CC BY
39
УДК 57.043:636.08
ТЕРМИЧЕСКОЕ РАСШИРЕНИЕ ВОДЫ КАК ФАКТОР КРИОГЕННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ СПЕРМАТОЗОИДОВ
В.П. КОНОНОВ, доктор биологических наук, главный научный сотрудник
В.А. БАГИРОВ, член-корреспондент РАСХН, заведующий лабораторией
Б.С. ИОЛЧИЕВ, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
П.М. КЛЕНОВИЦКИЙ, доктор биологических наук, главный научный сотрудник
Ш.Н. НАСИБОВ, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
ВНИИ животноводства Россельхозакадемии E-mail: vugarbagirov@mail.ru
Резюме. Установлено, что увеличение объёма воды (льда) при охлаждении ниже +4°С может быть одним из факторов, повреждающих сперматозоиды при замораживании семени. При этом структуры сперматозоидов с разным содержанием несвязанной воды, например акросома и постакросомальная часть головки, в разной степени увеличиваются в объёме, что приводит к взаимному их смещению и разрушению. Степень защитного действия неэлектролитных криоротекторов зависит от энергии связывания воды ими, что уменьшает содержание свободной воды в семени.
Ключевые слова: сперматозоид, криопротективная среда, акросома, криогенное повреждение.
Главный повреждающий сперматозоиды фактор при замораживании и оттаивании семени - кристаллизация льда [1...5]. Причем мелкоструктурная кристаллизация распространяется на внутриклеточное пространство и действует крайне разрушительно. Для защиты от этого поражающего фактора необходимо, чтобы вода замерзала в виде крупных кристаллов, отнимая свободные молекулы от гидратированных структур сперматозоидов, концентрируя во внутриклеточном пространстве растворённые вещества до уровня, после которого происходит витрификация - некристаллическое стекловидное затвердевание воды. Сперматозоиды при этом располагаются в каналах между кристаллами льда в витрификационной фазе [5].
Однако, на наш взгляд, разрушения может вызывать и увеличение объёма воды в состоянии как жидкой, так и твёрдой фазы при охлаждении после +4 оС.
Для проверки этой гипотезы мы подвергли дилатометрическим исследованиям цельное семя хряков, плазму, цельные сперматозоиды и отдельные их структуры (акросома и оставшаяся безакросомная часть головки). Эти структуры сперматозоидов были выбраны для исследования в связи с тем, что, во-первых, они различаются по степени гидратации, во-вторых, акросома - сильнее всего подвержена повреждениям и наиболее важна для полноценности сперматозоидов [6].
Условия, материалы и методы. Отделение акро-сом от сперматозоидов было проведено с помощью детергента FCF-737, облучения ультразвуком (100 кГц, 10 вт/см2, 10 мин) и последующего дифференциального центрифугирования (1000 д 10 мин) в 18 %-ном растворе раффинозы. Степень увеличения объема структур сперматозоидов и растворов криопротективных компонентов сред для замораживания семени изучали с помощью простого устройства, импровизированного дилатометра (рис. 1). Устройство представляет собой капиллярную стеклянную трубочку со стандартными внутренним и наружным диаметрами (1 и 6 мм) длиной
90.100 мм и две пенопластовые коробки, используемые в качестве термостатов. Коробку А заполняли жидким азотом для создания температурных условий -196°С. В коробку Б помещали тающий лёд, над которым на специальной площадке, поднятой на 10 см, температура составляла +4°С.
Рис. 1. Устройство для дилатометрии исследуемых объектов: 1 - стеклянная, капиллярная трубочка; 2 - столбик исследуемого материала; 3 - стальные мандрены; 4 - жидкий азот; 5 - тающий лёд (Н2О); 6 - пенопластовые коробки.
