CC BY
22
УДК 535.8.225:543.432
ТЕРМОЛИНЗОВОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОХРОМА C И ЕГО КОМПЛЕКСА С NO
А.В. Брусничкин, А.В. Марикуца, М.А. Проскурнин, Е.В. Проскурнина*, А.Н. Осипов**, Ю.А. Владимиров*
(кафедра аналитической химии; e-mail: Michael@analyt.chem.msu.ru)
Спектрофотометрические и термолинзовые измерения показали, что непрерывное лазерное излучение (450-530 нм, до 100 мВт) не оказывает воздействия на характеристики поглощения цитохрома c и термолинзовая спектрометрия использована для определения как цитох-рома c (III) (смин = 110 7 М при X = 488,0 нм; смин = 3108 М при X = 514,5 нм), так и его активной формы, цитохрома с (II) (смин = 1-10"8 М при X = 514,5 нм). Выигрыш в чувствительности по сравнению со спектрофотометрическим определением этих форм цитохрома с составляет более двух порядков. Подобраны оптимальные условия получения комплекса цитохрома с с NO для его фотометрического определения: молярное соотношение додецил-сульфат (модифицирующий агент): цитохром с составляет 1:30, полоса поглощения при 560 нм. Воздействие лазерного излучения на нитрозильный комплекс цитохрома с показало, что он диссоциирует с образованием цитохрома с (III), при этом возможно проводить мониторинг разрушения этого комплекса при помощи термолинзовой спектрометрии (514,5 нм) до уровня 1-10" М.
В последнее десятилетие активно исследуется проблема апоптоза — запрограммированной смерти клетки, который является одной из главных причин гибели клеток при самых различных заболеваниях [1]. Центральную роль в индукции апоптоза играет цитохром с [2-8]. Известно, что при запуске апоптоза цитохром с выходит из митохондрий во внутриклеточное пространство, но механизм этого выхода остается неясным. Сейчас предполагается, что ключевую роль в этом играет пероксидазная активность цито-хрома с [1, 2]. Исследование процесса выхода цитохрома с из митохондрий является важным для выяснения механизма развития апоптоза и изучения действия соответствующих лекарственных средств. В результате простое и экспрессное определение цито-хрома с (как его общего количества, так и активных форм) является практически важным для медицинских и биологических целей.
К важнейшим физиологическим регуляторам относится монооксид азота (N0). Особый интерес представляет взаимодействие N0 с геминовыми белками, в частности и с цитохромом с [9] с образованием нитрозильных комплексов. Вследствие такого взаимо-
действия происходит изменение пероксидазнои активности цитохрома c [10], что можно использовать для регуляции апоптоза.
Цель настоящей работы - подбор условий определения форм цитохрома c и его нитрозильного комплекса методами молекулярной спектроскопии, в качестве которых выбраны спектрофотомерия как базовый метод и термолинзовая спектрометрия как лазерный метод молекулярной абсорбционной спектроскопии, обеспечивающий высокую чувствительность определения различных веществ [11, 12].
Экспериментальная часть
Аппаратура. На базе ранее существующей установки термолинзового спектрометра [13] создана установка для термолинзовых измерений биологических образцов. Термолинза индуцировалась в кювете (длина оптического пути 1 см) излучением аргонового ионного лазера "Innova 90-6" ("Coherent", США, ТЕМ00-мода, с Xe = 488,0 и 514,5 нм). В качестве зондирующего лазера использовали He-Ne-лазер "SP-106-1" ("Spectra Physics", США) с Хр = 632,8 нм (ТЕМ00-мода, 10 мВт). Параметры прибора представ-
* Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, Ломоносовский просп., д. 31, корп. 5, ГСП-1 119991 Москва.
