ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ТТV В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

УДК 577.213.3:57.087 doi:10.25298/2616-5546-2024-8-1-36-41

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ТТV

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

В. М. Семенов, С. К. Егоров, И. А. Лятос, Т. И. Дмитраченко, А. А. Марченко, М. С. Косова, С. К. Зенькова, К. А. Савочкина

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Витебск, Беларусь

Введение. Исследование биологического материала на наличие ДНК TTV методом ПЦР позволяет своевременно оценить функциональное состояние печени и иммунной системы человека.

Цель исследования - создание компонентов для проведения ПЦР в режиме реального времени для обнаружения ДНК TTV в биологическом материале.

Материал и методы. Проведены конструирование и подбор оптимальных праймеров и зондов с учетом размера (длины) ампликона, температуры отжига, нуклеотидного состава, распределения нуклеотидов по длине праймера, длины праймеров; возможности образования праймерами шпилек и димеров определяли с помощью программ Primer-BLAST/Primer3, FastPCR. Поскольку праймеры, даже абсолютно уникальные для тех или иных последовательностей ДНК, могли отжигаться и на неспецифичных участках, не относящихся к анализируемому гену, нами выполнялась проверка соответствия праймеров последовательностям целевого гена. С этой целью использовали online сервис NCBI Primer BLAST и оценивали локальное попарное выравнивание каждого из праймеров со всеми нуклеотидными последовательностями баз данных Refseq.

Результаты. В результате проведенных исследований по подбору оптимальной температуры отжига праймеров, концентраций праймеров, а также подбору оптимальной пары нуклеотидов были определены основные параметры сконструированных праймеров.

Выводы. Создан набор для обнаружения и количественной оценки ДНК TTVметодом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, который стал основой для разработки коммерческой тест-системы. Ключевые слова: ДНК TTV, ПЦР, праймеры.

REAL-TIME PCR TEST SYSTEM FOR TTV DNA DETECTION IN BIOLOGICAL MATERIAL

V. M. Semenov, S. K. Yahorau, I. A. Lyatos, T. I. Dmitrachenko, A. A. Marchenko, M. S. Kosova, S. K. Zenkova, K. A. Savochkina

Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, Vitebsk, Belarus

Background. The study of biological material for the presence of TTV DNA using the PCR method allows for a timely assessment of the functional state of the human liver and immune system.

Objective. To develop components for real-time PCR for TTV DNA detection in biological material. Material and methods. The design and selection of optimal primers and probes (taking into account the size (length) of the amplicon, annealing temperature, nucleotide composition, distribution of nucleotides along the length of the primer, length of primers, the possibility of formation of hairpins and dimers by primers) were performed using the Primer-BLAST/Primer3, FastPCR programs. Since primers, even absolutely unique for certain DNA sequences, could anneal at nonspecific sites, not related to the gene analyzed, we checked the correspondence of the primers to the sequences of the target gene. For this purpose, we used the NCBI Primer BLAST online service and assessed the local pairwise alignment of each primer with all nucleotide sequences of the Refseq databases.

Results. As the result of studies carried out on the selection of the optimal primer annealing temperature, primer concentrations, as well as the selection of the optimal nucleotide pair, the main parameters of the designed primers were determined.

Conclusions. A kit for the detection and quantification of TTV DNA using the polymerase chain reaction method with hybridization-fluorescent detection in real time was created and became the basis for the development of a commercial test system.

Keywords: TTV DNA, PCR, primers.

Автор, ответственный за переписку Corresponding author:

Лятос Игорь Александрович, канд. мед. наук, доц., Lyatos Igor A., PhD (Medicine), Associate Professor, Vitebsk

Витебский государственный ордена Дружбы народов меди- state Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail:

цинский университет, e-mail: [email protected] ia|[email protected]

®

Для цитирования: Для цитирования: Тест-система для проведения ПЦР в режиме реального времени для обнаружения ДНК ТТУ в биологическом материале / В. М. Семенов, С. К. Егоров, И. А. Лятос, Т. И. Дмитраченко, А. А. Марченко, М. С. Косова, С. К. Зенькова, К. А. Савочкина // Гепатология и гастроэнтерология. 2024. Т. 8, № 1. С. 36-.41. https://doi. огд/10.25298/2616-5546-2024-8-1-36-41.