Этапы анализа: А - охлаждение объекта до -196 °С; Б -нагрев до +4 °С. Длина столбика анализируемого образца: Ьі - при -196 °С, L2 - при +4°С
В капилляр трубочки вводили исследуемый материал - сконцентрированные центрифугированием цельные сперматозоиды, отдельные их структуры (акросомы или безакросомные головки) или жидкости (цельное семя, растворы неэлектролитов, используемых как криопротективные средства). В качестве контроля использовали воду и 1 %-ный раствор хлористого натрия. Капилляр заполняли испытуемым материалом в виде непрерывного столбика длиной не менее 20 мм. С обоих концов в канал трубочки вводили стальные мандрены, концы которых до охлаждения в жидком азоте не соприкасались со столбиком исследуемого материала. Трубочку опускали в коробку А с жидким азотом, выдерживали до прекращения кипения (выравнивания температуры трубочки и жидкого азота), после чего мандрены вдвигали в канал до упора с затвердевшим содержимым. После этого трубочку переносили в коробку Б, где выдерживали не менее 2 часов. После полного расплавления содержимого капилляра и прогрева до температуры окружающей среды (+4 °С) штангенциркулем измеряли расстояние между концами мандренов в канале - длина столбика материала в состоянии твердой фазы при -196 °С (Ц), и длину того же столбика, прогретого до жидкой фазы при +4 °С (1_2). Отношение Ц/1_2 показывало, во сколько раз увеличивается объем содержимого капилляра при охлаждении от +4 до -196 °С. Тепловое сжатие трубочек было постоянным во всех измерениях и незначительным, поэтому поправкой на эти изменения пренебрегали.
Для выяснения обусловленности разной способности растворов неэлектролитов к термальному рас__ Достижения науки и техники АПК, №10-2011
ширению измеряли энергию связывания ими воды, которую определяли по количеству воды, испарившейся из изотонических растворов в условиях невысокого вакуума. Для этого использовали лиофилизационную сушилку Эдвардса, снабжённую центрифугой. Испытуемые растворы и воду (эталон) наливали в стандартные градуированные измерительные цилиндры по 10 мл и помещали в вакуумную камеру сушилки, в гнезда центрифуги на одинаковых расстояниях один от другого. Камеру герметизировали и включали вакуумирование. Для идентичного подвода тепла ко всем цилиндрам и барабану центрифуги придавали медленное вращение (50.100 об/мин). Под вакуумом с выключенным рефрижератором образцы выдерживали в течение 8 ч, после чего определяли долю испарившейся воды.
Количество теплоты, затраченной на испарение эталоном, определяли по формуле: Q = q•m, где Q - количество затраченной теплоты на испарение, т - масса испарившейся воды (г), q - коэффициент удельной теплоты парообразования (585 кал/г). Количество теплоты, затраченной на испарение 1 г воды из испытуемых растворов, рассчитывали по уравнению q1= Q/m1, где т1 - масса воды, испарившейся из раствора. В свою очередь, q1 представляет собой сумму составляющих q + q2, то есть теплоты q, затраченной на испарение 1 г воды и теплоты q2,затраченной на преодоление связи воды с растворенным веществом.
Результаты и обсуждение. Мы установили, что акросомы при глубоком охлаждении расширяются в большей степени, чем остальные структуры сперматозоидов (табл. 1). Это указывает на присутствие зна-
Таблица 1. Изменения объемов отдельных объектов при охлаждении от +4 оС до -196 оС_____
Объект Отношение объема исследуемого объекта при -196оС к объему при +4 оС Изменение объёма исследуемого объекта по отношению к изменению объёма воды при охлаждении от +4 до -196°С, %
Семя цельное 1,08+0,003 80
Плазма семени 1,08+0,002 80
Сперматозоиды 1,03+0,006 30
цельные
Сперматозоиды 1,03+0,004 30
без акросом
Акросомы 1,07+0,010 70
1 %-ный раствор 1,09+0,004 90
№0!