** Российский государственный медицинский университет, ул. Островитянова 1, 117513 Москва,
Т а б л и ц а 1
Параметры конфигурации двулучевого термолинзового спектрометра с одноканальной системой
регистрации сигнала
Длина волны Хе, нм 514,5 488,0
Конфокальное расстояние 2се (мм) 6,4 6,7
Индуцирующий лазер Диапазон мощности в ячейке (мВт) 1-50 1-50
Радиус поперечного сечения луча лазера в перетяжке <в0е (мкм) 55±5
Фокусное расстояние фокусирующей линзы/е (мм) 300
Длина волны Хр (нм) 632,8
Фокусное расстояние фокусирующей линзы/р (мм) 185
Зондирующий лазер Конфокальное расстояние 2ср (мм) Мощность лазера в ячейке Рр (мВт) Радиус поперечного сечения луча лазера в перетяжке <в0р (мкм) 3,1 3 25,0
Длина оптического пути 1 (мм) 10,0
Параметры оптической схемы Расстояние между ячейкой и детектором, см Геометрический параметр, В 180 0,72
Частота прерывателя ф, Гц 0,5-4
лены в табл. 1. Установка позволяет перестраивать геометрию оптической схемы и изменять мощность индуцирующего излучения в интервале 1-200 мВт, а времени облучения - от 0,01 до 10 с. Для спектро-фотометрических измерений использовали сканирующий спектрофотометр "БЫшайт" иУ1240-т1т (Япония) с кварцевыми кюветами (длина оптического пути 1 см).
Обработка результатов. Термолинзовые измерения представляют собой последовательность циклов включения-выключения индуцирующего лазера (формирования-диссипации термолинзы). В результате можно получить серию сигналов 0 [12]:
Пересчет сигнала 0 в оптическую плотность проводят по уравнению
A = ■
0
2,303E0 Pe
(2)
где Ре - мощность лазерного излучения с длиной волны Хе, индуцирующего термолинзу [12], Е0 - фактор чувствительности термолинзовых измерений (увеличение чувствительности по сравнению со спектрофото-мерией для мощности индуцирующего излучения 1 мВт),
dnj dT
E 0 = - ~Тк7
(3)
0 =
1-
^ выкл ^ вкл
+1
(1)
где /выкл и /вкл - интенсивность в центре зондирующего луча в отсутствие термолинзы и при полностью развившейся термолинзе соответственно, а В —геометрический параметр.
где ёп/ёТ - температурный градиент показателя преломления, к - коэффициент теплопроводности среды, X — длина волны излучения, зондирующего термо-
p
линзу.
Реагенты и растворители. В работе использовали цитохром c из сердца лошади 99% ("Sigma", США, M = 12383) для биохимических исследований;
додецилсульфат натрия (ДДС) (99%, "Е1ика", М = 288,4); №Н2Р04-2Н20 ("ч.д.а.", "Химмед"); №0Н (водный раствор, "ч.д.а."); 1 М КС1 ("ч.д.а.", "Химмед"); аскорбиновая кислота ("х.ч.");
Растворы цитохрома с (1 ммоль/л) и додецилсуль-фата натрия готовили растворением навески препарата в дистиллированной воде. Фосфатный буферный раствор рН 7,4 с концентрацией 20 ммоль/л готовили растворением навески N^^0,^-2^0 в дистиллированной воде. Необходимое значение рН 7,4 доводили при помощи №0Н, контролируя кислотность при помощи рН-метра. Для создания ионной силы использовали 1 М раствор КС1. Все готовые растворы хранили в темном месте при 4°С. Аскорбиновую кислоту использовали для приготовления аскорбата, необходимого для восстановления цитохрома с. В 100 мл воды растворяли 5 мг аскорбиновой кислоты и проводили титрование раствором №0Н (рН 12) до значения рН 7. Полученный раствор аскорбата разбавляли водой (1:5) и использовали для восстановления цитох-рома с.
Получение газообразного монооксида азота. Газообразный N0 получали сухим путем, используя ^02, ^03, Сг203 и Бе203 [14, 15]: 3^02 + КШ3 + Сг203 ^ 2К>Сг04 -2 4Ш (оксид железа(Ш) необходим для спекания образующегося хромата). Полученный N0 пропускали через четыре ловушки с №0Н (20%) для удаления высших оксидов азота, а затем через ловушку-поглотитель (два его отделения содержали 10 М №0Н, а третье - дистиллированную воду) [16]. Кварцевую трубку, заполненную смесью реагентов и аргоном, прокаливали при температуре 300°С до прекращения выделения газа. Полученным газом насыщали дегазированную воду, которую получали путем пропускания тока аргона через дистиллированную воду в течение 15 мин.