Введение

Torque teno virus (TTV) впервые был выделен в 1997 г. группой японских ученых при исследовании сывороток крови пациентов с посттрансфузион-ным гепатитом, не имеющих маркеров известных парентеральных гепатитов, первоначально изучался как возможное дополнение к списку вирусов, их вызывающих. Однако гипотеза о том, что TTV может быть важной причиной криптогенного гепатита, не получила четкого подтверждения, хотя возможность TTV вызывать поражение печени при определенных обстоятельствах не исключена. Вскоре после открытия вируса стало очевидно, что TTV часто встречается как у здоровых, так и у больных людей [1].

Геном TTV представляет собой ковалентно замкнутую одноцепочечную кольцевую ДНК размером от 3,5 до 3,8 кб, имеющую ряд особенностей, характерных для цирковирусов животных. Вирусная частица TTV имеет диаметр от 30 до 32 нм, при этом лишена внешней липидной оболочки, что обеспечивает устойчивость вируса к инактивации химическими и физическими агентами [1, 2].

Для TTV характерен высокий уровень разнообразия нуклеотидных последовательностей. Чрезвычайно высокая степень полиморфизма ДНК служит основанием для разделения изолятов TTV на большое количество генотипов или видов. Разные генотипы TTV формируют пять отдельных филогенетических групп (G1-G5), разница в их нукле-отидной последовательности составляет более 40%. Вирусы, имеющие менее значимые различия в нуклеотидных последовательностях (11-30%), относят к генотипам, число которых в настоящее время насчитывает более 30, а по отдельным данным - более 50. Число генотипов постоянно увеличивается с внедрением новых молекулярно-ге-нетических методов, обладающих все большей чувствительностью [3, 4].

Отдельные генотипы TTV заметно различаются по распространению [5, 6]. Существуют ли между генотипами биологические или патогенные различия, неизвестно. Однако есть предположение, что разные генетические варианты различаются и антигенно. Кроме того, имеющаяся генетическая гетерогенность TTV ограничивает чувствительность многих используемых для выявления вируса ПЦР-методов. Кодирующая область генома TTV содержит не менее четырех открытых рамок считывания (ORF), одна из которых включает три гипервариабельных участка.

For citation: Semenov VM, Yahorau SK, Lyatos IA, Dmitrachenko TI, Marchenko AA, Kosova MS, Zenkova SK, Savochkina KA. Real-time PCR test system for detecting TTV DNA in biological material. Hepatology and Gastroenterology. 2024;8(1):36-41. https://doi.org/10.25298/2616-5546-2024-8-1-36-41.

Нетранслируемая область (UTR) не различается у разных генотипов вируса и представляет собой мишень для ПЦР детекции. Подобно другим вирусам с кольцевым геномом, репликация ТТУ осуществляется по катящемуся кругу и сопровождается лизисом инфицированных клеток [3].

Пока точно не установлено, в каких клетках происходит репликация ТТУ, хотя известно, что основной источник ТТУ в периферической крови - Т-лимфоциты. Помимо клеток крови, ТТУ, как предполагается, может быть обнаружен практически во всех тканях и жидкостях и, вероятно, является пантропным. Подтверждением тому служит обнаружение ДНК ТТУ с достаточно высокой вирусной нагрузкой в грудном молоке, респираторном секрете, слюне, однако полный спектр клеток, поддерживающих репликацию ТТУ в организме, неизвестен [3, 7].

Точное понимание того, как и насколько иммунитет модулирует репликацию ТТУ, чрезвычайно важно для использования ПЦР-монито-ринга ТТУ-виремии в качестве способа оценки иммунной функции. ПЦР на ТТУ успешно используется в ретроспективных и проспективных исследованиях, в настоящее время проводится ее стандартизация [8].