Вода 1,1+0,004 100
чительно большего количества не связанной их гидрофильными веществами воды, которая увеличивается в объёме при охлаждении ниже +4 °С [7]. Вероятно, с этой повышенной гидратацией и соответственно с большим объёмным расширением, в сравнении с другими структурами сперматозоида, обусловлено разрушение и даже полное отторжение акросомы при замораживании (рис. 2). Происходит это, прежде всего, потому, что безакросомная часть головки сперматозоида при замораживании увеличивается в меньшей степени, чем акросома. Как следствие, происходит смещение соседствующих структур и потеря морфологической целостности сперматозоида.
Почти во всех технологиях криоконсервации биологических объектов используются уникальные крио-протективные свойства глицерина [8]. Мы установили, что степень увеличение объема водного раствора глицерина при замораживании снижается по мере возрастания концентрации. При концентрации глицерина
Достижения науки и техники АПК, №10-2011 __
Рис. 2. Морфологическое состояние акросом сперматозоидов после замораживания - оттаивания: 1 -нормальная; 2- разрушенная; 3 - набухшая; 4 - потерянная; 5 - потерянные структуры; 6 - акросомы; 7 - головка без акросомы и жгутика.
37,8 % объём раствора остается постоянным на всём интервале температур от +4 до -196°С, а при дальнейшем увеличении концентрации он уменьшается при охлаждении (рис. 3).
1,1
Концентрация глицерина в воде
(объём/объём), %%
Рис. 3. Зависимость изменения объёма глицерина от его концентрации в воде при охлаждении от +4°С до -196°С.
Таким образом, при замораживании глицерин может проникать в наиболее обводненные структуры сперматозоида и тем самым уменьшать их термальное расширение, предотвращая связанные с ним разрушения.
Еще один широко используемый компонент сред, который обладает криопротективным действием,
Лактоза
60. . 65
*7 У \
60^\
/ . / / \
Гпюкоза галактоза
Рис. 4. Действие соотношения различны сахаров в среде на долю сперматозоидов с морфологически неповреждённой акросомой в семени после замораживания-оттаивания, %.
------------------------------------------------- 43
уступающим по эффектив- Таблица 2. Энергия связывания воды сахарами, используемыми в качестве
ности лишь глицерину, - сахара. При этом их защитные свойства возрастают по мере увеличения молекулярной массы [9, 10].
В опытах по определению оптимального соотношения изотонических растворов (0,3 М) отдельных компонентов криопротективных сред, оцениваемого по доле
сперматозоидов с неповреждёнными акросомами, мы установили, что оно сдвинуто в сторону преобладания раствора лактозы (дисахарид) над растворами глюкозы и галактозы (моносахариды). Оптимальное их соотношение (70 % сперматозоидов с неповреждённой акросомой) составляет 3 : 1 : 1 соответственно (рис. 4).
На наш взгляд, одним из объяснений этого явления может быть то, что при одной и той же молярной концентрации (0,3М) по мере увеличения молекулярной массы сахаров степень термального расширения их растворов линейно уменьшается (рис. 5). Это значит, что увеличение размеров молекул растворенного вещества ведет к повышению количества связанной воды, не расширяющейся при замораживании.
Анализ энергии связи с водой у сахаров, наиболее часто используемых в качестве компонентов криопротективных сред, показал сопряженность величины этого показателя и защитного действия на сперматозоиды при замораживании (табл. 2). Так, предложенная [9, 10] криопротективная среда, используемая в большинстве случаев при замораживании семени быков, включает неэлектролиты, обладающие наибольшей энергией связи с водой - лактозу и глицерин.
Суть защитного действия компонентов, отличающихся высокой энергией связи с водой, вероятно, заключается в сдвиге соотношения кристаллического и витрификационного состояний твердой фазы раствора в сторону витрификационного, при котором сперматозоиды меньше подвержены криогенным повреждениям. Это объяснение подтверждает и такой факт, что изомер лактозы сахароза, обладающая значительно меньшим защитным действием [10], отличается
Литература.