Получение нитрозилъных комплексов цитохрома с. Насыщенную N0 воду прибавляли к смеси цитохрома с (III) (710-6 М) с ДДС (0,22 мМ) в присутствии 410-6 М аскорбата в фосфатном буферном растворе (20 мМ, рН 7,4), общий объем смеси 2 мл. Концентрация полученного раствора N0 неизвестна, поэтому выбор соотношения цитохрома с и N0 проводили перед каждым экспериментом.
Восстановление цитохрома с аскорбатом. В 100 мл воды растворяли 9 мг цитохрома с. Отбирали 1,25 мл полученного раствора. В 24 мл воды растворяли 5 мг ДДС. Отбирали 0,4 мл этого раствора. Добавляли 1,25 мл 100 нмоль/л фосфатного буферного раствора. К полученному раствору добавляли
0,2 мл приготовленного раствора аскорбата. Спектры полученных веществ регистрировали на спектрофотометре сразу после приготовления раствора.
Определение нитрозилъного комплекса цитохрома с. Полученные растворы нитрозильного комплекса цитохрома с облучали лазерным излучением (514,5 нм, 40 мВт) в течение 10, 70 или 370 с. В случае термолинзовых измерений непосредственно в эти периоды регистрировали термолинзовый сигнал, в случае спектрофотометрических измерений после указанных промежутков времени регистрировали спектры поглощения облученной смеси.
Результаты и их обсуждение
Изучение действия лазерного излучения на ци-тохром с. Сравнение оптической плотности растворов цитохрома с из спектрофотометрических измерений и расчитанных из термолинзового сигнала при длинах волн генерации термолинзового сигнала показало, что лазерное излучение не оказывает ощутимого влияния на цитохром с (рис. 1). Следовательно, возможно применение более чувствительного, чем спектрофотометрия, метода термолинзовой спектрометрии для исследования как цитохрома с, так и его активных форм.
Метрологические характеристики определения цитохрома с Построены градуировочные зависимости по цитохрому с (III) и цитохрому с (II) для спектрофометрических измерений (в максимумах полос поглощения) и для термолинзовых измерений. Градуировочные зависимости для цитохрома с (III)
Рис. 1. Сравнение спектров поглощения цитохрома с (III) 5,7 мкМ, полученных при помощи спектрофотометрии и термолинзовой спектрометрии. Непрерывная линия - оптическая плотность, полученная при спектрофотометрических измерениях, точки - оптическая плотность, пересчитанная из термолинзового сигнала
Т а б л и ц а 2
Уравнения градуировочных зависимостей и характеристики чувствительности спектрофото-метрического и термолинзового определения цитохрома c
Метод Цитохром c (III) Цитохром c (II)
Спектрофотометрия A530 = (1,1±0,1)c + 1,1x10-2 (n = 12, P = 0,95; r = 0,9989) c™ = 7 x 10-6 М sr (10-5-10-4 М)= 0,02 -0,05 A550 = (1,7±0,2)c + 1,1x10-2 (n = 12, P = 0,95; r = 0,9979) Смин = 2 x 10-6 М sr (10-5-10-4 М)= 0,03-0,05
Термолинзовая спектрометрия (40 мВт) S488 = (0,220 ± 0,002)c + 1,1x10-2 (n = 12, P = 0,95; r = 0,9994) Смин = 1 x 10-7 M sr (10-7-10-6 М) = 0,01-0,04 S514,5 = (0,558±0,003)c + 3,9x10-2 (n = 12, P = 0,95; r = 0,9994) Смин = 1x10-8 M sr (10-8-10-6 М)= 0,02-0,06
95145 = (0,396±0,004)c + 2,2x10-2 (n = 12, P = 0,95; r = 0,9997) СмИн = 3X10-8 M sr (10-8-10-6 М) = 0,02-0,05
Примечание. Для градуировочных зависимостей концентрации приведены в ммоль/л (спектрофото-метрия) и мкмоль/л (термолинзовая спектрометрия).