При интерпретации результатов ПЦР исследований, часто противоречивых, следует проявлять определенную осторожность, поскольку многие из этих исследований проводились с использованием разных ПЦР-анализов, дающих более высокий или более низкий предел обнаружения. Официального стандарта для калибровки количественных тестов пока не существует, а до недавнего времени не было и оценки качества коммерческих тест-систем. В результате чаще всего исследователи вынуждены разрабатывать собственные тесты для обнаружения и количественного определения вируса, обладающие разной чувствительностью. Ввиду огромного ге-нотипического разнообразия ТТУ и разной чувствительности ПЦР-тестов, применяемых для выявления вируса, исследования, посвященные определению вирусной нагрузки, трудно сравнивать. Разработка надежного коммерческого ПЦР-теста для обнаружения ТТУ в будущем значительно упростит сравнение результатов исследований, посвященных изучению частоты циркуляции вируса, вирусной нагрузки у разных групп населения и его персистенции в разных органах и тканях пациентов. Важно учитывать и тот факт, что некоторыми исследователями показано, что у лиц, несущих больше геногрупп

TTV, вирусная нагрузка в целом выше. Несмотря на возможность того, что как высокоположительные, так и отрицательные TTV-нагрузки не всегда представляют собой иммунологический контроль, в многочисленных исследованиях показана тесная связь между высокой TTV-нагрузкой и риском инфицирования реципиента солидных органов, а также связь между низкой TTV-нагрузкой и риском отторжения аллографта. Определяемая высокая и низкая нагрузка TTV, оказалось, зависит от используемого метода, типа трансплантации органов и периода наблюдения. Однако почти все исследования по данной тематике проводились с использованием своего собственного теста, при этом показано, что корреляция между низким уровнем TTV и отторжением сильнее, чем корреляция между высоким уровнем TTV и риском инфицирования [3, 9, 10].

Цель исследования - создание компонентов для проведения ПЦР с гибридизационно-флуо-ресцентной детекцией в режиме реального времени для обнаружения ДНК TTV в биологическом материале.

Материал и методы

Работа выполнялась на базе лаборатории молекулярно-генетических и биотехнологических исследований кафедры инфекционных болезней с курсом ФПК и ПК учреждения образования «Витебский государственный медицинский университет».

Конструирование и подбор оптимальных праймеров и зондов с учетом размера (длины) ампликона, температуры отжига, нуклеотидного состава, распределения нуклеотидов по длине праймера, длины праймеров, возможности образования праймерами шпилек и димеров выполняли с помощью программ Primer-BLAST/ Primer3, FastPCR. Поскольку праймеры, даже абсолютно уникальные для тех или иных последовательностей ДНК, могли отжигаться и на неспецифичных участках, не относящихся к анализируемому гену, нами выполнялась проверка соответствия праймеров последовательностям целевого гена. Для этого использовали online сервис NCBI Primer BLAST и оценивали локальное попарное выравнивание каждого из праймеров со всеми нуклеотидными последовательностями баз данных Refseq [11].

Были отобраны четыре группы прайме-ров-кандидатов (табл. 1).

Синтезированы несколько наборов прайме-ров, из которых в процессе подбора условий, температур и концентраций были выбраны оптимальные пары для использования и мультиплексирования между собой.

Следующие этапы работы: подбор оптимальной температуры отжига праймеров, концентраций праймеров, а также подбор оптимальной пары нуклеотидов из отобранных (рис. 1-5).