1. Багиров В.А., ЭрнстЛ.К., Насибов Ш.Н. Технология криоконсервации семени - метод сохранения и рационального использования разных видов животных//
Ветеринарная патология. - 2008. - № 2. - С. 152-154.
2. Рэ Л. Консервация жизни холодом. - М., 1962. - 176 с.
3. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. - Киев, 1978. - 255 с.
4. Пушкарь Н.С., БелоусА.М., Цветков Ц.Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования. - Киев, 1984. - 261 с.
5. Holt, W.V. Basic aspects of frozen storage of semen.// Anim. Reprod. Sci. - 2000. - vol. 62. - No 1-3. - P. 3-22
6. Pursel V.G., Johnson L.A., Rampacek G.B Acrosome morphology of boar spermatozoa incubated before cold shock. //J. Animal Sci. - 1971. - vol. 33. - n. 1. - p. 265
7. Замятнин А.А. Дилатометрия растворов белков. - М., 1973. - 101 с.
8. Polge C Some experiments on the preservation of boar spermatozoa. //Ann. Zootechn. D. - 1959. - vol. 8. - n. 1. - p. 113-120
9. Nagase, H., Niva T., Deep freezing bull semen in concentrated pellet form: Factors affecting survival spermatozoa //Proc. 5th Int. Congr. Anim. Reprod. AI, Trento. - 1964. - vol. 4. - P. 410-415.
10. Nagase H., Niva T. Protective action of sugars.// Proc. 5th Int. Congr. Anim. Reprod. AI, Trento. - 1964. - vol. 4. - P. 498-502.
THERMAL EXPANSiON OF WATER AS THE FACTOR OF THE CRYOGENiC DAMAGES
OF SPERMATOZOA V.P. Kononov, V.A. Bagirov, B.S. Yolchiev, P.M. Klenovitskyi, Sh.N. Nasibov.
Summary. It ascertained the expansion of water and ice volume at the cooling below +4°C can result a damages of the several spermatozoa structures which content different quantifies of unbound water, especially acrosome and pastacrosomal part of head. The cryoprotective effect of nonelectrolytes in medium depend on binding energy of water with ones It decreases amount unbound water in diluted semen and diminishes expansion value and the crystalloid part of ice.
Key words: germ cell, cryoprotective medium, acrosome, cryogenic injury.
44 ____________________________________________________ Достижения науки и техники АПК, №10-2011
меньшей энергией связи с водой и, соответственно, отдаёт больше свободной воды для образования кристаллов при замораживании, что приводит к большему термальному расширению гидратированных структур сперматозоидов.
1Д
5 1,095
2 1.09
=>9
1.085
I*
5 о. 1,08 ф '
6 I” 1,075 -$ о 1/07 І 1.065
Изотонические (0,33 М) глюкозы лактозы раффинозы
Рис. 5. Расширение изотонических растворов сахаров разной полимерности при охлаждении от +4 °С до -196 °С (глюкоза - моносахарид, лактоза - дисахарид, раффиноза - трисахарид).
Выводы. Полученные результаты определяют эффективные направления решения проблемы увеличения защитных свойств криопротективных сред, в том числе необходимость поиска факторов, повышающих энергию связывания воды с растворёнными веществами и снижающих термальное расширение воды при замораживании.
криопротективных компонентов сред (n = 10)
Раствор* Концен- трация, %% Количество воды, испарившейся из 10 мл раствора, мл Затрачено энергии,кал
на испарение 1 мл воды из раствора на преодоление связи 1 мл воды с растворенным веществом
Глюкозы 6 2,29±0,019 644±7 59±7
Галактозы 6 2,24±0,023 659±8 74±8
Сахарозы 11,5 2,20±0,022 671±11 86±11
Лактозы 11,5 1,89±0,025 781±12 196±12
Глицерина 2,4 2,15±0,02 686±8 101±8
Вода 2,52±0,021 585 -
*в порядке возрастания криопротективного действия