строили при двух значениях длин волн 488,0 и 514,5 нм, а для цитохрома с (II) — только при 514,5 нм (при 488,0 нм молярный коэффициент поглощения цитохрома с (II) мал). Результаты сведены в табл. 2. Полученные значения пределов обнаружения коррелируют с существующими данными [17]. Воспроизводимость определения цитохрома с на уровне 10 М не ниже, чем воспроизводимость спектрофотометричес-кого определения. Рост чувствительности для обеих форм цитохрома превышает 200 раз, что находится в хорошем согласии с ожидаемым ростом чувствительности термолинзовых измерений.
Получение нитрозильного комплекса цитохрома с (III). Подбор условий получения нитрозильных комплексов цитохрома с включал выбор соотношений ДДС и цитохрома с, а также цитохрома с и N0. ДДС играет роль агента, облегчающего доступ лиган-да к гему [10], найдено, что оптимальное соотношение его и белка лежит в диапазоне 1:30-1:50. Однако поскольку ДДС является ПАВ и склонен к образованию коллоидных растворов, мы выбрали минимальное значение этого соотношения (1:30).
Поскольку белки денатурируют на границе раздела фаз, образование границы фаз, которая возникает при пропускании газа через раствор, нежелательно. Поэтому для получения нитрозильного комплекса цито-хрома с газообразный N0 не пропускали через раствор белка с ДДС, а проводили взаимодействие в
водных растворах, предварительно насыщенных NO. Растворы NO добавляли спустя 5 мин после остальных компонентов. Продукты взаимодействия цитохрома c и NO идентифицировали по изменениям в спектре поглощения по сравнению с тем же количеством раствора всех компонентов, кроме NO. Рост интенсивности поглощения при 560 нм (рис. 2), который свидетельствует о присутствии в растворе NO комплекса цитохрома c [10], наблюдался в диапазоне объемов 100-300 мкл раствора NO, увеличение же объема NO не вызывало дальнейших изменений в спектре поглощения цитохрома c.
Изучение действия лазерного излучения на комплекс цитохрома c с NO. Полученный комплекс подвергали воздействию лазерного излучения. В результате наблюдали достаточно быстрое разложение комплекса цитохрома c с NO под действием лазерного излучения (рис. 3). В течение 10 с наблюдали разложение комплекса (уменьшение пика при 560 нм) и восстановление спектра поглощения цито-хрома c. В отсутствие облучения комплекс сам по себе устойчив и не разлагается с течением времени, поэтому разложение комплекса обусловлено только воздействием на него лазерного излучения. Из рис. 3 видно, что комплекс разлагается до цитохрома c (III), но часть образовавшегося цитохрома c вновь взаимодействует с NO, присутствующим в системе. Термолинзовое определение нитрозильного комплекса
400 500 600
X, нм
Рис. 2. Общий вид спектра поглощения цитохрома с (III) с N0 (1), для сравнения приведен спектр поглощения цитохрома с (III) (2)
А
490 540 590
X, нм
Рис. 3. Разложение комплекса цитохрома с с N0 под действием лазерного излучения: 1 - спектр поглощения комплекса цитохрома с - N0; 2 - спектр поглощения комплекса после воздействия лазерного излучения в течение 10 с; 3 - спектр поглощения нитро-зильного комплекса после воздействия лазерного излучения в течение 70 с; 4 - спектр поглощения нитрозильного комплекса после воздействия лазерного излучения в течение 370 с; 5 - спектр поглощения цитохрома с (III) (приведен для сравнения). Комплекс получен путем смешения 20 мкл 0,89 мМ раствора цитохрома с, 110 мкл 5,5 мМ раствора ДДС, 1470 мкл 20 мМ фосфатного буферного раствора (рН 7,4) и 400 мкл дегазированной воды, насыщенной N0
цитохрома с возможно на уровне концентраций, до с-тигнутом для цитохрома с (II, III), т.е. 10 М, и дает тот же выигрыш в чувствительности по сравнению со спектрофотометрией, что и в случае определения ци-тохрома с (III), т.е. около 200 раз.
