюлин, В.А. Об эпидемиологии рака легких / В.А. Ни-дюлин, Б.В. Эрдниева // Медицинский вестник Башкортостана. — 2009. — Vol. 4, № 1. — P. 66—71.
2. Salomon, D.S. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies / D.S. Salomon [et al.] // Critical Reviews in Oncology/Hematology. — 1995. — Vol. 19, № 3. — P. 183—232.
3. Olayioye, M.A. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer / M.A. Olayioye [et al.] // EMBO J. — 2000. — Vol. 19, № 13. — P. 3159—3167.
4. Hanahan, D. The Hallmarks of Cancer / D. Hanahan, R.A. Weinberg // Cell. — 2000. — Vol. 100, № 1. — P. 57— 70.
5. Hirsch, F. Combination of EGFR gene copy number and protein expression predicts outcome for advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib / F. Hirsch [et al.] // Annals of Oncology. — 2007. — Vol. 18, № 4. — P. 752—760.
6. Cappuzzo, F. Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer / F. Cappuzzo [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. — 2005. — Vol. 97, № 9. — P. 643—655.
7. Parra, H.S. Analysis of epidermal growth factor receptor expression as a predictive factor for response to gefitinib ('Iressa', ZD1839) in non-small-cell lung cancer / H.S. Parra [et al.] // Br. J. Cancer. — 2004. — Vol. 91, № 2. — P. 208— 212.
8. Mok, T.S. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma / T.S. Mok [et al.] // N. Engl. J. Med. — 2009. — Vol. 361, № 10. — P. 947—957.
9. Khambata-Ford, S. Analysis of potential predictive markers of cetuximab benefit in BMS099, a phase III study of cetuximab and first-line taxane/carboplatin in advanced non-small-cell lung cancer / S. Khambata-Ford [et al.] // J. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 28, № 6. — P. 918—927.
10. Thatcher, N. Gefitinib plus best supportive care in previously treated patients with refractory advanced non-small-cell lung cancer: results from a randomised, placebo-controlled, multicentre study (Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer) / N. Thatcher [et al.] // Lancet. — 2005. — Vol. 366, № 9496. — P. 1527—1537.
11. Shepherd, F.A. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer / F.A. Shepherd [et al.] // N. Engl. J. Med. — 2005. — Vol. 353, № 2. — P. 123—132.
12. Takeda, K. Randomized phase III trial of platinum-doublet chemotherapy followed by gefitinib compared with continued platinum-doublet chemotherapy in Japanese patients with advanced non-small-cell lung cancer: results of a west Japan thoracic oncology group trial (WJTOG0203) / K. Takeda [et al.] // J. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 28, № 5. — P. 753—760.
13. Pallis, A.G. Biomarkers of clinical benefit for anti-epidermal growth factor receptor agents in patients with non-small-cell lung cancer / A.G. Pallis [et al.] // Br. J. Cancer. — 2011. — Vol. 105, № 1. — P. 1—8.
14. Zhu, C.-Q. Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinib in National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group Study BR.21 / C.-Q. Zhu [et al.] // J. Clin. Oncol. — 2008. — Vol. 26, № 26. — P. 4268—4275.
15. Tsao, M.-S. Erlotinib in lung cancer — molecular and clinical predictors of outcome / M.-S. Tsao [et al.] // N. Engl. J. Med. — 2005. — Vol. 353, № 2. — P. 133—144.
16. Gazdar, A.F. Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors / A.F. Gazdar // Oncogene. — 2009. — Vol. 28, suppl 1. — P. S24—S31.
поволжский
ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК
17. Douillard, J.-Y. Molecular predictors of outcome with gefitinib and docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer: data from the randomized phase III INTEREST trial / J.-Y. Douillard [et al.] // J. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 28, № 5. — P. 744—752.
18. Sharma, S.V. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer / S.V. Sharma [et al.] // Nat. Rev. Cancer. — 2007. — Vol. 7, № 3. — P. 169—181.
19. Lynch, T.J. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib / T.J. Lynch [et al.] // N. Engl. J. Med. — 2004. — Vol. 350, № 21. — P. 2129— 2139.
20. Paez, J.G. EGFR Mutations in Lung Cancer: Correlation with Clinical Response to Gefitinib Therapy / J.G. Paez [et al.] // Science. — 2004. — Vol. 304, № 5676. — P. 1497—1500.
21. Pao, W. Acquired Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib Is Associated with a Second Mutation in the EGFR Kinase Domain / W. Pao [et al.] // PLoS Med. — 2005. — Vol. 2, № 3. — P. e73.
22. иванов, В.и. Геномика — медицине / В.И. Иванов; под ред. В.И. Иванова, Л.Л. Киселева. — М.: Академкнига, 2005. — 392 с.
23. Lee, L.G. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes / L.G. Lee, C.R. Connell, W. Bloch // Nucleic Acids Res. — 1993. — Vol. 21, № 16. — P. 3761—3766.