Таблица 1. - Праймеры для амплификации консервативных участков TTV

Table 1. - Primers for amplification of conserved regions of TTV

Последовательность

F: 5'- CAAGGGGCAATTCGGGCTC-3'

R 5'- ACTNCGGTGTGTAAACTCACCT-3'

F: 5'- GTGCCGIAGGTGAGTTTA-3'

R 5'- AGCCCGGCCAGTCC-3'

F: 5'- GTGCCGRAGGTGAGTTTA-3'

R 5'- AGCCCGGCCAGTCC-3'

F: 5'- GTTTTCTACGCCCGTCC-3'

R 5'- CCTTGACTCCGGTGTGTAA-3'

Рисунок 1. - Подбор и оптимизация температуры отжига праймеров

Figure 1. - Selection and optimization of primer annealing temperature

Рисунок 2. - Серийные разведения положительных образцов и оценка реакции

Figure 2. - Serial dilutions of positive samples and reaction assessment

Рисунок 3. - Оценка диапазона, эффективности и чувствительности реакции

Figure 3. - Evaluation of response range, efficiency and sensitivity

Amplification

О 10 20 30 40

Cycles

Рисунок 4. - Графики сигнала при амплификации клинических образцов

Figure 4. - Signal graphs during amplification of clinical samples

Amplification

2500 -

2000 -

g 1500 О.

1000 -500 -

0 10 20 30 40

Cycles

Рисунок 5.-Подбори оптимизацияконцентрациипраймеров Figure 5. - Selection and optimization of primer concentrations

Для контроля протекания реакции амплификации и этапа выделения ДНК нами также использовались контрольные образцы положительного, внутреннего и отрицательного контроля.

Учитывая то, что задачей исследования было создание методики, позволяющей не только обнаруживать ДНК TTV в биологическом образце, но и ее количественное измерение, в ходе разра-

ботки нами дополнительно проводились исследования по чувствительности, воспроизводимости результатов, а также вычислению предела обнаружения (ПО) (минимального количества) копий генетического материала в образце, которое может быть обнаружено, но необязательно точно количественно определено. В качестве положительных диагностикумов использовались плазмиды с количеством фрагмента ДНК 5 копий/мл, 50 копий/мл, 500 копий/мл, 5000 копий/ мл, 50000 копий/мл, 500000 копий/мл.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований по подбору оптимальной температуры отжига прай-меров, концентраций праймеров, а также подбору оптимальной пары нуклеотидов определены основные параметры сконструированных прай-меров (табл. 2).

Специфичность выбранных олигонуклеотидов анализировали, применяя программу nucleotide Blast NCBI. Результаты реакции амплификации приведены в табл. 3 и на рис. 6.

Amplification

О 10 20 30 40

Cycles

Рисунок 6. - Серийные разведения положительных образцов. Оценка диапазона, эффективности и чувствительности реакции

Figure 6. - Serial dilutions of positive samples. Evaluation of response range, efficiency, and sensitivity

Таблица 2. - Основные параметры сконструированных праймеров для детекции TTV Table 2. - Main parameters of designed primers for TTV detection

Прямой праймер Обратный праймер Флуоресцентный зонд

Длина Tm GC% Длина Tm GC% Длина Tm GC%

18 61,6 55,6 14 61,9 78,6 19 65,9 57,9

Таблица 3. - Результаты реакции амплификации Table 3. - Results of the amplification reaction

Образец Копий/мл Ct Результат

1 500 000 20,62 положительный

2 50 000 27,21 положительный

3 5 000 30,31 положительный

4 500 34,31 положительный

5 50 36,01 положительный

6 5 - отрицательный

Таблица 4. - Уровни ДНК (копий/мл) TTV в плазме крови у здоровых лиц

Table 4.- TTV DNA (copies/ml) levels in blood plasma of healthy individuals

Показатель Доноры (n=100) Здоровые лица женского пола (n=43) Здоровые лица мужского пола (n=57)

Частота выявления ДНК TTV (абс/%) 83 (83%) 36 (83,7%) 47 (82,4%)

М 1377 1264 1463

ДИ 95% 757; 1997 349; 2179 823; 2103

Предел обнаружения ДНК ТТУ в образце составляет не менее 50 копий/мл.