В целом подобраны условия спектрофотометричес-кого и термолинзового определения цитохрома с, его активной формы и его нитрозильного комплекса. Показано, что под действием лазерного излучения изменений в спектре поглощения цитохрома с не наблюдается, что позволяет использовать высокочувствительный
метод термолинзовой спектрометрии для определения цитохрома с (II) и цитохрома с (III) на уровне 10-8 моль/л, что недоступно большинству других методов определения цитохрома с. Найденные условия могут быть использованы для изучения ингибирования и реактивации пероксидазной активности цитохрома с под действием NO [10] при помощи термолинзовой спектрометрии, что выходило за рамки данной работы. Кроме того, регулируемая и контролируемая лазером фотодиссоциация комплекса цитохрома с c NO может найти применение в лазерной терапии.
Работа осуществлена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 06-04-81052-Бел-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Владимиров Ю.А. // Биологические мембраны. 2002. 19. № 5. С . 356.
2. Iverson S.L., Orrenius S. // Arch. Biochem. Biophys. 2004. 423. P. 37.
3. Tuominen E.K.J., Wallace C.J.A., Kinnunen P.K.J. // J. Biol. Chem. 2002. 277. N 11. P. 8822.
4. Nishimura G., Proske R.J., Doyama H., Higuchi M. // FEBS Lett. 2001. 505. P. 399.
5. OttM., Robertson J.D., Gogvadze V., Zhivotovsky B., Orrenius S. // PNAS. 2002. 99. N 3. P. 1259.
6. Skulachev V.P. // Free Radic. Biol. Med. 2000. 29. N 15. P. 1056.
7. Chandra J., Samali A., Orrenius S. // Free Radic. Biol. Med. 2000. 29. N 3/4. P. 323.
8. Ramachandran A., Levonen A.-L., Brookes P.S., Ceaser E., Shiva S., Barone M.C., Darley-Usmar V. // Free Radic. Biol. Med. 2002. 33. N 11. P. 1465.
9. Stone J.R., Sands R.H., Dunham W.R., Marietta M.A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 207. P. 572.
10. Осипов A.H., Степанов Г.О., Владимиров Ю.А., Козлов А.В., Каган В.Е. // Биохимия. 2006. 71. № 10. С. 1392.
11. Жаров В.П., Летохов В.С. Лазерная оптико-акустическая спектроскопия. М., 1984.
12. Bialkowski S.E. Photothermal spectroscopy methods for chemical analysis. N. Y.; Wiley, 1996.
13. Проскурнин M.A., Аброскин А.Г., Радушкевич Д.Ю. // ЖАХ. 1999. 54. № 1. С. 101.
14. Руководство по неорганическому синтезу / Под ред. Г. Брауэра Т. 2. М., 1985.
15. Ray J.D., OggR.A. // J. Am. Chem. Soc. 1956. 78. P. 5993.
16. MoirJ.W.B. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. 1430. P. 65.
17. Tamaki E., Sato K., Tokeshi M., Sato K., Aihara M., Kitamo-ri T. // Anal. Chem. 2002. 74. N 7. P. 1560.
Поступила в редакцию 14.04.08
THERMAL-LENS DETERMINATION OF CYTOCHROME C AND ITS NO COMPLEX
A.V. Brusnichkin, A.V. Marikutsa, M.A. Proskurnin, E.V. Proskurnina, A.N. Osipov, Yu.A. Vladimirov
(Division of Analytical Chemistry)
Spectrophotometric and thermal-lens measurements showed that cw laser irradiation (450-530 nm, up to 100 mW) does not affect the apsorption band of cytochrome c, and thermal lensing is used for determining cytochrome c (III) (cmin = 1 • 107 M at X = 488.0 nm; cmin = 3 • 108 M at X = 514.5 nm) and its active form, cytochrome c (II) (cmin = 1 10"8 M at X = 514.5 nm). The enhancement in the sensitivity of determination of these species compared to conventional spectrophotometry is more than two orders. The optimum conditions for the formation of NO complex of cytochrome c for its photometric determination are selected: the molar ratio of dodecylsulfate (a modifying agent) to cytochrome c is 1: 30, the working wavelength of 560 nm. The study of the effect of laser radiation on nitroso-complex of cytochrome c showed that it dissociates forming cytochrome c (III), and the monitoring of the decomposition of this complex with thermal-lensing (514.5 nm) is possible at a level down to !• 10-7 M.