С целью оценки эффективности разработанного нами метода обнаружения ДНК ТТУ был проведен анализ качественного и количественного определения ДНК ТТУ у 100 здоровых лиц в возрасте от 18 до 60 лет. Среди включенных в исследование 58 были лицами мужского пола, женщины составили 42% из 100 обследованных. Как показал проведенный анализ, ДНК ТТУ определялась у 83% здоровых лиц. Средний уровень вирусной нагрузки (М) составил 1568 копий/мл (ДИ 95%; 707....2429 копий/мл) (табл. 4). При этом не обнаружено отмеченных в некоторых литературных источниках [8, 12] достоверных различий в уровнях вирусной нагрузки у здоровых лиц в зависимости от пола (р>0,05), хотя вирусная нагрузка у мужчин была несколько выше.

Выводы

В результате проведенной работы созданы компоненты для выявления и количественного определения ДНК ТТУ в биоматериале человека. По итогам оценки диагностической и аналитической чувствительности созданного набора установлено, что он обладает высокой специфичностью и чувствительностью, благодаря чему может быть применен для идентификации и определения количества ДНК ТТУ при изучении роли вируса в патогенезе болезней человека, в определении его роли как маркера иммунодефицит-ных состояний.

Созданный набор для обнаружения и количественной оценки ДНК ТТУ методом ПЦР с гибри-дизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени стал основой для разработки коммерческой тест-системы.

Referenсes

1. Bisceglie AMD. TT virus and other anelloviruses [Internet]. UpToDate. 2023. Available from: https://www.uptodate. com/contents/tt-virus-and-other-anelloviruses/print

2. Family - Anelloviridae. In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ editors. Virus Taxonomy. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier; 2012. p. 331-341. doi: https://doi. org/10.1016/B978-0-12-384684-6.00033-1.

3. Gore EJ, Gard L, Niesters HGM, Van Leer Buter CC. Understanding torquetenovirus (TTV) as an immune marker. Front Med (Lausanne). 2023;10:1168400. doi: 10.3389/ fmed.2023.1168400.

4. Sarairah H, Bdour S, Gharaibeh W. The Molecular Epidemiology and Phylogeny of Torque Teno Virus (TTV) in Jordan. Viruses. 2020;12(2):165. doi: 10.3390/v12020165.

5. Pachot A, Venet F, Monneret G, Lepape A, Rimmele T, Tan LK, Brengel-Pesce K, Textoris J. Herpes DNAemia and TTV Viraemia in Intensive Care Unit Critically Ill Patients: A Single-Centre Prospective Longitudinal Study. Front Immunol. 2021;12:698808. doi: 10.3389/ fimmu.2021.698808.

6. Maev IV, Karlovich TI, Burmistrov AI, Chekmazov IA, Andreev DN, Reshetnyak VI. Sovremennye predstavleni-ja o roli Torque Teno Virus (TTV) pri zabolevanijah pech-eni [Current Views of Torque Teno Virus (TTV) in Liver Diseases]. Rossijskijzhurnal gastrojenterologii, gepatologii, koloproktologii [Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology, Coloproctology]. 2020;30(4):7-22. doi: 10.22416/1382-4376-2020-30-4-7-22. edn: OVAWZN. (Russian).

7. Focosi D, Antonelli G, Pistello M, Maggi F. Torquetenovirus: the human virome from bench to bedside. Clin Microbiol Infect. 2016;22(7):589-93. doi: 10.1016/j.cmi.2016.04.007.

8. Reshetnyak VI, Maev IV, Burmistrov AI, Chekmazov IA, Karlovich TI. Torque teno virus in liver diseases: On the way towards unity of view. World J Gastroenterol. 2020;26(15):1691-1707. doi: 10.3748/wjg.v26.i15.1691.

9. Kulifaj D, Durgueil-Lariviere B, Meynier F, Munteanu E, Pichon N, Dube M, Joannes M, Essig M, Hantz S, Barranger C, Alain S. Development of a standardized real time PCR for Torque teno viruses (TTV) viral load detection and quantification: A new tool for immune monitoring. J Clin Virol. 2018;105:118-127. doi: 10.1016/j.jcv.2018.06.010.

10. Maggi F, Focosi D, Statzu M, Bianco G, Costa C, Macera L, Spezia PG, Medici C, Albert E, Navarro D, Scagnolari C, Pistello M, Cavallo R, Antonelli G. Early Post-Transplant Torquetenovirus Viremia Predicts Cytomegalovirus Reactivations In Solid Organ Transplant Recipients. Sci Rep. 2018;8(1):15490. doi: 10.1038/s41598-018-33909-7.

11. Sievers F, Wilm A, Dineen D, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Soding J, Thompson JD, Higgins DG. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 2011;7:539. doi: 10.1038/msb.2011.75.

12. Focosi D, Macera L, Pistello M, Maggi F. Torque Teno virus viremia correlates with intensity of maintenance immunosuppression in adult orthotopic liver transplant. J InfectDis. 2014;210(4):667-8. doi: 10.1093/infdis/jiu209.

Вклад авторов. Семенов В. М., Егоров С. К., Лятос И. А., Дмитраченко Т. И., Косова М. С., Зенькова С. К.: концепция и дизайн исследования, разработка компонентов для тест-системы, получение экспериментальных данных, статистическая обработка данных, редактирование, обсуждение данных; Марченко А. А., Савочкина К. А.: обзор публикаций по теме, сбор материала для клинического испытания тест-системы.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена в рамках ГПНИ «Трансляционная медицина», госрегистрация № 20220336.

Соответствие принципам этики. Исследование одобрено локальным этическим комитетом. Сведения об авторах:

Семенов Валерий Михайлович, д-р мед. наук, проф., Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-7029-9226

Егоров Сергей Константинович, канд. мед. наук, доц., Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail:[email protected], ORCID: 0000-0001-7352-9368

Лятос Игорь Александрович, канд. мед. наук, доц., Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail: [email protected], ORCID: 0009-0008-9011-2028

Дмитраченко Татьяна Ивановна, д-р мед. наук, проф., Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-5537-3459

Марченко Арина Анатольевна, Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail:[email protected], ORCID: 0009-0006-6871-6808 Косова Марина Сергеевна, Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail:[email protected], ORCID: 0000-0001-6180-6700

Зенькова Светлана Константиновна, канд. мед. наук, доц., Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-7446-2684

Савочкина Ксения Алексеевна, Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, e-mail:[email protected], ORCID:0009-0008-7080-2849

Author contributions. V. Semenov, S. Yahorau, I. Lyatos, T. Dmitrachenko, M. Kosova, S. Zenkova: concept and design of the study, development of components for the test system, obtaining experimental data, statistical data processing, editing, discussion of data; A. Marchenko, K. Savochkina, A.Kashtanov: review of publications on the topic, collection of material for clinical testing of the test system.

Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest. Financing. The work was carried out within the framework of the State Research Institute "Translational Medicine", state registration No. 20220336.

Conformity with the principles of ethics. The study was approved by the local ethics committee. Information about authors:

Semenov Valery M., PhD, MD (Medicine), Professor, Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-7029-9226

Yahorau Sergey K., PhD (Medicine), Associate Professor, Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail:[email protected], ORCID: 0000-0001-7352-9368

Lyatos Igor A., PhD (Medicine), Associate Professor, Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail: [email protected], ORCID: 0009-0008-9011-2028

Dmitrachenko Tatiana I., PhD, MD (Medicine), Professor, Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-5537-3459

Marchenko Arina A., Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail:[email protected], ORCID: 0009-0006-6871-6808

Kosova Marina S., Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail:[email protected], ORCID: 0000-0001-6180-6700

Zenkova Svetlana K., PhD (Medicine), Associate Professor, Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-7446-2684

Savochkina Ksenia A., Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, e-mail:[email protected], ORCID:0009-0008-7080-2849

Поступила: 14.04.2024 Принята к печати: 23.04.2024

Received: 14.04.2024 Accepted: 23.04.2024